第六章探针制备与标记技术
第六章探针制备与标记技术
实验一核酸探针的制备
一、原理和用途
核酸探针制备的方法很多，经典的方法包括以重组单链噬菌体为模板的单链DNA 探针的合成，利用体外转录原理进行的单链RNA探针的合成，以mRNA为模板进行的cDNA探针的合成，以及寡核苷酸的人工合成；目前更为常用且简便的是双链DNA探针的制备，其来源包括纯化的限制性酶切片段或PCR产物。本实验以M13噬菌体为模板，学习单链DNA探针合成的基本操作。
单链DNA探针合成的基本原理是将人工合成的寡核苷酸与重组M13噬菌体中的单链DNA退火结合，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（简称Klenow酶）对退火引物的延伸作用，催化与模板链互补的标记探针的合成。由于反应产物长度及放射性标记dNTP结合量的均一性不高，通常需要对反应产物进行限制酶切和琼脂糖凝胶电泳分离，以便获得长度一致的双链DNA探针。
单链DNA探针特别适合用S1核酸酶或绿豆核酸酶进行的mRNA 51端结构分析，真核基因外显子位置的确定，以液体杂交进行的mRNA定量，无载体序列探针的制备，以及基因或cDNA特定区域的显示等。由于M13噬菌体载体的多克隆部位上游多有lac 基因或T7等启动子序列，根据这些序列合成的寡核苷酸可以作为通用引物，用于任何与噬菌体插入片段互补的单链DNA探针的制备。
二、实验材料
单链M13噬菌体DNA。
三、溶液与缓冲液
1．10 mol/L 醋酸钠
2．1 mol/L DTT
3．0.5 mol/L EDTA，pH 8.0
4．5 mol/L NaCl
5．1：1（V/V）苯酚/氯仿混合液
6．10×Klenow酶缓冲液
7．Klenow酶
8．限制性内切酶及其缓冲液
9．20 mmol/L dCTP、dGTP、dTTP混合液
10．5 pmol/μL M13噬菌体通用引物（溶解于pH 7.6的TE缓冲液中）
11．40 μmol/L和20 mmol/L dATP
12．寡核苷酸引物
13．10 mCi/mL [α-32P]dA TP
14．酒精．
四、仪器设备及耗材
DE-81圆形滤纸片，250 mL烧杯，Sephadex G-50离心层析柱，恒温水浴箱，指形管等。
五、实验方法
1．在0.5 mL指形管中加入下列试剂：
单链M13噬菌体DNA 1 μg
寡核苷酸引物 5 pmol
10×Klenow酶缓冲液 3 μL
去离子水至20 μL
2．将指形管在85℃水浴中孵育5 min，缓慢冷却至37℃，使寡核苷酸引物与模板DNA 退火结合，然后再加入下列试剂：
0.1 mol/L DTT 2 μL
10 mCi/mL [α-32P]dA TP 5 μL
40 μmol/L dATP 1 μL
20 mmol/L dTTP、dCTP和dGTP 混合液 1 μL
用指头轻轻弹敲指形管，使所加试剂混合，然后短暂离心，使所有液体集中于管底。3．取0.5 μL混合液，置于装有15 μL 20 mmol/L EDTA的指形管中，置冰浴中备用。
向剩余的反应体系中加入1 μL（5 U）Klenow酶，混匀后室温孵育30 min。4．取0.5 μL反应产物，置于装有20 μL 0.5 mol/L EDTA的指形管中，在冰浴中保存备用。然后向剩余的反应体系中加入20 mmol/L 未标记的dA TP，经短暂（1～2 s）离心后，室温下继续孵育20 min。
5．在上述孵育期间，将保存的两份样品（步骤3和4）点在DE-81滤纸片上，并用放射性测定仪测定放射活性。
6．将指形管（步骤4）在68℃水浴中孵育10 min，使Klenow酶灭活。根据选用的限制酶，用5 mol/L NaCl将反应体系调整到所需的盐浓度，然后向反应体系中加入
20 U的限制酶，在适当的温度下孵育1 h。
7．用标准的苯酚/氯仿抽提法纯化DNA，并用离心层析柱或醋酸氨/酒精沉淀法去除未结合的dNTP，然后向DNA中加入0.5 mol/L EDTA，使其终浓度为10 mmol/L。8．根据DNA片段的大小，制备变性聚丙烯酰胺或碱性琼脂糖凝胶，并进行放射性标记DNA的电泳分离。
9．电泳结束后，用吸水纸吸干凝胶的液体，凝胶用塑料薄膜包裹后，转移到装有X-光胶片的暗盒内，暴光5～10 min。
10．将凝胶放在暴光胶片上，根据显影条带定位凝胶中的DNA片段，并用刀片切下
相应区域的凝胶。
11．如果用碱性琼脂糖凝胶分离DNA，先将切下的胶条在0.5 mol/L Tris·HCl（pH 7.6）中浸泡45 min，随后在0.5×TBE中浸泡45 min，然后进行DNA的洗脱。如果用聚丙烯酰胺凝胶分离DNA，可直接进行DNA的洗脱。
12．凝胶中的DNA可用电洗脱法进行（见相关实验），也可压碎后在适当的缓冲液中浸泡洗脱。
六、作业与思考题
1．核酸探针制备的方法主要有哪些？
2．单链DNA探针有哪些优点和用途？
3．在步骤3和4收集两份样品并进行放射性测定的目的是什么？
实验二 DNA探针的末端标记
一、原理和用途
DNA的末端标记包括单链DNA 51-端和31-端的标记，双链DNA 51-凸端、平端和凹端的标记，以及双链DNA 31-凸端、平端和凹端的标记。其中，最简单是大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段催化的31-凹端或平端标记。反应以适当限制酶消化的DNA 片段为模板，在三种dNTP存在的条件下，利用Klenow酶的DNA聚合酶活性，用[α-32P]dNTP填补31-凹端，或利用其31→51外切酶活性和聚合酶活性，以[α-32P]dNTP 取代31-平端的末端核苷酸。[α-32P]dNTP的选择取决于DNA 51-端的序列以及实验目的。例如，限制酶Eco RI消化片段的51-凸端为TTAA，应选择能与TT互补结合的[α-32P]dATP；而限制酶Bam HI消化片段的51-凸端为CTAG，则应选择能与C互补结合的[α-32P]dGTP。
31端标记探针的用途非常广泛，双端标记的DNA片段可作为Southern杂交的分子量标准，凝胶滞后（gel-retardation）试验的探针，凝胶中微量DNA的追踪，以及基因文库筛选或Southern杂交的探针；单端标记的DNA片段可用于化学降解序列测定法的模板，用S1核酸酶进行RNA图谱分析的探针，以及引物延伸反应的引物。另外，Klenow 酶催化的末端填补反应还可将生物素、荧光素、地高辛（digoxigenin）等半抗原修饰的核苷酸标记在DNA片段末端。但Klenow酶标记平端DNA的活性不强，高活性平端探针的标记应选用31→51外切酶活性更强的T4噬菌体DNA聚合酶。
二、实验材料
0.1～5 g Eco RI消化的DNA片段。
三、溶液与缓冲液
1．10 mol/L醋酸钠溶液
2．酒精
3．Eco RI限制酶
4．Klenow酶
5．1 mmol/L dGTP，dCTP和dTTP的混合液
6．10 mCi/mL [α-32P]dA TP
7．TE缓冲液（pH 7.6）
四、仪器设备及耗材
Sephadex G-50层析柱，水浴箱，台式离心机及吊桶式转头，15 mL塑料管, 螺口指形管。
五、实验方法
1．在指形管中依次加入下列成分：
模板DNA 1 μg
10×EcoRI酶缓冲液 2.5 μL
Eco RI酶1～2 U
去离子水至25 μL
短暂离心指形管，并在37℃水浴内消化1~2 h。
2．反应结束后，直接向消化产物中加入1 μL未标记的dNTP、2～10 μCi [α-32P]dATP 和1U Klenow酶，然后室温孵育15 min。
3．将指形管在75℃水浴中孵育15 min，终止反应。
4．将商品化Sephadex G-50离心层析柱装入15 mL塑料管中，在台式离心机和吊桶式转头内，以1600 g离心5 min，吸弃管内液体。然后将标记探针加入旋转柱内，经1600 g离心5 min后，收集管内液体（含标记探针），将离心层析柱丢弃于放射性污染物贮存容器。离心层析的目的是去除未标记的dNTP，可用2.5 mol/L醋酸氨和酒精沉淀法代替。
5．将收集的标记探针转移到1.5 mL螺口指形管中，盖紧管盖，100℃水浴煮沸5 min，再在冰浴中冷却2 min后使用。如果不立即使用，可将标记探针保存于-20℃备用。
注意：步骤2以后的操作需要在指定的放射性同位素操作室内进行，并采取严格的自身防护和防放射物污染措施。基本的防护措施包括在防护屏后操作，戴防护手套，将一切放射污染废弃物存放于专用容器内，操作后用放射性检测仪检查操作台面、地面、移液器和自身手臂等处有无放射性污染，一旦发现应按规定的去污染程序进行妥善处理。
六、作业与思考题
1．简述DNA探针末端标记的基本原理。
2．为什么标记探针变性需要用螺口指形管？
实验三 DNA探针的随机标记
一、原理和用途
DNA探针随机标记的基本原理是以寡核苷酸为引物，单链DNA为模板，在DNA 聚合酶催化下进行双链DNA的合成。由于所用引物是序列高度异质的寡核苷酸，故能与任何单链DNA模板结合。如果合成前体dNTP中的一种是[α-32P]标记的，就能产生高放射活性的DNA探针。
随机标记的DNA探针适用于各种核酸杂交试验。该方法早在1976年就有报道，但直到1980年代中期，由于商品化DNA聚合酶和核苷酸引物的出现才被广泛接受，反应条件也得到了标准化，许多公司还相继研制出商品化试剂盒。但随机标记法非常简单，反应的可控性和可重复性极高，使用自购试剂不仅费用经济，而且能取得同样的标记效果，实无必要购买价格颇高的商品化试剂盒。
与缺口平移标记法相比，随机标记法不依赖DNase I和51→31外切酶的双重活性，故其操作更为简单，标记产物的长度更为一致，用其进行的杂交试验的可重复性更好，目前几乎完全取代了缺口平移标记法，并成为双链DNA探针标记的标准方法。本实验以标准的随机标记法为例，练习DNA探针标记的基本操作，并加深对相关理论知识的理解。
二、实验材料
5~25 ng/μL模板DNA。
三、溶液与缓冲液
1.10 mol/L醋酸氨
2.酒精
3.DNA终止/贮存液
4.5×探针标记缓冲液
5.Klenow酶
6. 5 mmol/L dTTP、dCTP、dGTP混合液
7.125 ng/μL随机引物（6~7个核苷酸长）
8.10 mCi/mL [α-32P]dA TP
四、仪器设备及耗材
水浴箱，小型离心机，0.5 mL指形管，Sephadex G-50离心层析柱，微量移液器及吸头。
五、实验方法
1．将25 ng溶解在30 μL去离子水的模板DNA和1 μL随机引物加入0.5 mL的指形
管中，盖紧管盖，在100℃水浴中煮沸2 min，然后立即转入冰浴中。
2．1 min以后，将指形管4℃离心10 s，使模板DNA及寡核苷酸引物集中在管底，然后放回到冰浴备用。
3．向上述指形管中加入下列成分：
5 mmol/L dNTP混合液 1 μL
5×标记缓冲液10 μL
10 mCi/mL [α-32P]dA TP 5 μL
5U Klenow酶 1 μL
去离子水至50 μL
将指形管高速离心2 s，使所有溶液集中在管底，然后在室温下孵育60 min。4．反应管中加入10 μL NA终止/贮存液，终止反应。暂时不用的标记探针可在－20℃冰箱保存。标记好的探针一般可直接使用，必要时可用离心层析或酒精和醋酸氨沉淀法去除未标记的dNTP。
六、作业与思考题
1.试述DNA探针随机标记的基本原理。
2.为什么在模板变性等加热处理后需要将指形管短暂离心？
实验四 DNA探针的缺口平移标记
一、原理和用途
缺口平移标记（nick translation）需要两种酶的共同参与，DNase I切割双链DNA 的磷酸二酯键，使其两链形成多处随机缺口；大肠杆菌DNA聚合酶I负责将脱氧核糖核苷酸添加到DNase I切割产生的31-羟基末端，并利用其51→31外切酶活性去除缺口51侧的核苷酸，导致缺口沿着DNA移动。如果反应在[α-32P]dNTP存在的条件下进行，就能产生放射性标记的探针。
缺口平移标记探针的用途广泛，包括基因组文库和cDNA文库的筛选以及Southern 和Northern杂交。如前所述，缺口平移标记法已逐渐被更为简便的随机标记法取代，其主要问题是反应中难以平衡DNA聚合酶I与DNase I的活性，导致标记探针长度的不均一。商品化试剂盒在某种程度上克服了这些问题，但仍不如随机标记可控性强。
二、实验材料
双链模板D NA。
三、溶液与缓冲液
1．10×切口平移酶缓冲液
2．10×连接缓冲液
3．1 mg/mL胰DNA酶I
4．20 mmol/L dNTP混合液
5．10 μCi/μL [α-32P]dNTP
6．大肠杆菌聚合酶I
7．0.5 mol/L EDTA，pH 8.0
四、仪器设备及耗材
指形管，震荡混旋器，水浴锅，DE-81滤膜，Sephadex G-50离心层析柱，电泳仪。
五、实验方法
1. 向指形管中加入下列试剂：
10×切口平移缓冲液 2.5 μL
模板DNA 0.5 μg
未标记dNTP混合液 1 μL
[α-32P]dNTP 5 μL
加水至21.5 μL
将混合液在冰浴中冷却。
2.用冰冷的含50%甘油的1×切口平移缓冲液将将胰DNA酶稀释成10 ng/mL，取
2.5 μL加入上述反应液中，震荡混匀。
3.向反应液中加入2.5 U大肠杆菌聚合酶I，轻轻震荡混匀。
4.将反应液于16℃孵育1 h，然后加入1 μL 0.5 mol/L EDTA，终止反应。
5.用DE-81滤膜结合法或TCA沉淀法测定DNA中掺入[α-32P]dNTP的比例（见相
关实验）。
6.用Sephadex G-50离心层析柱去除标记探针中未结合的dNTP。
7.用乙醇沉淀标记的DNA探针。如有必要，可用碱性琼脂糖凝胶电泳分离和回收所
需大小的标记DNA。
六、作业与思考题
1. 比较随机标记与切口平移标记的优缺点。
附：DNA探针的非放射性标记
自从1960年代以来，DNA探针几乎都用放射性同位素进行标记，其标记探针的主要优点是杂交信号强（如32P标记探针可检测≤1pg的目标DNA），便于用仪器对标记和信号显示等步骤进行跟踪检测。但放射性标记也有诸多弊端，其中包括半衰期较短（如[α-32P]dNTP的半衰期为14.3天），不能用于高分辨影像的分析，必须在专门的同位素实验室内操作，对操作人员的辐射损伤不容忽视，放射性同位素的运输、贮存和废物处理均需专门的仪器或容器，以及反对放射性污染的社会和政治压力愈来愈大，迫切需要
电子探针的分析原理及构造
电子探针在找矿方面的应用 一、电子探针-基本概念 电子探针仪是 X射线光谱学与电子光学技术相结合而 产生的。1948年法国的R.卡斯坦制造了第一台电子探针 仪。1958年法国首先制造出商品仪器。电子探针仪与扫 描电子显微镜在结构上有许多共同处。70年代以来生产 的电子探针仪上一般都带有扫描电子显微镜功能，有的还 附加另一些附件，使之除作微区成分分析外，还能观察和 研究微观形貌、晶体结构等。 用波长色散谱仪（或能量色散谱仪）和检测计数系统， 测量特征X射线的波长（或能量）和强度，即可鉴别元素 的种类和浓度。在不损耗试样的情况下，电子探针通常能 分析直径和深度不小于1微米范围内、原子序数4以上的 所有元素；但是对原子序数小于12的元素，其灵敏度较 差。常规分析的典型检测相对灵敏度为万分之一，在有些 情况下可达十万分之一。检测的绝对灵敏度因元素而异， 一般为10-14～10-16克。用这种方法可以方便地进行点、 线、面上的元素分析，并获得元素分布的图象。对原子序数高于10、浓度高于10％的元素，定量分析的相对精度优于±2％。 电子探针仪主要包括：探针形成系统 (电子枪、加速和聚焦部件等)、X射线信号检测系统和显示、记录系统、样品室、高压电源和扫描系统以及真空系统。 二、电子探针-结构特点 电子探针X射线显微分析仪(简称电子 探针)利用约1Pm的细焦电子束，在样品表 层微区内激发元素的特征X射线，根据特 征X射线的波长和强度，进行微区化学成 分定性或定量分析。电子探针的光学系统、 真空系统等部分与扫描电镜基本相同，通 常也配有二次电子和背散射电子信号检测器，同时兼有组织形貌和微区成分分析两方面的功能。电子探针的构成除了与扫描电镜结构相似的主机系统以外，还主要包括分光系统、检测系统等部分。 电子探针主要由电子光学系统（镜筒），X射线谱仪和信息记录显示系统组成。电子探针和扫描电镜在电子光学系统的构造基本相同，它们常常组合成单一的仪器。 电子光学系统 该系统为电子探针分析提供具有足够高的入射能量，足够大的束流和在样品表面轰击殿处束斑直径近可能小的电子束，作为X射线的激发源。为此，一般也采用钨丝热发射电子枪和2-3个聚光镜的结构。为了提高X射线的信号强度，电
地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书
地高辛标记与检测DNA试剂盒DIG DNA Labeling and Detection Kit 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。 此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应， 可检测10×10cm2面积的杂交膜50张 指导手册 1 前言 1.1 内容表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2.介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程图 3.3 地高辛标记DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫检测
3.8 DNA印记的洗脱和再杂交1.2 试剂盒的成分 瓶号标记 内容包括功能 1 无标记对照DNA1 2 无标记对照DNA2 3 DNA稀释缓冲液2管1mL 50μg/mL鱼精DNA,10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH8.0 在25℃ 澄清溶液 4 DIG标记的对照 DNA 20μL 5μg/mL 质粒pBR328 DNA （用Bam HI线性 化） 澄清溶液 用于确定标记效率 5 六聚核苷酸混合物 6 标记用混合物 7 DNA聚合酶1大片 段 标记级 8 抗地高辛的碱性磷 酸酶结合物 200μL 750U/mL 从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶 澄清溶液 9 NBT/BCIP 10 封阻试剂附加仪器与所需试剂
除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。 在每个操作程序的前面提供了详细的信息。 操作程序仪器设备试剂 3.3 DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水 0.2M pH8.0 灭菌的 EDTA 3.4 标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜* 地高辛洗涤和封阻缓冲 组合* TE缓冲液 或者 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 3.5 DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用 于紫外交联的其他设备2×SSC 或者10×SSC 3.6 杂交尼龙膜，带正电荷* 杂交袋*，或者耐热的塑料 袋或者滚筒瓶（分子杂交 炉） 注意：当用地高辛杂交缓冲 液工作时，不要用开口的托 盘。DIG Easy Hyb （杂交缓冲液，需单独购买） 3.7 免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶 杂交袋* 地高辛洗涤和封阻缓冲组合* TE缓冲液 或者 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 3.8 DNA 斑点的脱色和大的托盘DMF
罗氏地高辛说明书
DIG DNA Labeling and Detection Kit 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。 此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应， 可检测10×10cm2面积的杂交膜50张 指导手册 1 前言 1.1 内容表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2.介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程图 3.3 地高辛标记DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫检测 3.8 DNA印记的洗脱和再杂交
除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。
2.介绍 2.1 产品概况 实验原则 此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten去标记DNA 应用 地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交 样品材料 至少100bp的DNA片段 线性的质粒，cos质粒或者DNA 超螺旋的DNA 实验时间
检测数量 一个试剂盒足够用于: 25个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3μg； 并可以检测50张10×10cm2的杂交膜。 质量控制 根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA 【pBR328】进行标记，并按 照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg 同源DNA点在膜上16h后成色 显影检测。 试剂盒的储存和稳定性 未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15℃到-25℃（保质期印在标签上）。在干冰中运输。 一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。 采用southern杂交从1μg人胎盘DNA（经BglⅡ或EcoRⅠ酶切）中检测到单拷贝基因。
分子标记技术的种类
分子标记技术的种类-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性； ②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速； ⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们 均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原
实验六 电子探针结构原理及分析方法
实验六电子探针结构原理及分析方法 一、实验内容及实验目的 1．结合电子探针仪实物，介绍其结构特点和工作原理，加深对电子探针的了解。 2．选用合适的样品，通过实际操作演示，以了解电子探针分析方法及其应用。 二、电子探针的结构特点及原理 电子探针X射线显微分析仪(简称电子探针)利用约1μm的细聚焦电子束，在样品表层微区内激发元素的特征X射线，根据特征X射线的波长和强度，进行微区化学成分定性或定量分析。电子探针的光学系统、真空系统等部分与扫描电镜基本相同，通常也配有二次电子和背散射电子信号检测器，同时兼有组织形貌和微区成分分析两方面的功能。电子探针的构成除了与扫描电镜结构相似的主机系统以外，还主要包括分光系统、检测系统等部分。本实验这部分内容将参照教材，并结合实验室现有的电子探针，简要介绍与X射线信号检测有关部分的结构和原理。 三、电子探针的分析方法 电子探针有三种基本工作方式：点分析用于选定点的全谱定性分析或定量分析、以及对其中所含元素进行定量分析；线分析用于显示元素沿选定直线方向上的浓度变化；面分析用于观察元素在选定微区内的浓度分布。 1．实验条件 (1) 样品：样品表面要求平整，必须进行抛光；样品应具有良好的导电性，对于不导电的样品，表面需喷镀一层不含分析元素的薄膜。实验时要准确调整样品的高度，使样品分析表面位于分光谱仪聚焦圆的圆周上。 (2) 加速电压：电子探针电子枪的加速电压一般为3~50kV，分析过程中加速电压的选择，应考虑待分析元素及其谱线的类别。原则上加速电压一定要大于被分析元素的临界激发电压，一般选择加速电压为分析元素临界激发电压的2~3倍。若加速电压选择过高，导致电子束在样品深度方向和侧向的扩展增加，使X射线激发体积增大，空间分辨率下降。同时过高的加速电压将使背底强度增大，影响微量元素的分析精度。 (3) 电子束流：特征X射线的强度与入射电子束流成线性关系。为提高X射线信号强度，电子探针必须使用较大的入射电子束流，特别是在分析微量元素或轻元素时，更需选择大的束流，以提高分析灵敏度。在分析过程中要保持束流稳定，在定量分析同一组样品时应控制束流条件完全相同，以获取准确的分析结果。 (4) 分光晶体：实验时应根据样品中待分析元素及X射线线系等具体情况，选用合适的分光晶体。常用的分光晶体及其检测波长的范围见有关表。这些分光晶体配合使用，检测X
分子标记技术
分子标记技术 摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助 一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。 关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用 引言 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 一．常用分子标记原理 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝
探针标记
核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。 第四节非放射性标记的核酸探针 放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技
术的广泛应用。目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。 酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针DNA中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。 化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到DNA分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（>50μg）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA 或RNA分子上。 非放射性标记核酸探针方法很多，现介绍常用的几种方法如下： 一、生物素标记核酸探针方法 生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上，合成TTP或UTP的类似物。在离体条件下，这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入带有缺口的DNA或RNA，得到生物素标记的核酸探针。这种标记方法称为缺口平移法。用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素-酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记物进行检测。
原位杂交-经典方法-地高辛标记探针
原位杂交 (In situ hybridization) 一、目的 掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。 二、原理 原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。 原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 三、仪器设备 烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。 四、材料和试剂 1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。 2．试剂： Davidson’s AFA固定液: 330 ml 95％乙醇 220 ml 福尔马林（37～39％甲醛水溶液） 115 ml 冰醋酸 335 ml H2O 混匀后封口，室温放置； DIG标记与检测试剂盒（Roche公司）； TNE：50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base 10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl 1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTA ddH2O 900 ml （定容至1L） 用HCl调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存；
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标 记方法 Last revision on 21 December 2020
地高辛标记核酸探针的标记方法 核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。 采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA
探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。 对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。 1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法 1. 1 DNA 探针的标记方法 1. 1. 1 PCR 掺入法这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。 1. 1. 2 随机引物法用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。100～10000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。
四种分子杂交的原理及方法
Southern杂交 基本概念及原理：Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA 片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern 印迹杂交技术获得。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。 下面以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。 步骤：一、待测核酸样品的制备 （一）制备待测DNA 基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。 （二）DNA限制酶消化 基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA 后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。
地高辛标记探针的Southern 杂交
地高辛标记探针的Southern杂交 1.探针标记(20μL体系)： 1)将10ng-1μg模板DNA用无菌去离子水补足至16μl。 2)沸水浴或干浴锅98o C10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。 3)充分混匀DIG-high Primer（1#管），并取4μl至变性DNA管，混匀并离 心； 4)37o C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）； 5)停止反应，加2μL0.2M EDTA（pH8.0）或65o C加热10分钟。若不用 将于-20o C冰箱保存。 2.探针标记效率检测： 将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下： 1)根据表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记 产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA稀释 表1DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量 Template DNA1h20h 10ng45ng600ng 30ng130ng1050ng 100ng270ng1500ng 300ng450ng2000ng 1000ng850ng2300ng 3000ng1350ng2650ng
表2探针DNA及Control DNA系列表 Tube DNA(μl)From Tube#DNA dilution buffer(μl) Dilution Final concentration 1Diluted orginal 1ng/μl 2211981:10010pg/μl 3152351:3.33pg/μl 452451:101pg/μl 553451:100.3pg/μl 654451:100.1pg/μl 755451:100.03pg/μl 856451:100.01pg/μl 90-50-0 1)将上述稀释的2-9号管的control DNA及探针DNA各取1μL点膜； 2)120o C固定30min或紫外交链3-5min； 3)将膜放入装有20mL Maleic acid buffer的塑料器皿中，室温振荡2min； 4)将膜放入10mL Blocking solution中室温温育30min； 5)将膜放入10mL Antibody solution中室温温育30min； 6)用10mL Washing buffer洗2次，每次15min； 7)在10mL Detection buffer平衡2-5min； 8)将膜放入2mL新配制的Color substrate solution(从试剂5#中取100ul到 5mL)中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡! 9)当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相 染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较标记的探针与Control DNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量：如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色，0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg 显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng 探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。
分析测试中心电子探针(EPMA)简介
分析测试中心电子探针（EPMA）简介 一、仪器概述 电子探针利用聚焦得非常细(微米-纳米级)的高能电子束轰击样品，激发出各种被测物质的有用信息（如特征X射线、二次电子、背散射电子等），通过分析这些有用信息达到对样品微区成分分析和形貌观察的目的。 电子探针与扫描电镜的结构大致相似，不同的是电子探针有一套完整的X射线波长和能量探测装置（波谱仪WDS和能谱仪EDS），用来探测电子束轰击样品所激发的特征X射线。由于特征X射线的能量或波长随着原子序数的不同而不同，只要探测入射电子在样品中激发出的特征X射线波长或能量，就可获得样品中所含的元素种类和含量，以此对样品微区成分进行定量分析是电子探针最大的特点。 分析测试中心已安装的电子探针是日本岛津公司生产的EPMA-1600型最新产品，它不仅具有较高的X射线检出角，同时由于使用全聚焦的X射线分光晶体，能兼顾X 射线检测的高灵敏度和高分辨率，并配有高稳定的电子光学系统、真空系统及高精度机械系统以及EDAX公司生产的Genesis能谱仪，是目前华南地区最先进的微区成分定性定量分析和形貌观察用大型精密科研仪器之一。 二、仪器用途 适用于材料(合金、陶瓷、半导体材料等)、矿物、冶金、机械、微电子等领域的微区化学组成定性和定量分析、微区化学组成线分析、微区化学组成面分析以及各类固体产品的微区形貌观察与成分分布图像等，是对试样表面形貌观察、微区组织结构和元素定性定量分析的最有效、原位（in-situ）表征手段。 三、仪器的性能与特点 1、具有较高的X-射线检出角(52.5?)，有利于提高仪器空间分辨率和凸凹样品分析观察的可靠性；分光晶体采用Johanson型全聚焦分光晶体，同一道波谱仪兼顾高分辨率和高灵敏度。 2、分析精度：好于1%(主要元素，含量>5%)和5%(次要元素，含量～1%)；谱仪检测极限：大于10ppm。 3、分析元素范围：4Be-92U；加速电压：0.2-30kV(可调步长≤0.5kV)；二次电子像分辨率：6nm；放大倍数：50-300000?，连续可调（有效图像观察倍数≤50000?）。 4、电子束流稳定性：好于1.5?10-3/h；电子束流：10-12–10-5A，连续可调，绝对准确值好于10%。 5、样品台最小移动间距为0.02微米，重复精度好于±1μm，机械系统精密度高。
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标记方法 核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙
元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。 采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR 法将其掺入到DNA探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。 对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。 1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法 1. 1 DNA 探针的标记方法 1. 1. 1 PCR 掺入法这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。 1. 1. 2 随机引物法用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标
电子探针分析过程浅析
电子探针分析过程浅析 电子探针（EPMA）是非常先进的元素定性和定量分析设备，是目前微区元素定量分析最准确的仪器。它使用细聚焦电子束入射样品表面，激发出样品元素的特征X射线，分析X射线的波长，即可知道样品中所含元素的种类；分析特征X射线的强度，可知样品中对应元素的相对含量，并配置能谱仪分析附件。电子探针可进行图像观察，并获得元素的定性定量分析数据。它的应用能为钢铁产品的研发工作及质量控制提供准确、有效的分析数据。针对此课题，本报记者采访了首钢技术研究院检验高级工程师严春莲。 电子探针在钢铁工业中有非常重要的作用，国内外许多科研院所、钢铁企业都利用电子探针进行固体样品的微区（微米到纳米级）分析，可分析的元素范围是B5—U92。它利用细聚焦的电子束照射样品，可查明钢铁样品微区中的元素成分，尤其是可以对C、N、O等轻元素进行定性定量分析，X射线取出角可达52.5°，以高信噪比及高灵敏度检测钢材中较轻元素的含量可达ppm级。这是扫描电镜所不能胜任的，因为扫描电镜和能谱仪一般是对元素周期表中Na元素以后的重元素进行定性和半定量分析。现阶段，利用电子探针已经突破这一局限，大大方便研发人员对样品中的轻元素进行微观分析研究。如板材产品会出现明显的碳偏析和析出相，通过电子探针进行微区观察分
析，会有助于生产实际问题的解决，促进新产品强化机理问题的深入研究。另外，电子探针还可以进行镀层成分、厚度的测定、粒度分布的测定及断面分析等。电子探针无疑是钢铁企业提高科研水平、改善产品质量的一种非常有效的技术手段。 与传统的成分分析仪相比，电子探针更偏重成分的微区定量分析，处于微米级的分析精度，它的检测极限一般为0.01—0.05wt%，对原子序数大于11，含量在10wt%以上的元素，其相对误差通常小于2%。而光谱类的分析仪是较宏观的检测，处于毫米级的分析精度。以380CL 车轮钢开裂分析为例，裂纹从边部开裂，沿着中心偏析带附近往里扩展，但未曾沿着中心偏析带开裂。裂纹开裂处周边无夹杂，无氧化物，周边组织无脱碳现象。利用金相显微镜、扫描电镜等分析后只能观察到有偏析带，但具体是什么成分偏析、偏析程度如何就无法准确判定，而利用电子探针分析发现试样中心偏析带附近存在着磷偏析带，裂纹沿着磷偏析带开裂。根据这一结果，倒推出当时在炼钢生产时，同一时间生产的高强钢也发现了严重的磷偏析，现场生产异常排除后，车轮钢至今未发现因磷偏析引起的开裂。 目前，首钢技术研究院利用电子探针开发铸坯枝晶组织显示、枝晶偏析定量分析等技术处于国内领先水平。通过设置适当的分析条件，电子探针的面、线、点分析功能可以较好地表征钢中微量元素的偏析状况，并可获得准确定量的微区化学成分。对成分偏析含量低、组织
电子探针分析技术在地学中的应用进展
电子探针分析技术在地学中的应用进展 摘要电子探针分析技术（EPMA）是一种应用较早、且至今仍具有独特魅力的多元素分析技术。二战以后，世界经济和社会的迅猛发展极大地促进了科学技术的进步，电子探针分析技术（EPMA）也进入了一个快速发展时期。在地学领域的应用中,取得了令人瞩目的成就。文章就该技术的发展历史、发展趋势及在地学中的应用进展等方面做出了具体阐述。 关键词：电子探针；地学；应用进展 1引言 电子探针是电子探针X 射线显微分析仪的简称，英文缩写为EPMA (Electron Probe X-ray Micro-Analyser)，它用一束聚焦得很细（50nm～１μｍ）的加速到 5kV-30kV的电子束，轰击用光学显微镜选定的待分析试样上某个“点”（一般直径为1-50um），利用试样受到轰击时发射的X射线的波长及强度，来确定分析区域中的化学组成。 随着电子光学技术和计算机技术的发展，现在的EPMA同时具有扫描电镜SEM的形貌观察、结构分析等功能。不但像仪器发明之初那样，以金属和矿物样品中不同相或不同组成的成分分析为主要目的，而且也应用在冶金、电子电器件、陶瓷、塑料、纤维、木材、牙齿、骨骼、叶、根等等方面。其应用领域之广泛，可说目前已经涉及到所有固体物质的研究工作中，尤其在材料研究工作方面。这种仪器不仅是研究工作中的重要工具，而且也是质量检查的手段之一。本文仅对EPMA在地学领域中的应用进展加以阐述。 2电子探针的发展历史简介 电子探针分析的基本原理早在1913 年就被Moseley发现，但直到1949 年，法国的Castaing在guinier教授的指导下，才用透射电镜（TEM）改装成一台电子探针样机。1951年6月，Castaing在他的博士论文中，不仅介绍了他所设计的电子探针细节，而且还提出了定量分析的基本原理。现在电子探针的定量修正方法尽管作了许多修正，但是，他的一些基本原理仍然适用。1955年Castaing在法国物理学会的一次会议上，展出了电子探针的原形机, 1956 年由法国CAMECA公司制成商品，1958年才把第一台电子探针装进了国际镍公司的研究室中，当时的电子探针是静止型的,电子束没有扫描功能。
地高辛标记原理及步骤
斑点杂交实验 【实验原理】用的高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。 【实验步骤】 1．处理：将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20—30 min。（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作） 2．变性：将待测DNA样品（HCV经RT-PCR扩增产物；HBV的PCR扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10μL）置于PCR仪中100℃加热10min，立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min。 （每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上） 【原理】使DNA样品变性，即双链DNA→单链DNA。 3．点样：将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。 【原理】使样品中的DNA与膜结合牢固。 4．预杂交：将杂交膜封入杂交袋中（每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中），做好剪角标记（勿过大）。用1000μL加样器，加入预杂交液（Dig Easy Hyb），每组5mL全部加完，使尼龙膜恰恰漂起即可，若5mL预杂交液不足，可适当补加。除去气泡，置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min-60min。 【原理】封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点。 5．杂交液制备：用预杂交液将探针按100ng/mL浓度稀释，即为杂交液。 （已准备好） 6．杂交：剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入杂交液2-3mL，除去气泡，封口。置50℃恒温摇床上，轻轻振荡过夜。 7．洗膜：（1）回收杂交液； （2）室温下，用2×wash solution洗膜两次，每次5min； （3）将0.1×wash solution预热到50℃洗膜两次，每次15min。【原理】洗去未结合的探针，否则会导致过高的本底。 8. 封闭：取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培养皿中浸泡1分钟平衡后，转入 30mL BufferⅡ中，室温作用30-60min。 【原理】封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。 （在此阶段末期，准备下一步的抗体稀释。稀释方法：加1μL Anti-DIG-AP 到10mL BufferⅡ后轻轻混匀，4℃可保存12h。） 9. 酶联抗体结合：将杂交膜封入一个新的杂交袋中，加入3mL Anti-DIG-AP/ BufferⅡ中室温作用30min，经常摇动，使酶联抗体与地高辛结合。 10.洗膜：（1）取出膜，将膜放入含有30mL BufferⅠ的培养皿中，洗膜两次， 每次15min。 【原理】洗去未结合的酶联抗体。 （2）取出膜，将膜放入含有20mL BufferⅢ的培养皿中平衡2min。11．显色：（1）将45μL NBT solution和35μL X-Phosphate加入到10mL Buffer Ⅲ中，显色液必需现配现用！ （2）在10mL新鲜制备的显色底物液中静止避光显色数小时，常在12h 内完成显色反应。