真菌的分离鉴定与药敏试验结果分析
鸽源白色念珠菌的分离鉴定及药物敏感性分析
畜牧兽医学报 2023,54(7):3002-3011A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.07.031开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):鸽源白色念珠菌的分离鉴定及药物敏感性分析程相宁1,张 韵1,何佳蔚1,陈政锟1,金美兰2,丁红雷1*,王庆华1*(1.西南大学动物医学院动物支原体学实验室,重庆400715;2.西南大学实验动物中心,重庆400715)摘 要:重庆某鸽场1~3周龄幼鸽喉头出现大块干酪样物,堵塞喉头,导致无法进食并陆续死亡㊂本研究旨在鉴定导致该鸽场大批幼鸽发病的病原㊂在病鸽喉头㊁嗉囊㊁腺胃㊁肠道等部位采集病料,接种含1%庆大霉素P D A 平板分离病原,采用革兰染色㊁棉蓝染色㊁芽管生成试验和P C R 扩增鉴定病原㊂分离的病原菌进行动物回归试验和药物敏感性试验㊂最终在5只病鸽分离到8株革兰染色呈卵圆形㊁黑色或粉紫色的革兰阳性酵母样菌体,棉蓝染色结果显示菌体长出菌丝和孢子㊂这些真菌在含1%庆大霉素P D A 平板上生长为乳白色㊁边缘整齐的光滑菌落,在胎牛血清中孵育能生成芽管,能扩增出白色念珠菌特异r D N A 基因间转录间隔区序列㊂动物回归试验结果显示分离菌株能导致雏鸡嗉囊肿胀,嗉囊鳞状上皮细胞变性㊁坏死㊁脱落㊂药物敏感性试验显示分离菌对两性霉素B ㊁制霉菌素和克霉唑敏感㊂本研究确定了导致鸽场发病的病原为白色念珠菌,且分离菌在体外对部分抗真菌药物敏感㊂关键词:白色念珠菌;形态学鉴定;抗真菌药物敏感性;最小抑菌浓度中图分类号:S 852.66 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)07-3002-10收稿日期:2022-11-23基金项目:国家自然科学基金(32172870);中央高校基本科研业务费专项资金(X D J K 2020B 012)作者简介:程相宁(1998-),女,新疆乌鲁木齐人,硕士生,主要从事兽医传染病学研究,E -m a i l :26883961@q q.c o m *通信作者:丁红雷,主要从事兽医传染病学研究,E -m a i l :h o n g l e i d i n g@s w u .e d u .c n ;王庆华,主要从事兽医传染病学研究,E -m a i l :42793881@q q.c o m I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o n a n d A n t i f u n g a l S u s c e p t i b i l i t y A n a l ys i s o f C a n d i d a a l b i c a n s I s o l a t e d f r o m P i ge o n s C H E N G X i a n g n i n g 1,Z H A N G Y u n 1,H E J i a w e i 1,C H E N Z h e n gk u n 1,J I N M e i l a n 2,D I N G H o n g l e i 1*,WA N G Q i n gh u a 1*(1.L a b o r a t o r y o f A n i m a l M y c o p l a s m o l o g y ,C o l l e g e o f V e t e r i n a r y Me d i c i n e ,S o u t h w e s t U n i v e r s i t y ,C h o n g q i n g 400715,C h i n a ;2.L a b o r a t o r y An i m a l C e n t e r ,S o u t h w e s t U n i v e r s i t y ,C h o n g q i n g 400715,C h i n a )A b s t r a c t :O n e t o t h r e e w e e k o l d p i g e o n s f r o m a f a r m i n C h o n g q i n g h a d l a r ge p i e c e s of c h e e s e -l i k e s u b s t a n c e s i n t h e i r t h r o a t s ,c a u s i ng p i g e o n s th r o a t s t o b e b l o c k e d ,r e s u l ti n g i n i n a b i l i t y to e a t a n d d e a t h i n s u c c e s s i o n .T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o i d e n t i f y t h e p a t h o ge n s t h a t c a u s e d t h e d i s e a s e of a l a rg e n u m b e r o f y o u n g p i g e o n s .Th e p a t h o g e n w a si s o l a t e d f r o m t h e t h r o a t ,c r o p,g l a n d u l a r s t o m a c h a n d i n t e s t i n e s o f d i s e a s e d p i g e o n s .T h e s a m pl e s w e r e c o l l e c t e d f r o m t h e t h r o a t ,c r o p ,g l a n d u l a r s t o m a c h a n d i n t e s t i n e s o f d i s e a s e d p i ge o n s ,a n d i n o c u l a t e d o n P D A p l a t e s c o n t a i n i n g 1%g e n t a m i c i n t o i s o l a t e d p a t h o g e n s .P a t h o g e n s w e r e i d e n t if i e d b yg r a m s t a i n i n g,c o t t o n b l u e s t a i n i n g ,g e r m t u b e t e s t ,a n d P C R a m p l i f i c a t i o n .A n i m a l r e g r e s s i o n t e s t a n d a n t i f u n -g a l s u s c e p t i b i l i t y w e r e c a r r i e d o u t .E i g h t g r a m -p o s i t i v e y e a s t -l i k e c e l l s w i t h o v a l ,b l a c k o r p u r pl e p i n k c o l o r w e r e i s o l a t e d f r o m 5d i s e a s e d p i g e o n s .T h e r e s u l t s o f c o t t o n b l u e s t a i n i n g sh o w e d t h a t7期程相宁等:鸽源白色念珠菌的分离鉴定及药物敏感性分析m y c e l i a a n d s p o r e s g r e w f r o m t h e i s o l a t e s.T h e s e i s o l a t e s w e r e m i l k y w h i t e s m o o t h c o l o n i e s w i t h n e a t e d g e s o n P D A p l a t e s c o n t a i n i n g1%g e n t a m i c i n.W h e n i n c u b a t e d i n f e t a l b o v i n e s e r u m,t h e y c a n g r o w i n t o g e r m t u b e s.T r a n s c r i p t i o n a l s p a c e r s e q u e n c e o f C a n d i d a a l b i c a n s s p e c i f i c r D N A g e n e s w e r e a m p l i f i e d f r o m t h e i s o l a t e s.T h e r e s u l t s o f a n i m a l r e g r e s s i o n t e s t s h o w e d t h a t t h e i s o-l a t e d s t r a i n s c a u s e s s w e l l i n g o f c r o p s,a n d t h e d e g e n e r a t i o n,n e c r o s i s a n d a b s c i s s i o n o f c r o p s s q u a m o u s e p i t h e l i a l c e l l s.T h e a n t i f u n g a l s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g s h o w e d t h a t t h e i s o l a t e s w e r e s u s-c e p t i b l e t o a m p h o t e r i c i n B,n y s t a t i n a n d c l o t r i m a z o l e.I n t h i s s t u d y,C a n d i d a a l b i c a n s w a s i d e n-t i f i e d a s t h e p a t h o g e n o f p i g e o n s a t a p i g e o n f a r m i n C h o n g q i n g,a n d t h e C a n d i d a a l b i c a n s i s o-l a t e s w e r e s u s c e p t i b l e t o s o m e a n t i f u n g a l d r u g s i n v i t r o.K e y w o r d s:C a n d i d a a l b i c a n s;m o r p h o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n;a n t i f u n g a l s u s c e p t i b i l i t y;m i n i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:D I N G H o n g l e i,E-m a i l:h o n g l e i d i n g@s w u.e d u.c n;WA N G Q i n g h u a, E-m a i l:42793881@q q.c o m白色念珠菌(C a n d i d a a l b i c a n s)又名白假丝酵母菌,是广泛存在于人和动物皮肤㊁口腔㊁上呼吸道等处的一种条件性致病真菌[1]㊂家禽的白色念珠菌病又称霉菌性口炎,俗称鹅口疮,多见于幼龄鸡㊁鸽㊁火鸡和鹅,表现为上消化道黏膜形成白色假膜,甚至出现溃疡[2];造成患禽脾㊁胸腺㊁哈德氏腺㊁法氏囊㊁骨髓等免疫器官萎缩,引起免疫抑制,进而容易导致其它病原的继发感染[3]㊂人和哺乳动物较少发病㊂禽白色念珠菌病是一种条件性疾病,当菌群失调或宿主抵抗力较弱时,以及饲养管理不善和饲养环境差就会发生;以幼龄禽多发,成年禽亦有发生㊂该病发生以夏秋炎热多雨季节为甚㊂病禽和带菌禽是主要传染来源㊂病原通过分泌物㊁排泄物污染饲料㊁饮水经消化道感染㊂整体发病率不高,国内外报道较少㊂但近年来鸽白色念珠菌病的发生在我国呈上升趋势,给养鸽业带来极大经济损失㊂雏鸽感染主要是通过带菌亲鸽的 鸽乳 而传染㊂2020年10月,重庆某鸽场出现大批幼鸽喉头被黄色干酪样物堵塞无法进食,最终导致死亡的现象㊂本课题组采集样品后进行了病原分离鉴定㊁人工感染试验及药物敏感性测定,找到了引起该鸽场雏鸽发病的病原,为该鸽场此类传染病的防控提供了依据㊂1材料与方法1.1病料采集重庆某鸽场1~3周龄幼鸽出现喉头被干酪样物阻塞导致无法进食㊁最终死亡的现象㊂在该鸽场取5只有上述典型症状的幼鸽带回实验室㊂用乙醚将鸽子麻醉后剪开颈部左侧动脉放血,至血液流干净后待下一步解剖处理㊂1.2主要试剂、培养基及参考菌株快速D N A提取检测试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;3-(N-吗啡啉)丙磺酸-游离酸(3-(N-M o r p h o l i n o)p r o p a n e-s u l f o n i c a c i d,MO P S)㊁2ˑS a n T a q M a s t e r M i x购自生工生物工程(上海)股份有限公司;革兰染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;乳酸酚棉蓝染色液购自北京酷来搏科技有限公司;胎牛血清㊁R P M I1640培养基购自美国G i b c o公司;氟苯尼考购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;灰黄霉素㊁培氟沙星购自上海麦克林生化科技有限公司;水溶性两性霉素B㊁制霉菌素㊁克霉唑购自南京都莱生物技术有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂(P o t a t o d e x t r o s e a g a r,P D A)培养基购自北京索莱宝科技有限公司;酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂(Y e a s t e x t r a c t p e p t o n e d e x t r o s e a g a r,Y E P D)培养基由本实验室制备㊂白色念珠菌C M C C(F) 98001菌株购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司㊂1.3病原分离无菌操作取病鸽喉头㊁嗉囊㊁腺胃㊁肌胃㊁心㊁肺㊁肝㊁肾㊁脾,以接种环轻刮病鸽的嗉囊㊁腺胃㊁肌胃内表面以及无菌切开的喉头干酪样物㊁心㊁肺㊁肝㊁肾㊁脾内部,划线接种含1%庆大霉素P D A平板,28ħ恒温培养箱培养3~4d,每天观察菌落生长情况;待长出菌落后用接种环挑取平板上单个菌落再次划线接种含1%庆大霉素P D A平板进行纯培养,3d后观察菌落形态,并挑取单菌落进行革兰染色和棉蓝染色(根据说明书进行操作),染色后在400倍显微3003畜牧兽医学报54卷镜下镜检㊂1.4病原的分子生物学鉴定根据镜检结果,挑取对应的单菌落接种Y E P D 液体培养基,30ħ㊁200r㊃m i n-1摇床培养20h㊂取1m L菌液置于1.5m L离心管,10000r㊃m i n-1室温离心1m i n,弃上清,沉淀用快速D N A提取检测试剂盒提取分离菌株基因组,制备D N A模板㊂根据文献报道[4]设计P C R扩增引物C a F:5'-T T-T A T C A A C T T G T C A C A C C A G-3'和C a R:5'-A T C-C C G C C T T A C C A C T A C C G-3'㊂P C R反应体系: 2ˑS a n T a q P C R m i x12.5μL,C a F㊁C a R各1μL (10mm o l㊃L-1),d d H2O9.5μL,模板1μL㊂反应条件:94ħ5m i n;95ħ30s,58ħ30s,72ħ30s,共30个循环;72ħ延伸10m i n㊂1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物㊂扩增的目的片段为白色念珠菌r D N A基因间转录间隔区序列㊂扩增的片段送生工生物工程(上海)股份有限公司测序㊂测序结果进一步进行B L A S T序列比对㊂1.5芽管生成试验于载玻片上滴加5μL胎牛血清,用接种环挑取单菌落与血清混合均匀,盖上盖玻片,37ħ培养,每小时在显微镜下镜检,3h内观察到芽管生成判定为芽管生成阳性㊂1.6动物回归试验21只3日龄健康雏鸡购自重庆某种鸡场,经病原学检测为白色念珠菌阴性㊂随机取14只为试验组,其余7只为对照组㊂取分离菌C A L2020P8接种20m L Y E P D液体培养基,30ħ㊁200r㊃m i n-1培养20h,用灭菌P B S将菌液浓度调整为1ˑ107C F U㊃m L-1,以1m L㊃只-1的剂量嗉囊接种试验组鸡,对照组嗉囊注射等量灭菌P B S㊂两组鸡隔离,常规饲养㊂接种后每天观察鸡的精神㊁饮食㊁粪便等情况㊂每3d宰杀试验组鸡2只与对照组鸡1只㊂按 1.3 的方法取嗉囊和肝等组织分离病原㊂取每只鸡的嗉囊㊁肝㊁肾,保存于40m L㊃L-1甲醛固定液中,送成都里来生物医学实验中心制作组织切片,并将切片进行苏木精-伊红(h e m a t o x y l i n-e o s i n,H E)染色与高碘酸-希夫染色(p e r i o d i c a c i d-S c h i f f,P A S)染色,显微镜下观察组织学病变和病原生长情况㊂1.7药物敏感性试验根据‘肉汤稀释法抗真菌敏感性试验参考方法(第四版)“(C L S I M27-A4)[5],采用微量肉汤稀释法检测分离菌株对抗菌药物的敏感性㊂使用的抗真菌药物包括两性霉素B㊁制霉菌素㊁灰黄霉素和克霉唑,抗细菌药物包括氟苯尼考和培氟沙星㊂两性霉素B耐药折点按‘抗真菌药敏试验的流行病学临界值(第三版)“(C L S I M59)[6]耐药折点判读,制霉菌素和克霉唑耐药折点根据文献[7-8]给定的耐药折点耐药折点㊂2结果2.1菌株分离鉴定病鸽的喉头被黄色干酪样物堵塞(图1),造成其无法吞咽食物和水㊂其他组织器官无肉眼可见的病变㊂在5只病鸽的喉头干酪样物分离到5株菌,命名为C A L2020P1~C A L2020P5;在嗉囊分离到3株菌,命名为C A L2020P6~C A L2020P8㊂在腺胃㊁肌胃㊁心㊁肺㊁肝㊁肾㊁脾中未分离到病原㊂图1患鸽喉头被干酪样物堵塞F i g.1T h e l a r y n x o f t h e a f f e c t e d p i g e o n i s b l o c k e d b y c a s e o u s s u b s t a n c e分离的菌株使用白色念珠菌特异性引物进行P C R扩增,所有分离株均能扩增出与预期片段大小相同的约500b p的片段(图2)㊂扩增的r D N A基因间转录间隔区序列测序后进行B L A S T序列比对,40037期程相宁等:鸽源白色念珠菌的分离鉴定及药物敏感性分析所有菌株扩增片段的核苷酸序列完全一致,且与白色念珠菌r D N A基因间转录间隔区序列最为相似(图3),其中与白色念珠菌44(G e n B a n k a c c e s s i o nn u m b e r:O P627169.1)的序列完全一致,与其它白色念珠菌,如G m(G e n B a n k a c c e s s i o n n u m b e r: O P629553.1)㊁29_v9g_F(G e n B a n k a c c e s s i o n n u m-b e r:O P601587.1)㊁J115(G e n B a n k a c c e s s i o n n u m-b e r:O P824698.1)等的r D N A基因间转录间隔区序列的相似性也超过98.5%㊂分离菌株在含1%庆大霉素P D A平板上生长为乳白色㊁不透明㊁边缘呈放射状的菌落(图4A㊁B)㊂对分离菌株进行革兰染色,病原菌在400倍显微镜下呈卵圆形㊁黑色或粉紫色着色不均匀的革兰阳性酵母样菌体,有些长出芽体(图4C);棉蓝染色显示菌体长出长长的菌丝(图4D)和孢子(图4D,a)㊂所有分离菌在胎牛血清中孵育3h内,在显微镜下均观测到芽管生成(图4E)㊂M.D N A m a r k e r;1.阳性对照C M C C(F)98001;2.阴性对照;3.C A L2020P1;4.C A L2020P2;5.C A L2020P3;6.C A L2020P4;7.C A L2020P5;8.C A L2020P6;9.C A L2020P7;10.C A L2020P8 M.D N A m a r k e r;1.P o s i t i v e c o n t r o l C M C C(F)98001;2.N e g a-t i v e c o n t r o l;3.C A L2020P1;4.C A L2020P2;5.C A L2020P3;6.C A L2020P4;7.C A L2020P5;8.C A L2020P6;9.C A L2020P7;10.C A L2020P8图2P C R扩增白色念珠菌r D N A基因间转录间隔区序列F i g.2A m p l i f i c a t i o n o f t h e i n t e r g e n i c t r a n s c r i p t i o n a l s p a c e rs e q u e n c e o f r D N A g e n e f r o m C a n d i d a a l b i c a n sb y P C R图3分离菌r D N A基因间转录间隔区序列系统发育树F i g.3P h y l o g e n e t i c t r e e s o f t h e i s o l a t e d b a c t e r i a b a s e d o n i n t e r g e n i c t r a n s c r i p t i o n a l s p a c e r s e q u e n c e o f r D N A根据分子生物学鉴定结果㊁菌落形态和真菌形态㊁生化特性,确定分离的病原为白色念珠菌㊂2.2动物回归试验试验组鸡在接种菌株C A L2020P8后第3天出现采食量下降,嗉囊触之较为坚硬;随着感染时间延长,上述症状逐渐加重;在感染后第9天症状最严重,之后逐渐减轻;从第12天开始,部分鸡的临床症状逐渐消失,至第21天所有鸡的临床症状均消失㊂未接种病原的对照组没有出现任何临床症状㊂在感染后的第3㊁6㊁9㊁12㊁15㊁18㊁21天每天宰杀试验组鸡2只和对照组鸡1只,进行剖检㊂结果可见在感染第9天病变最为严重,嗉囊明显增厚㊁上有白色物质附着(图5);感染第12天后病变逐渐减轻且在感染第21天消失㊂2.3组织切片染色与观察将人工感染后第3㊁6㊁9㊁12㊁15㊁18㊁21天的嗉囊㊁肝㊁肾制作组织切片,分别进行H E染色和P A S 染色㊂肝㊁肾的H E切片未见任何病变,P A S染色也未见白色念珠菌感染㊂嗉囊H E染色的结果显示:感染第3天时表皮角质层开始脱落(图6A㊁F);感染第6天时表皮的鳞状上皮细胞开始变性坏死㊁脱落(图6B㊁G);感染第9天时表皮鳞状上皮细胞变性坏死现象达到高峰(图6C㊁H);感染第12天时表皮出现轻微结痂(图6D㊁I);感染第21天时表皮基本恢复,只有部分角质层未完全恢复(图6E㊁J);对照组无任何病变(图6K~O)㊂5003畜 牧 兽 医 学 报54卷A 和B .白色念珠菌在含1%庆大霉素P D A 平板的菌落形态;C .白色念珠菌革兰染色后的真菌形态;D.白色念珠菌棉蓝染色后的孢子和菌丝形态(a .白色念珠菌的孢子和菌丝形态;b .白色念珠菌的菌丝形态);E .白色念珠菌形成的芽管(a .孵育1h ;b .孵育2h ;c .孵育3h)A a n d B .C o l o n y m o r p h o l o g y o f C a n d i d a a l b i c a n s o n P D A p l a t e c o n t a i n i n g 1%g e n t a m i c i n ;C .F u n g a l m o r p h o l o g y of C a n -d i d a a l b i c a n s a f t e r G r a m s t a i n i ng ;D.M o r ph o l o g y o f s p o r e s a n d h y p h a e o f C a n di d a a l b i c a n s a f t e r c o t t o n b l u e s t a i n i n g(a .M o r p h o l o g y o f s p o r e s a n d h y p h a e o f C a n d i d a a l b i c a n s ;b .M o r p h o l o g y o f h y ph a e o f C a n d i d a a l b i c a n s );E .G e r m t u b e s o f C a n d i d a a l b i c a n s (a .I n c u b a t e f o r 1h ;b .I n c u b a t e f o r 2h ;c .I n c u b a t e f o r 3h)图4 白色念珠菌C A L 2020P 8的菌落形态㊁真菌形态及芽管生成F i g .4 C o l o n y m o r p h o l o g y ,f u n g a l m o r p h o l o g y an d g e r m t u b e f o r m a t i o n o f C a n d i d a a l b i c a n s s t r a i n C A L 2020P8A.对照组鸡的嗉囊;B .试验组鸡的嗉囊A.C r o p o f c h i c k e n f r o m c o n t r o l g r o u p ;B .C r o p o f c h i c k e n f r o m t e s t e d g r o u p图5 鸡接种白色念珠菌第9天的嗉囊病变F i g .5 C r o p l e s i o n s o f c h i c k e n i n o c u l a t e d w i t h C a n d i d a a l b i c a n s o n t h e 9t h d a yP A S 染色的结果显示:感染第3天时开始在表皮角质层出现白色念珠菌菌丝(图7A ㊁F );随着感染时间延长,菌丝数量逐渐增加(图7B ㊁G );在感染第9天时达到高峰(图7C ㊁H );之后菌丝数逐渐下降(图7D ㊁I ),并在第21天时完全消失(图7E ㊁J );在对照组嗉囊未见白色念珠菌(图7K~O )㊂2.4 药物敏感性结果测定8株白色念珠菌分离株对4种抗真菌药物和2种抗细菌药物的敏感性㊂由表1可见,分离菌株对两性霉素B ㊁制霉菌素㊁克霉唑敏感,对灰黄霉素的最低抑菌浓度(m i n i m a l i n h i b i t o r y co n c e n t r a -t i o n ,M I C )均>64μg㊃m L -1,对氟苯尼考和培氟沙60037期程相宁等:鸽源白色念珠菌的分离鉴定及药物敏感性分析A.感染3d 的嗉囊(20ˑ);B .感染6d 的嗉囊(20ˑ);C .感染9d 的嗉囊(20ˑ);D.感染12d 的嗉囊(20ˑ);E .感染21d 的嗉囊(20ˑ);F .感染3d 的嗉囊(100ˑ);G.感染6d 的嗉囊(100ˑ);H.感染9d 的嗉囊(100ˑ);I .感染12d 的嗉囊(100ˑ);J .感染21d 的嗉囊(100ˑ);K.灌服P B S 3d 的嗉囊(20ˑ);L .灌服P B S 6d 的嗉囊(20ˑ);M.灌服P B S9d 的嗉囊(20ˑ);N.灌服P B S 12d 的嗉囊(20ˑ);O.灌服P B S 21d 的嗉囊(20ˑ)A.C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 3(20ˑ);B .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 6(20ˑ);C .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 9(20ˑ);D.C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 12(20ˑ);E .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 21(20ˑ);F .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 3(100ˑ);G.C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 6(100ˑ);H.C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 9(100ˑ);I .C r o p af t e r i n f e c t i o n o n d a y 12(100ˑ);J .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 21(100ˑ);K.C r o p o n d a y 3a f t e r P B S a d m i n i s t r a t i o n (20ˑ);L .C r o p on d a y 6a f t e r P B S a d m i n i s t r a t i o n (20ˑ);M.C r o p o n d a y 9a f t e r P B S a d m i n i s t r a t i o n (20ˑ);N.C r o p o n d a y 12a f t e r P B S a d m i n i s t r a t i o n (20ˑ);O.C r o p o n d a y 21a f t e r P B S a d m i n i s t r a t i o n (20ˑ)图6 白色念珠菌感染鸡后不同时间点嗉囊的组织病理变化(H E 染色)F i g .6 H i s t o p a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f c r o p i n c h i c k e n i n f e c t e d w i t h C a n d i d a a l b i c a n s a t d i f f e r e n t t i m e p o i n t s (H E s t a i n i n g)星的M I C 均>512μg㊃m L -1㊂2.5 白色念珠菌的再分离及鉴定试验组和对照组鸡剖检后,采集喉头干酪样物㊁嗉囊进行白色念珠菌的再分离㊂刮取所有感染组鸡的两个部位接种含1%庆大霉素P D A 平板,均有菌长出;使用白色念珠菌r D N A 基因间转录间隔区序列引物,在分离菌均能扩增出270b p 左右的片段,说明能在这些部位再次分离出白色念珠菌㊂而对照组的相应部位接种1%庆大霉素P D A 平板,没有菌长出㊂3 讨 论白色念珠菌在自然界广泛存在,是健康动物上呼吸道和肠道等处的常在菌㊂尽管在健康和发病家禽中都分离到另外一些念珠菌,但白色念珠菌是导致家禽发病的最主要病原㊂念珠菌病又名鹅口疮,是一种内源性的条件性真菌病㊂禽类的念珠菌病最易发生在口腔和嗉囊㊂鸡㊁火鸡㊁鹅㊁鸽㊁珍珠鸡㊁雉㊁翎颌松鸡㊁鹌鹑㊁孔雀㊁吸蜜鹦鹉㊁小鹦鹉㊁鹦鹉和长尾小鹦鹉都有发生过念珠菌病的报道[2,9]㊂家禽念珠菌病往往呈散在发生,且主要发生于幼龄禽㊂现阶段我国家禽中发生念珠菌病的报道较为少见[10]㊂根据发病鸽场负责人介绍,近年来,我国广东省很多养鸽场出现幼鸽喉头被干酪样物堵塞,最终导致无法进食而死亡的情况㊂而该养殖场的鸽子则购自广东省曾经暴发过此类疾病的鸽场㊂根据幼鸽出现的临床症状,作者初步怀疑该病是念珠菌病或毛滴虫病㊂在病原的鉴定中,除了进行常规的菌落和病原菌形态观察,作者还通过棉蓝染色确定了分离菌菌7003畜 牧 兽 医 学 报54卷A .感染3d 的嗉囊(20ˑ);B .感染6d 的嗉囊(20ˑ);C .感染9d 的嗉囊(20ˑ);D .感染12d 的嗉囊(20ˑ);E .感染21d 的嗉囊(20ˑ);F .感染3d 的嗉囊(100ˑ);G.感染6d 的嗉囊(100ˑ);H.感染9d 的嗉囊(100ˑ);I .感染后12d 的嗉囊(100ˑ);J .感染21d 的嗉囊(100ˑ);K.灌服P B S 3d 的嗉囊(20ˑ);L .灌服P B S 6d 的嗉囊(20ˑ);M.灌服P B S 9d 的嗉囊(20ˑ);N.灌服P B S 12d 的嗉囊(20ˑ);O.灌服P B S 21d 的嗉囊(20ˑ)A.C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 3(20ˑ);B .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 6(20ˑ);C .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 9(20ˑ);D .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 12(20ˑ);E .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 21(20ˑ);F .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 3(100ˑ);G.C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 6(100ˑ);H.C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 9(100ˑ);I .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 12(100ˑ);J .C r o p a f t e r i n f e c t i o n o n d a y 21(100ˑ);K.C r o p o n d a y 3a f t e r P B S a d m i n i s t r a t i o n (20ˑ);L .C r o p o n d a y 6a f t e r P B S a d m i n i s t r a t i o n (20ˑ);M.C r o p o n d a y 9a f t e r P B S a d m i n i s t r a t i o n (20ˑ);N.C r o p o n d a y 12a f t e r P B S a d m i n i s -t r a t i o n (20ˑ);O.C r o p o n d a y 21a f t e r P B S a d m i n i s t r a t i o n (20ˑ)图7 白色念珠菌感染鸡后不同时间点嗉囊中白色念珠菌菌丝生长情况(P A S 染色)F i g .7G r o w t h o f C a n d i d a a l b i c a n s m y c e l i u m i n c r o p a f t e r i n f e c t i o n o f c h i c k e n a t d i f f e r e n t t i m e p o i n t s (P A S s t a i n i n g)丝和孢子的存在,通过芽管生成试验确定了分离菌芽管的生成㊂根据上述结果以及此次疫情的流行病学㊁病鸽的临床症状和病理剖检变化,初步判定分离的病原为白色念珠菌㊂为了进一步确认,作者扩增了白色念珠菌的r D N A 基因间转录间隔区序列,通过序列测定确定扩增的基因片段和白色念珠菌r D -N A 基因间转录间隔区序列片段的核苷酸序列完全一致㊂最终确定从发病幼鸽分离的菌株为白色念珠菌,并通过动物试验证明了分离菌株的致病性㊂作者还采集病料检查了幼鸽是否感染毛滴虫,结果在显微镜下没有观察到毛滴虫的存在㊂因此,作者确定造成该鸽场幼鸽发病的病原为白色念珠菌㊂幼鸽出生后需要母鸽喂食一个月左右才能独立采食㊂该鸽场虽然出现幼鸽念珠菌病的暴发,但未见青年鸽和母鸽发病,虽然在母鸽和青年鸽的喉头和嗉囊也能分离到白色念珠菌㊂这说明白色念珠菌主要导致不能独立进食的幼鸽发病;而对于成年鸽,白色念珠菌是其上消化道的常在病原㊂在动物回归试验中,用鸽作为感染动物是最好的选择㊂但由于鸽的养殖企业和养殖户较少,作者没有找到无特定病原体(s p e c i f i c p a t h o ge nf r e e ,S P F )鸽㊂考虑到白色念珠菌也能导致鸡发病,作者选择使用白色念珠菌阴性的雏鸡作为攻毒动物㊂试验结果表明,在幼鸽分离的白色念珠菌具有较强的致病力,能导致鸡发病㊂这进一步说明导致鸽场发病的病原是白色念珠菌㊂作者测定了分离菌株对部分抗菌药物的敏感性㊂结果显示抗细菌药物对分离菌完全无效;分离菌对两性霉素B ㊁制霉菌素和克霉唑敏感;虽然没有灰黄霉素对白色念珠菌的耐药标准,但灰黄霉素对80037期程相宁等:鸽源白色念珠菌的分离鉴定及药物敏感性分析表1 白色念珠菌分离株对4种抗真菌药物和2种抗细菌药物的药物敏感性T a b l e 1 T h e s u s c e p t i b i l i t y o f 4a n t i f u n ga l s a n d 2a n t i m i c r ob i a l s t o C a n d i d a a l b ic a n s i s o l a t e s 药物D r u g最小抑菌浓度/(μg ㊃m L -1)M I C /(μg ㊃m L -1)药敏结果构成比/%R e s u l t p r o po r t i o n /%C A L 2020P 1C A L 2020P 2C A L 2020P 3C A L 2020P 4C A L 2020P 5C A L 2020P 6C A L 2020P 7C A L 2020P 8S/W T I /S D DR /N W T折点/(μg ㊃m L -1)B r e a k po i n t s /(μg ㊃m L -1)两性霉素B A m ph o t e r i c i n B 0.50.50.50.250.50.50.50.510000ɤ2W T ȡ4N W T制霉菌素N ys t a t i n 4444424410000ɤ4S ȡ8R灰黄霉素G r i s e o f u l v i n>64>64>64>64>64>64>64>64---N A克霉唑C l o t r i m a z o l e0.250.250.250.250.250.1250.250.25100-0ɤ1S ȡ16R氟苯尼考F l o r f e n i c o l>512>512>512>512>512>512>512>512---N A培氟沙星P e f l o x a c i n>512>512>512>512>512>512>512>512---N AM I C .最小抑菌浓度;S .敏感;I .中介;R .耐药;S D D .剂量依赖性敏感;W T .野生型;N W T .非野生型;N A .目前没有该药物针对该菌种的临床折点和流行病学界值M I C .M i n i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n ;S .S u s c e p t i b i l i t y ;I .I n t e r m e d i a t e ;R .R e s i s t a n c e ;S D D .S u s c e p t i b l e -d o s e d e p e n d e n t ;W T .W i l d -t y p e ;N W T .N o n -w i l d -t y pe ;N A .N o t a v a i l a b l e9003畜牧兽医学报54卷分离菌的M I C均大于64μg㊃m L-1㊂根据药敏试验结果,鸽场投喂了制霉菌素,同时还加强了鸽场的生物安全措施,如通风㊁消毒以及粪便清理,但没有明显减少幼鸽的发病㊂作者分析出现此种情况可能有如下原因:一是由于幼鸽不能自由采食,需要母鸽喂养,因此鸽场实际是向母鸽投喂药物,再由母鸽将混有药物的饲料喂给幼鸽,这就造成幼鸽接受的药物没有达到治疗的剂量㊂二是白色念珠菌具有复杂的致病和耐药机制㊂白色念珠菌形成的生物膜对大多数已知的抗真菌药物天然具有抗性,如多烯类药物(包括制霉菌素和两性霉素B)对白色念珠菌生物膜无效[3]㊂此外,白色念珠菌还能上调药物外排泵的表达[11-12],大量分泌细胞外基质导致药物无法进入细胞内[13-14]等㊂考虑到现有药物对鸽白色念珠菌病的治疗效果,鸽场应按照‘中华人民共和国动物防疫法“要求,及时淘汰和无害化处理所有鸽㊂之后对鸽场进行彻底的消毒,直至清除鸽场中所有的白色念珠菌㊂然后再从没有暴发过传染病的鸽场购入新的鸽㊂鸽场在今后的养殖过程中也应加强生物安全措施,如入场车辆㊁人员㊁物资的清洗消毒,鸽场消毒药的选择及合适消毒频率的确定,鸽场粪便的清理等㊂此外,鸽场还可制备白色念珠菌卵黄抗体[15]饲喂种鸽,用于预防白色念珠菌感染㊂4结论从暴发某种传染病鸽场的发病幼鸽分离到8株真菌,通过分离培养㊁分子生物学鉴定和动物回归试验等确定导致该鸽场发病的病原为白色念珠菌,药物敏感性试验测定发现分离菌对两性霉素B㊁制霉菌素和克霉唑敏感㊂对鸽场投喂制霉菌素不能减少鸽的发病㊂因此建议鸽场对鸽进行淘汰和无害化处理,对鸽场进行全面彻底的消毒㊂对之后新购入鸽加强检疫和提高生物安全防控措施,以防再次发生类似疫情㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]陆承平,刘永杰.兽医微生物学[M].6版.北京:中国农业出版社,2021.L U C P,L I U Y J.V e t e r i n a r y m i c r o b i o l o g y[M].6t he d.B e i j i n g:C h i n a A g r i c u l t u r e P r e s s,2021.(i nC h i n e s e)[2] S A I F Y M.禽病学[M].苏敬良,高福,索勋,译.12版.中国农业出版社,2012.S A I F Y M.D i s e a s e s o f p o 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猪链球菌的分离与药敏试验
关键词
猪； 链球菌 ； 药敏试验 ； 耐药性
猪 链球 菌病 是 由链 球 菌感 染 所 引起 的一 种 病 。 脂 、 康凯 琼脂 培养 基和含 １ 脱 纤 绵 羊血 液 的营 麦 Ｏ 该病分 布 范围极广 ， 世界各 地均 有发 生 ， 血清 型众 养琼脂 培 养基 ， ３ 且 置 ７℃培养 ２ ￣２ 。普通琼脂 和 ０ ４ｈ 多 ， 原结构 复杂 ， 抗 是多年 来一 直 困扰 我 国养猪 业发 麦康凯 琼 脂上无 细菌 生长 ， 鲜血琼 脂平板 上 ， 出灰 长
组织中， 缓缓 转动 接 种环 ， 少 量 组 织 或 液体 涂 片 ， 取
的球 菌 。
本试 验选取 了氟 哌 酸 、 庆大 霉 素 、 链霉 素 、 卡那
先锋 Ｖ和 先锋 Ⅵ等 １ 生 产 中常 用 的抗 菌 药 的药 Ｏ种
复 青 氨 阿莫 西林 、 革兰 氏染色 后镜 检 ， 可见 革 兰 氏 阳性 成 双 或短 链 状 霉素 、 方 新诺 明 、 霉素 、 苄 青霉 素 、 将 病 料用 灭 菌 的接 种环 插 入组 织 中 ， 缓转 动 敏 片 。药敏试 验 结 果 （ １ 表 明 ， 次 试 验分 离 的 缓 表 ） 本
维普资讯
与饲 料 ２ ０ ０ ８年 第 ３
动 物 疾 病 防 治 ．５ １．
猪 链 球 菌 的分 离 与 药 敏 试 验
王 海 霞
（ 山东省招远 市 畜牧兽 医总站 ． 东招远 ２ ５ ０ ） 山 ６ ４ ０
摘要 近年 来 ， 猪链 球 菌病 的非 典 型 症 状 逐 渐 增 多 ， 菌 的 耐 药 性 逐 渐 增 强 。本 试 验 采 集 了疑 似 猪 链 球 菌 该
感染 的 一病 死 猪 的脾 和 肝 样 本 ， 行 了微 生 物 学 检 查 和 药 物 敏 感 试 验 。试 验 结 果 表 明 ： 分 离 的 链 球 菌 菌 株 已 进 所
一株链球菌的分离鉴定及药敏试验
一株链球菌的分离鉴定及药敏试验张颖（山东省博兴县畜牧兽医局山东滨州256500）2016年11月山东省某猪场发生了一种以出血性败血症、心包积液为主要特征的传染病。
该病发病突然，病程急，发病猪出现体温升高、精神沉郁、呼吸困难、结膜发绀，口鼻有泡沫状液体流出及病猪倒地不起等症状，发病急，来不及用药就出现死亡，给发病的猪场造成严重的经济损失。
采集死亡病猪肝脾及心包积液等病料经实验室进行细菌分离培养、革兰氏染色、生化特性鉴定、玻片凝聚试验、药敏试验及动物回归试验，并经PCR 检测确定为猪链球菌感染。
现报告如下：1材料与方法1.1主要试验材料病料为从山东省几个猪场采集的疑似猪链球菌感染的病猪病料，体重为18～20g 的健康小鼠购自河南大学实验动物中心。
1.2主要试剂TaqDNA 聚合酶、dNTPs 及DNA Marker DL2000等购自大连宝生物工程有限公司；胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
改良马丁肉汤培养基、琼脂粉等试剂购自北京索莱宝科技有限公司；猪链球菌的标准阳性血清、药敏纸片购自北京天坛生物公司；细菌生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司；其他化学试剂如氯仿、异丙醇和乙醇等，均为国产分析纯产品。
1.3细菌的分离培养无菌取发病猪的肝脏及心包积液用接种环划线接种于含5%绵羊血的马丁肉汤琼脂平板上，放置于37℃的CO2培养箱中培养24～48h ，观察生长情况及菌落特征。
挑取疑似菌落涂片并进行革兰氏染色，镜检。
观察细菌形态及溶血情况。
1.4细菌的生化鉴定将所分离细菌纯化培养后接种于马丁肉汤琼脂平板上，放置于37℃的CO 2培养箱培养36h ，观察是否有溶血现象。
挑取生长良好的单菌落转移接种于各个微量生化反应管，根据杭州天和微生物试剂有限公司说明书进行，观察生化反应特性，鉴定结果。
1.5玻板凝集试验将分离鉴定的疑似猪链球菌的分离菌落接种改良马丁肉汤培养基，37℃的CO 2培养箱培养24h ，取1.0mL 培养菌液，4,000r/min 离心5min ，弃上清，用适量PBS 悬浮沉淀，取20μL 悬浮菌液与等体积的无菌PBS 、猪链球菌2型阳性血清进行玻片凝集试验，同时设PBS 空白对照进行阴性对照。
青阳参内生真菌分离与鉴定
青阳参内生真菌分离与鉴定【摘要】目的：从云南民间药用植物青阳参的根、茎和叶中分离内生真菌，并进行分类鉴定。
方法：利用平板分离法分离内生真菌。
通过显微形态观察分类鉴定。
结果：从植物根、茎和叶中共分离获得34株内生真菌，其中25 株真菌经鉴定归属为5目，7 科，12个属。
结论：结果表明青阳参植物内生真菌存在多样性，不同部位内生真菌的数量、组成与种群分布存有差异。
【关键词】青阳参；内生真菌；分离；分类鉴定Isolation and Identification of Endophytic Fungi From Cynanchum Otophyllum SchneidLU Ze-bao( Chuxiong Medical College ，Chuxiong Yunnan 675005 ，China)【Abstract 】Objective ：To isolate and identify endophytic fungi from the root ，stem and leaf of Cynanchum otophyllum Schneid, which is one of Yunnan ' flok medicinal plant. Method：The methods of plate cultivation was uesd to isolate endophytic fungi. Identification of endophytic fungi was carried out by morphology. Result ：34 strains of endophytic fungi were isolatedfrom the root ，stem and leaf of plant ，which belonged to twelve genera，seven families and five orders. Conclusion ：Studies shown that the diversities of endophytic fungi in Cynanchum otophyllum Schneid made obviously a great difference inquantity ，composition and distribution.【Key words 】Cynanchum otophyllum Schneid ；Endophytic fungi ；Isolation ；Identification青阳参( Cynanchum otophyllum Schneid )是萝摩科鹅绒藤属( Cynanchum Linn. )植物，属多年生草本缠绕植物，根茎入药，一直在云南民间流传沿用，主产于云南中部、西北部和东北部地区。
兔葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验
■
【】 管远 志 ， 艾琳 ， ２ 王 李
坚 ， 医学微 生物 实验 技术［ ． 等． Ｍ１
北京 ： 化学工业 出版社 ，０ ５ １ １ １４ ２０ ：０ — ． １
２ 动物回归试验 ． ４
家兔攻毒 ２ ｈ后伤口出现炎症 ， ４
【 陆承平． ３ ］ 兽医微生物学 ． 北京 ： 中国农业出版社 ，０ １ ２０ ：
．
葡萄菌球菌是革兰氏阳性菌 ， 存在于皮肤 、 黏膜 、
＿嗍咖＿ －＿＿ 啊四圜 ．—
１ 材 料和 方 法 １１ 材 料 ．
．
．
．
肠道 、 呼吸道及 乳腺 中。致病性葡萄球菌常引起各种
化脓性疾 患、 败血症或脓毒 败血 症 ， 多种 动物和 人均 易感 染 ， 兔最为敏感。初生仔兔可 以同过 脐带感 染发
本试验结果表 明 ，分离菌为致病性兔葡萄球菌 ， 该菌对青霉素、 克林霉素、 庆大霉 素、 氨苄青霉素等敏
感 ， 磺胺 嘧 啶 、 丙 沙 星 不敏 感 。 对 环
参考 文 献 ：
【】 蔡宝详． １ 家畜传染病学【 ． Ｍ】 北京 ： 中国农业 出版社 ，０ １ ２０ ：
８－ ． ８ ９１
结果显示该菌 对青霉素 、 庆大霉素 、 苄青霉素 高度 氨 敏感 ， 磺胺嘧啶 、 对 环丙 沙星不敏感 。现将试验 结果
报告如下。
收 稿 日期 ：０ ２ ０ — ３ ２ １ － ５ ０
１ ． 细菌 的分离培 养 无菌 操作取典 型病 例 的脓 ．１ ２ 汁接种于普通琼 脂培养基和 Ｌ Ｂ培养基 中划线培养 ， ３ ℃恒温培养 ２ ｈ ７ ４ ，从 可疑的优势菌落中挑取单个菌 落进行纯化培养。
经脐带感染 ， 也可以接触传播 ， 四季均可发病 ， 但以夏
猪链球菌的分离鉴定和药敏试验
猪链球菌病 是一种 人畜共患 的急性 、热性传 染病 ，
是 由 ｃ、Ｄ、Ｅ及 Ｌ等群链球 菌引起 的猪 的多种疾病 的 总称 ，表现为急性出血性败 血症 、支气管肺 炎、心 内膜 炎 、脑膜炎、关节炎 、哺乳仔猪下痢和孕猪流产 等。 目 前世界上许多 国家均有猪链球菌病报道 ，国外 多以 Ｒ群 的猪链球菌 ２型和 ｓ群的猪链球菌 １型为主 ，而 国内则
染 病 之一 。为 此 对 从 河 南 省安 阳县 采 集 的 疑 似 猪 链 球 菌
杭州天和微生物试剂有限公 司生产 。其他生化试剂均为
市售产品 。 １１５ 试验 动 物 小 白 鼠 由河 南 安 阳 第 三 制 药 厂 实 验 ． ．
关键 词 ：猪 链 球 菌 ；药敏 试 验 ；血 清 型分 析 中图分 类 号 ：￥５ ．８ ８ ８２ 文献 标 识 码 ：Ａ 文章 编 号 ：１０ — ３ （０ ８ ７０ ６ － ０ ８１ ２０ ）０ －０ ８ ２ ６１ ０
Ｉ ｅ ｔｆｃ ｔｏ ａ ｄ Ｄｒ ｅ ｉｉｉｙ Ｔｅ ｔｏ ｔｅ ｏ ｏ ｃ ｓ ｓ ｓ ｄ ｎ ｉ ａ ｉｎ ｎ ｕｇ Ｓ ｎｓｔｖｔ ｓ ｆＳ ｒｐｔ ｃ ｃ ｕ ｕｉ ｉ Ｓ ＯＮＧ ｉｇ ｎ ’ Ｈａ— ａ ｇ
以 ｃ群 兽 疫链 球 菌 为 主 。近 几 年 ，随着 河 南 省北 部地 区
明胶 、 ． ％Ｎ Ｃ 肉汤 、ｐ ６５ ａ１ Ｈ值 ９ ６肉汤 、０ １ 美兰 牛 ． ．％ 乳 和马尿酸钠等生化培养基按兽医微生物 实验指 导所述
方 法 配置 。
１ １３ 供试菌株 ．．
Ｃ５３ ５９ ８株 ，为 ｃ群兽 疫链球菌 ，购
维普资讯
河 北 农 业科 学 ，２ ０ ，１ （ ） ８—６ ０ ８ ２ ７ ：６ ９ Ｊｕｎｌ ｆ ｅｅ Ａ ｃｌ ｒｌ ｃｅｃｓ ｏｒａ ｏ ｂｉ ｕｔ ａ Ｓｉ ｅ Ｈ ｕ ｎ 责任 编 辑 李 布 青
关于真菌耐药性与氟康唑等药物敏感性的分析研究结论汇总2
注: G-革兰阴性。
株念珠菌分离及耐药率分析《临床和实验医学杂志V ol ·4,No ·2921》王建成 许淑珍 张淑兰(首都医科大学附属北京友谊医院检验科,北京 100050)【摘 要】 目的 调查住院患者念珠菌分离率及常见抗真菌药物耐药率以指导临床合理治疗选药。
方法 用Vitek-AMS 微生物鉴定仪和科玛嘉显色培养基鉴定念珠菌,采用美国临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的肉汤稀释法进行药敏试验。
结果 2002、2003、2004年从住院患者标本中分离的念珠菌分别占同期总病原体8·0%、10·9%和14·5%。
921株念珠菌中白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌及其它念珠菌分别占56·1%、23·2%、3·9%、3·8%和13·0%。
常用抗真菌药物耐药率依次为特比奈芬(49·5%)、氟康唑(18·9%)、伊曲康唑(18·6%)、咪康唑(16·8%)、酮康唑(16·4%)、5-氟胞嘧啶(2·9%)、两性霉素B (2·3%)。
结论 2002~2004年临床标本中念珠菌分离率逐年显著上升,咪唑类抗真菌药物的耐药率较高。
【关键词】 念珠菌;抗真菌药物;耐药率中图分类号: R379·4 文献标识码: A2·3 标本来源和科室分布 从痰液分离出426株念珠菌,占46·2%;尿液313株,占34·0%;分泌物41株,占4·4%;血液18株,占2·0%,其中白色念珠菌10株,热带念珠菌3株,平滑念珠菌和克柔念珠菌各1株,其它念珠菌3株;其它标本123株,占13·4%。
内科和干部科453株,占49·2%,其中感染科108株,占11·7%;外科系统117株,占12·7%;急诊病房和ICU252株;占27·4%,其它科室99株,占10·7%。
真菌学实验报告
真菌学实验报告一.实验目的：1.1了解真菌形态的基本特征。
1.2掌握丝状真菌制片方法。
1.3掌握内生真菌的分离方法1.4掌握真菌的鉴定方法。
二.前言：真菌广泛分布于地球表面,从高山、湖泊到田野、森林，从海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。
真菌虽然不在空气中生长繁殖，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类原来生活在真菌的汪洋大海中。
当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。
真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的分析。
因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。
植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。
研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。
三.材料与方法：3.1.1材料：在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、根、花、种子或果实。
3.1.2.药品与试剂：葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。
孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。
消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。
双蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、巯基乙醇(β- Mercaptoethanol)，石英砂，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，EDTA，CTAB。
致猪乳房炎葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验
环 丙 沙星 、 可霉 素 、 氟 沙 星 、 林 氧 恩诺 沙 星 、 酸链 霉 硫 素、 红霉 素 、 阿米 卡 星 、 霉 素钾 、 青 庆大 霉 素 、 磺胺 嘧 啶钠 、
特 性 鉴 定 １ ． 药 敏 试 验 方 法 ．２ ４
１ ．． 自制 药 敏 纸 片 法 测 定 抗 生 素 敏 感 性 试 验 ． ２１ ４ 药 敏 纸 片 的 制 备 ： 燥 药 敏 纸 片 选 用 优 质 滤 纸 用 打 孑 干 Ｌ 器 制 成 直 径 ６ｍｍ 的 圆 纸 片 ． １０片 分 装 在 一 个 干 净 带 每 ０ 塞 的 小 瓶 内 ． 以 单 层 牛 皮 纸 扎 口 或 包 扎 １ １ｃ 压 灭 菌 ２ 高 ｃ ３ ０ｍｉ 再 经 ６ ～ ０ ｎ． ０ １０℃烘 干 ． 每 一 个 小 瓶 内 加 入 一 定 浓 于
于 ３ｍ１ 理 盐 水 中 ． 匀 后 与 菌 液 比 浊 管 比 浊 以 有 黑 字 生 混
普 通 肉 汤 堵 养 基 、血 液 普 通 琼 脂 培 养 基 、Ｌ 固 体 培 Ｂ 养 基 １ ＿ 药 敏 检 测 用 试 剂 ＿２ ３
的 白纸 为 背景 ， 整浊 度 与 比浊 管 （ ． 氏单位 ） 同 ⑦ 调 ０５麦 相 将 菌液 均 匀涂 布于 整个 Ｍ— Ｈ培 养基 表 面 ⑧ 待 平板 上 的
而 对 庆 大霉 素 、 酸链 霉 素 硫 青 四 磺
生素具 有较 高的 耐药性 ． 高可迭 １０ 最 ０ ％。 关键 词 ： ： 房 炎： 萄球 菌 ： 敏 试验 猪 乳 葡 药
江西省猪链球菌的分离鉴定及耐药基因、毒力基因检测分析
·研究论文·摘 要：为了解猪链球菌临床分离株的生物学特性、耐药基因与毒力基因的携带情况。
采集疑似链球菌感染病死的猪肺脏和关节液，用常规方法分离细菌，通过镜检、16S rRNA 序列测定分析、分子分型、动物实验鉴定分离菌的生物学特性，用药敏试验进行药物敏感度测定，并利用PCR 检测耐药基因及毒力基因。
结果可知，从8个养猪场的10份肺脏和关节液中共分离到10株菌，经16S rRNA 序列比对和血清分型，10株分离株均为猪链球菌，其中9型7株，1型1株，其余2株为猪豕链球菌和猪生殖道链球菌；小鼠致病性试验结果显示，分离株JXNC1906、JXJJ1904和JXNC1904的毒力较强；毒力基因检测显示，JXNC2103可检出6种毒力基因，JXNC2011株只检出mrp 毒力基因，毒力型mrp +ef -gdh +sly +mmum +Orf2+2株、mrp -ef +gdh +sly -mmum +Orf2- 4株、mrp -ef -gdh +sly -mmum +Orf2+ 1株、mrp +ef +gdh +sly -mmum +Orf2+ 1株；药敏试验结果，10株分离菌的耐药性均不强，对大观霉素、恩诺沙星、丁胺卡纳、氨苄西林和头孢曲松均在中度以上敏感；耐药基因检测结果，10株链球菌分离株均能检测出氟喹诺酮类耐药基因，除JXNC1906外，其他9株还能检测出四环素类、大环内酯类以及磺胺类耐药基因，分离菌JXNC1906检测出β-内酰胺类blaTEM 和氨基糖苷类Aph3’耐药基因，其他分离菌株可检测出vanA 、vanD 、strA 、strB 、floR 以及多重耐药基因optrA 和Lsa(E)等。
结果表明，从临床病死猪中分离的链球菌致病性高低不一，对临床常见药物仍较为敏感，不同分离株的耐药基因表型和毒力基因表型相差较大。
本实验结果为进一步研究猪链球菌的致病机理和临床有效防控措施提供基础。
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２ 年 ｌ 月 第 ｌ 第 ２ Ｉ ０１ １ ０ 卷 ＯＯ Ｊ
真菌的分 离鉴定与 试验结果分 药敏 析
周 梨 罗 媛 朱 波
四川省宜宾市第—人民医院检验科， 四川官宾 ６ ４ ０ ４０ ０
［ 要 】目的 探 讨笔者所 在医院 ３ ４株酵母样 真菌的分离培养 及药敏试验 结果 。方法 用血琼脂平板 及沙 氏培养基分离 摘 ８ 真菌 ， 用念株 菌鉴别 培养基 和酵母样 真菌 药敏试 剂盒对分 离 的 ３ ４株酵母 样真菌 进行鉴 定和药 敏 试验 。结果 ３ ４株 ８ ８ 酵母 样真 菌 以念 株菌属 为主 。其 中 自假 丝酵母菌 占 ７ ． ％ ； ２６ ６ 其次为热 带念株 菌 占 ９６ ％； 滑念珠菌 占 ９１％； ．４ 光 ．１ 克柔 念株菌 占 ２６ ％； ． ０ 近平滑念株 菌 占 １ ４ 其他 少见酵母样真 菌 占 ４９ ％。３ ４株 酵母 样真菌对伏 力康唑 、 ． ％； ０ ．５ ８ 氟康 唑 、一氟 ５ 胞 嘧 啶 、 附康 唑 、 依 １ 两性 霉素 Ｂ的敏感 率 分别 为 ６ ．０ 、６８ ％、２３ ％、８ ０ 、７２ ％ 。结论 ５ ４５ ％ ６ ．０ ９ ．２ ６ ． ％ ９ ．７ ７ 一氟 胞嘧 啶 、 两性霉 素 Ｂ是治疗酵母 样真菌感 染的首选药物 。 ［ 关键词 】 菌 ； 真 耐药率 ； 分离鉴定 ； 敏试验 药 【 中图分类号 】 ４ ６１ Ｒ４． 【 文献标 识码 】 Ｂ 【 文章编 号 】 ０ ５ ０ １ ２ １ ） ０ ｌ８ ０ ２ ９ — ６ ６（ ０ ２ 一 ０ — ２ １ 便标 本 ４ 株 ， １．０ 尿液标 本 ３ ８ 占 ２５ ％； ５株 ， ．１ 脓性分 泌 ｒ １％； ９ 物 ｌ ， ．０ 胸 腹水 ８ ， ．８ ｍ液 ２ ， ．２ ０株 占２６ ％； 株 占２０ ％； 株 ＾０５ ％； 其他标 本 １ 株 ， ２８ ％。 １ 占 ． ６ ２２ 常见真菌的菌种分布情况 ． １０ ７份送 检 标本 ， Ｈ 率 为 ２ ． ％， 离 鉴定 ｆ ３ ４株 ７ 检 ｛ ２５ ０ 分 ｆ ８ Ｊ 酵母 样真菌 ， 以似丝酵母 菌属为 主。其 中最 多的是 ｈ似丝 酵 菌 ２ ９株 ， ７ ．６ 其 次 为热 带念 珠 菌 ３ ７ 占 ２６ ％； ７株 ， ９６ ％； 占 ．４ 光 滑 念株 菌 ３ ５株 ， ９１％； 占 ．１ 克柔 念株 菌 １ ０株 ． ２６ ％； 平 占 ． ０ 近 滑念珠菌 ４ ， １ ４ 其他 少见酵母样真菌 ｌ 株 ， ．５ 株 占 ． ％； ０ ９ 占４９ ％。
【 李影林 ． ５ 】 １ 临床微牛物学 及检验 ． ２版 ． 第 北京 ： 民卫生 ｍ版礼 ， ９： １． 人 １ ５ ６９ ９
Ｉｌ１ 建 ， 友 良 真 茼 『症 １ 例 微 生 物学 及临 床 分 析 ｌＩ巾 医 学 检验 ６ 苏 ｎ ｌ ８ ｌ Ｊ
杂志 ， ９ ９ ２ ２） ９ ． １９ ， ２（ ： ７
性 的提 高及 指导临床 医生合理用 药都 具有非常 重要的意 义。
【 参考文献］
【１ 康 德 ， 慧 君 ， 玫琦 ， ． １ ｌ孙 周 王 等 １腔念 珠 菌感 染 的鉴 定 及耐 药性 分 析 『． 二 ５ Ｊ』 １
海医学 检 验杂 志 ，０２ １ ６） ３５ ２０ ，７（ ： ７．
１ ９８ １ ９ ：７ ．
于相 对平 衡状 态 ， 当长期 大量使 用 广谱抗 生 素后 ， 常菌 群 中 正
的敏感 细菌被抑 制或杀灭 ， 使病 原性真菌 （ 白假丝酵母 菌 ） 大量 繁殖 ， 导致 真菌感 染。从 ｌ７ ７份标 本 中分 离 ¨ ３ ４株酵 母样 ０ ｛８ 真 菌 ， ｍ率 为 ２ ．％， 于文献 报 道 的 ６ １％Ｉ， 明 真菌 检 ２５ 高 ％～ ０ 说 感染 的趋 势在 不断上升 ． 从表 ３中可 看 ｝ ，８ 酵母 样真菌 对 ５种抗 真菌药 物敏 ｆ ３ ４株 Ｊ
【】 海 深 ， 卫 益 ， 琴 ． 床 分离 念珠 菌 对 ５种 常用 抗 真 菌药 物 的 体 外敏 ７孔 徐 汀 临
病原 性真 菌中致病 力最强 且具有抑 制机体 免疫功 能 的能 力 ， 正
常情 况 下 ， 机体 内部 正 常菌群 与病 原微 生物 相互 抑制 生 长 ， 处
【 郭积燕 ， 奇 ． ２ 】 董 微生物 检验 技术 ［ ． 京 ： Ｍ】 北 人民卫 生…版 享 ，０ ２ — ． 十 ２０ ：１７ １８ １ １ 【】 ３ 吴绍 熙 ． 代 医 学 真 菌 检验 于册 【］北 京 ： 京 医科 大 学 联 合 …版 礼 ， 现 Ｍ． 北
菌大量繁殖 而感 染。
２ 结果
２１ 各 类标本 的检 出情 况 ３ ４株真 菌主要 来源 于呼 吸道标 本 ２ ０例 ， ７ ．１ 大 ８ ７ 占 ０３ ％；
从 表 １中可 看 出 ， 标 本 检 ｍ率 最 高 ， ７ ．１ 痰 占 ０３ ％。实 际
上痰 标 本 中 的细菌 除有 些 患者 用 呼 吸机 取样 较 纯外 ， 多数 大
真菌 感染 较顽 同， 程长 、 延反 复 、 治不 愈 、 病 迁 久 标本 重 复
分离 率 高。从 表 ２中可看 出引起 临床 真菌感 染 的种 类也 越来 越多 ， 巾念株菌感染 在住院患者 的真菌感染 巾最为常 见 １ 其 ３ １ 。
念株菌 已成为人 类最 常见 的条件致病 菌 ， 其菌血症 的死亡 率 高达 ４ ％～ ０ ４ 其 中又 以 白假丝 酵母 菌 的感 染 最常 见 １， ０ ６ ％１， １ ５ ｌ 占 ７ ．６ ， 表 ２中也 可 以看 …这一 点 。 白似 丝 酵母 菌 也 是 ２６ ％ 从
康 唑 、 性 霉 素 Ｂ的 敏 感 率 分 别 为 ６ ．０ 、６８ ％、２３ ％、 两 ４５ ％ ６ ．０ ９ ．２
６ ． ％ 、７２ ％ ， ８７ ０ ９ ．７ 见表 １ 。
表１ ３ ４ ８ 株酵 母样 真 菌的 药敏试 验 结 果
１ 材料 与方 法
１ 标 本 来 源 ． １
标本 均 来 源于 笔 者所 在 医 院住 院 患者 的深 部 咯痰 、 咽拭
［】 ｈ ａｅ Ｊ Ｖ ｔｍ ｎＫ： ｔｐ ｙｉｌ ｉａ ｒｌ ａ ｄｔ ｓｅｓ ｅ ｔ ｆ ｌ ｉａ ａ ｄ ４ Ｓ ｅｒｒ ． ｉ ｉ Ｍ ａ ｉ ｈ ｓ ｏ ｃ ｌｏｅ ｎ ｅａｓｓｍ ｎ ｏ ｉ ｃ ｌ ｎ ｓ ｏｇ ｈ ｃｎ ｓ ｂ ｌ ｉ ｌ ｅ ｃ ｎｙｓ ｔ ［ ．Ｉ Ｃ ， ５ （） ８ ． ｕ ｃ ｎｃ ｆ ｉ ｃ ｔ ｅ Ｊ ＪＦ Ｃ １９ ， １： ８ ｉ ａｄｉ ｅ ａｓ［ ９ ５
的 指导 意 义。 为 了给临 床提 供 治疗 真 菌的 有效 途径 ， ２ ０ 对 ０８
年 １月 ～２ ０年 １ ２月笔者所在 医院住院患者送检 １ ０ ７份标 ７ 本， 进行真菌 分离鉴定 和药 敏试 验分析 ， 现将结 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ报道如下 。
３ ４株酵母 样真菌 对伏 力康 唑 、 ８ 氟康唑 、一氟胞 嘧啶 、 ｉ ５ 依川
菌 ， 检 …率 大于 感 染率 。病 原 性 真菌 分 布 于 自然界 及 人 的 使
口腔 、 呼 吸 道 、 道 、 上 肠 阴道 和 皮 肤 上 ， 们 都 属 于 条 件 致 病 它
菌， 只有 当机体 免 疫 力降 低 或 菌群 失调 时 方 可 出现 临床 感 染
症 状 ｌ。 ２ ｌ
２３ 药敏 试 验 结 果 ．
似 丝 酵母 菌 是最 常 见 的条 件致 病 性 真菌 ， 通常 寄 居 于人 的 口腔 、 呼吸道 、 上 肠道及 阴道黏 膜 ， 参与正常 菌群 的构 成。随 着各种新 型抗生 素的广泛使 用 、 免疫抑 制剂及抗 肿癌药 物的应 川 、 腹膜 透析 及各 种侵 袭性操 作 、 种介 入性诊 断和 治疗 手段 各 的增 多 ， 条件性及 机会致 病性 真菌感染 率逐年 上升 …。真菌感 染 已成 为年老体 弱且 患有 慢性 基础 疾病 等特殊 人群 的严 重感 染性 疾 病。据 统计 ， 界上 约有 １ 世 ／ 人 口患有 各 种真 菌病 。 ５的 对此 已 弓 起 医学界 极大 的关注 。了解住 院患 者 中检 真菌 的 ｌ 种类 、 临床 分布及 耐药 情况 ， 预 防和治 疗真 菌感染 具有 重要 对
产品。
１ ． 真 菌 的分 离鉴 定和 药敏 试 验 ３
注 ：Ｓ表 永 敏 感 ； ｌ表 示 巾 介 ；Ｒ表 示 耐 约
３ 讨 论
本资料 示笔者所 存医院 真菌感 染以 “似 丝酵 凶 为主 ， 占 ７ ．６ 检 …标 本 多 为痰标 本 ， ２６ ％， 主要 感染 人 ｌ 为 ５ 群 ０岁 以 Ｉ 的中老年人 。具 叶绝 大部分都 是呼 吸内科患者 ， ｆ 大鄙 患 １ 他 ｆ 】
１８中 药 目医 斜手Ｃ Ｉ Ｅ ＩＩＥ Ｎ Ｈ Ｒ Ａ Ｙ ０ ＨＮ Ｍ Ｄ Ｎ ＤＰ Ａ Ｍ Ｃ Ａ Ｃ Ａ
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也 随之增 加 １。因 此对 临床 标本 分离 培养 的酵母 样 真 菌进 ９ １
１ 试 剂 和培 养 基 ． ２
粗琼脂平板 （ 郑州 安冈绿科生物有 限公司 ）念株菌鉴 别培 ， 养基（ 温州市康泰 生物科技 有限公 司 ）酵母 样真 菌药 敏试剂 盒 ， Ａ Ｂ Ｆ ＧＮ 法 同 ｂｏ ｒ ｕ ， ａ）所有产 品均 为效期 内 Ｔ ＵＮ Ｓ３（ ｉＭｅｉ ｘ ｓ ， ｅ