产纤维素酶真菌的分离和鉴定

产纤维素酶真菌的分离、筛选与鉴定
一、采样
地点：深圳大学杜鹃山深圳大学文科楼荔枝园深圳大学文山湖树丛
用具：灭菌信封小铁铲小刀分离培养基手套
采样的方法：取采样地点的表层土或地面15cm下的土样约10g，装入信封，立刻到实验室分离纯化
二、培养基：
（1）马丁氏培养基：KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂20.0 g、水1000ml，pH 自然。

（2）PDA培养基：PDA培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，1 %葡萄糖，2 % Agar。

20 %土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。

（均需要加入抗生素100μg/ml）
产酶筛选培养基（CMC培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC）20.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母抽提物2.0 g、NaCl 5.0g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、蒸馏水1 000ml。

1%CMCNa底物溶液：1克CMCNa加热溶化于100ml pH值4.8，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。

0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓
0.1mol/L柠檬酸: 含柠檬酸·H2O 21.01克/1000毫升。

0.1mol/L的柠檬酸三钠: 含柠檬酸三钠·2H2O 29.4克/1000毫升。

0.1mol/L的柠檬酸40ml与0.1mol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。

刚果红染液：2% 刚果红溶液。

NaCl脱色液：2%氯化钠溶液。

三、实验方法
3.1 真菌菌株的分离
取土样方法如前所述。

取1.0 g所采集的土样加入到装有9 ml无菌水的试管中，充分振荡混匀后，吸取上清液作一系列梯度稀释，10-1，10-2，10-3，将稀释液涂布在分离培养基（可选择查氏、马丁氏或PDA培养基的任两种，倒平板前加入100 μg/ml头孢菌素或链霉素等抗生素），于28℃下培养，待菌落成熟，形成孢子后（约需5-7 d）将单菌落上的少量孢子点种至纤维素酶产生菌筛选培养基（CMC平板）平板上( 用前加入适量抗生素来抑制细菌生长) , 28℃倒置恒温培养。

培养5-7d后用刚果红染色、NaCl脱色后筛选菌落周围有明显透
明水解圈的菌株。

将筛选到的菌种由平板接到50mL( 250 mL 三角瓶) 液体培养基中, 于28℃、20 r/min下培养24 h, 制成种子液。

然后按5%的接种量将种子液加到50 mL( 250 mL 三角瓶) 相应液体培养基中，于28℃、210 r·min- 1 条件下培养5-7d, 测定CMC酶活。

3.2 酶活力测定方法
3.2.1 标准葡萄糖曲线的制作
精确称量0.1 g的D-葡萄糖溶于0.05 M的柠檬酸缓冲液中，用容量瓶定容到100 ml，葡萄糖浓度为1.0 mg/ml；将其依次稀释到0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml、1.0 mg/ml，这就是一组标准的葡萄糖溶液；在试管中加入1 mL 标准葡萄糖溶液和3 mL DNS 试剂，沸水浴5 分钟，冷却至室温后，加水至25 mL，摇匀。

以0.05 M的柠檬酸缓冲液为空白，在酶标仪上测540 nm 处的OD值；以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，OD值为纵坐标，作出标准曲线，并回归出工作方程。

3.2.2 滤纸酶活的测定
纤维素酶滤纸酶活力的测定方法是根据纤维酶能将滤纸酶解成葡萄糖的特性而设计。

一个FPA国际单位等于酶水解反应中每分钟由滤纸生成1µmol葡萄糖的酶量，以U/mL来表示。

取3支25 ml的比色管，编号为1，2，3；分别加入1 ml pH 4.5，0.05 M的柠檬酸缓冲液和0.05g的滤纸条；向1号管中加入1 ml灭活的上述转化子上清（在沸水中将上清煮沸10 min），2号和3号管中加入1 ml未灭活的上清；50 ℃，100 r/min振荡水浴30 min；加入3 ml DNS，沸水煮沸5 min，冷却后加水定容到25 ml；充分混合，取200 ml加到96孔酶标板上，在酶标仪上测540 nm处的OD值；根据预先作好的葡萄糖标准曲线算出酶反应过程所释放的葡萄糖量。

30 180
1000 )
(
)
/
(
⨯⨯
=mg
ml U 葡萄糖含量
滤纸酶活
3.2.3 CMC酶活的测定
其酶活定义为每分钟酶解CMC产生1μmol的还原糖（葡萄糖）所需的酶量定义为一个酶活单位。

取3支25 ml的比色管，编号为1，2，3；分别加入1 ml 1 %的CMC溶液（用pH4.5，0.05 M 的柠檬酸缓冲液配制）；向1号管中加入0.5 ml灭活的上述转化子上清，2和3号管中加入0.5 ml 未灭活的上清；50 ℃，100 r/min振荡水浴15 min；加入3 ml DNS，沸水煮沸5 min，冷却后加水定容到25 ml；充分混合，取200 ml加到96孔酶标板上，在酶标仪上测540 nm处的OD 值；根据预先作好的葡萄糖标准曲线算出酶反应过程所释放的葡萄糖量。

3.3 菌株的鉴定：
菌株的鉴定初步采用形态鉴定方法。

观察菌株的菌落特征，并制片观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子链、分生孢子等形态，参考有关产纤维素酶菌株的菌种鉴定文献，同时结合《真菌鉴定手册》，初步给出菌株的属名。

实验可行性：真菌采样方便。

产纤维素酶真菌一般生活在阴暗潮湿土壤中、昆虫消化道内。

而且纤维素酶菌种易退化，退化后其产酶力明显降低，其原因可能有三个方面：①经诱变筛选的菌种发生回复突变。

②自然负突变。

③菌种长时间低温斜面保藏，会在分生孢子上长出次生菌丝，而次生菌丝所形成的分生孢子生命力弱，这可能是菌种退化的主要原因。

为了避免纤维素酶菌种退化，张苓花等（1998）报道，采用砂土管保藏菌种。

即将过筛洗净的砂子与土以3：2比例混合分装在试管内，用1kg/cm2压力灭菌30分钟共三次，将欲保存的斜面菌种制备成1000ml孢子悬浮液，每个砂土管注入0.5ml，摇匀，放入盛有无水CaCl2真空干燥器内保存。

经测定，在所测的121天内，酶的活性基本不变；酶活性下降50% 的时间，由常规方法的60天延长至160天，明显地减缓了菌种退化速度。

所以说菌种的保养和分离提取难度较大。