细菌培养主要操作程序
细菌培养主要操作程序
第一天标本接种前的准备及标本接种
从冰箱中取出当天需要的平板数量与种类适量，放入35℃温箱内烤干待用。
标本接种：
痰：用无菌棉纤挑取病变部位，于血平板和麦康凯平板涂划第二区，后用接种环划二到四区。
咽拭子:镊子钳取无菌试管中的拭子于一区，以下步骤同痰标本。
尿：用接种环分别取一环于血平板和麦康凯平板分区划线接种。
粪便：用无菌棉纤沾取病变部位分别于麦康凯和SS平板的一区划线接种，后用接种环划二至四区。
直肠拭子或其它拭子:镊子钳取无菌试管中的拭子于一区划线，以下步骤同粪便。
其它：如静脉导管等需要增菌培养后接种血平板和麦康凯平板。
化验申请单要求真菌培养则接种FV平板。
第二天观察菌落分纯初步鉴定和部分药敏试验
根据取材部位、菌落形态和生长情况涂片、转种。
杂：取优势菌转种血平板，孵育至第三天。
若为痰或咽拭子标本涂片看有无霉菌，有——报告咽菌+FV，无——报告咽菌。
粪便或直肠拭子标本为肠道正常菌群——报告未培养出肠道致病菌。
无生长：继续培养至第三天观察。
尿标本应报告细菌浓度。
纯：涂片为一种细菌，且生长良好，可直接进行初步鉴定和部分药敏试验。
如大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的生化鉴别：枸椽酸、靛基质、鸟氨酸、赖氨酸。
初步鉴定和部分药敏试验
G+球菌或球杆菌做触酶试验G－杆菌做氧化酶试验
↙↘↙↘
阳性阴性单独转G－球杆菌阳性阴性
↓↓↙↘↓↓
葡萄球菌链球菌、粪球菌（+-）非定肠定↓↓↓七叶苷（+）高盐（+）非敏肠敏葡定、敏链定、链敏链定、肠敏
第三天上机、量药敏、出报告
注：单独转的标本：链、粪肠球菌的共同点：触酶（－）、涂片G+球菌
↓、
七叶苷、高盐
↙↘
阳性阴性
↓↓
粪肠球菌链球菌
↓↓
链定、药敏（Ｍ-H）链定、药敏
（血平板即血敏，含血0.5单位的M-H）。
细菌培养及菌体收集
基因工程实验流程参考图：细菌培养及菌体收集挑取单菌落于5 ml 2216E培养基中，8℃培养，100 rpm转速，振荡120 h后，12 000 rpm 离心15 min。
弃去上清液，加入10 ml TE洗涤离心后，用10 ml TE溶解菌体，混匀，–20℃保存备用。
实验一：菌株基因组DNA的提取（CTAB 方法）CTAB/NaCL溶液配制：CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml 水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；原理：采用溶菌酶破碎细菌细胞壁，加入去污剂CTAB和EDTA消化细胞，可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
最后得到DNA。
操作流程：取3.5 ml菌悬液，加入184 μl 10% SDS，混匀，溶菌酶浓度为2mg/ml，37℃温育1 h。
加入740 μl 5 M NaCl，再加入512 μl CTAB/NaCl，混匀，65℃温育10 min。
加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10 000 rpm离心5 min，吸取上清液。
上清液中加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，10 000 rpm离心5 min，吸取上清液。
加入0.6倍异丙醇，混匀，10 000 rpm离心5 min，收集DNA沉淀，用70%乙醇洗涤DNA沉淀。
用1 ml TE溶解DNA，加入终浓度为20 μg/ml RNaseA，4℃溶解过夜，–20 ℃保存。
实验二：DNA电泳鉴定1．目的学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。
2．原理DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。
不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。
3．器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。
细菌培养基的制备、灭菌及接种、培养技术ppt课件
目的要求
掌握从环境中分离培养细菌的方法，从 而获得若干种细菌纯培养技能。 掌握几种接种技术。
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实验材料
无菌培养皿(直径90mm)10套、无菌移液管1mL2
支、10mL1支。
营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶， 无菌稀释水90mL1瓶、9mL5管。 其它：接种环、酒精灯、恒温箱。
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c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放 在37℃恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。
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实验程序4
（培养基和玻璃器材的灭菌方法）
过滤除菌法： 不能用加热灭菌的 液体物质（如维生 素、血清），一般 可用细菌过滤器进 行除菌。
19
第二部分 细菌纯种分离、培养和接
种技术
目的要求 实验材料 实验程序
9
实 验 程 序2
（培养基的配制方法和步骤） 3. 调pH值：用10％ NaOH调pH至7.6，用精 密pH试纸对照。 4. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部 倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意 不要污染棉塞和瓶口。 5. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 6. 灭菌备用：培养基灭菌后必须在37℃下恒 温培养24h，确定无菌生长，方可使用。
实验二
细菌培养基的配制、灭 菌及接种、培养技术
1
第一部分 细菌培养基的制备、灭菌
目的要求 实验材料 实验程序
2
目的要求
熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 掌握培养基和无菌水的制备方法。 掌握高压蒸气灭菌技术。
3
实验材料
药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。
高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。 其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻 璃珠等。
微生物培养及实验基本操作技术
微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。
配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。
注意事項–灭菌锅的使用①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培养基中的主要成分及其作用：营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等抑制剂：1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。
培养基的类型：●根据培养基的物理状态来区分：1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。
●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。
●根据培养基的用途来区分：➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。
菌种培养
第一章无菌操作技术第一节灭菌技术一、干热灭菌1.1、灼烧灭菌【总操作程序】主要分两个步骤：点燃火源灼烧2～3次。
具体操作如下：①点燃火源一般使用酒精灯或煤气灯，点燃酒精灯或煤气灯。
②灼烧2～3次一般右手持待灭菌的器具，在火焰的外焰上来回灼烧2～3次。
【达标标准】灭菌后的器具干燥，所有的微生物被杀死。
【注意事项】①正确使用火源，防止失火。
使用酒精灯时，先要检查灯芯，如果灯芯顶端不平或已烧焦，需要剪去少使其平整，然后检查灯里有无酒精，灯里酒精的体积应大于酒精灯容积的1/4，少于2/3。
在使用酒精灯时，应注意，绝对禁止用酒精灯引烧另一盏酒精灯，而应用燃着的火柴或木条来引燃；用完酒精灯，必须用灯帽盖灭，不可用嘴去吹灭，否则可能将火焰沿灯颈压入灯内，引起着火或爆炸。
不要碰倒酒精灯，万一洒出的酒精在桌上燃烧起来，不要惊慌，应立即用湿抹布扑盖。
灼烧时应用火焰的外焰②主要用于实验室接种针、接种环、试管口和玻璃棒等的灭菌。
涂布平板用的玻璃棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。
【相关知识】干热灭菌的原理：热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
1.2、干热灭菌【总操作程序】主要分五个步骤：装入待灭菌物品升温恒温降温开箱取物。
具体操作如下：①装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱内，关好箱门。
②升温接通电源，拨动开关，打开电热干燥箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升，当温度上升到100℃时，关闭排气孔，在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；此时如果还未达到所需的160～170℃,则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，知道达到所需温度。
③恒温当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，恒温2h。
④降温切断电源，自动降温。
⑤开箱取物待电热干燥箱内温度降到70℃以后，打开箱门，取出灭菌物品。
【达标标准】灭菌后的物品经无菌检测结果符合要求。
院感细菌培养
院感细菌培养标题：院感细菌培养引言概述：院感细菌培养是指对医院感染病例中的细菌进行培养和鉴定，以便及时采取有效的控制措施。
对院感细菌进行培养可以帮助医院了解感染病例的病原体，指导临床治疗，预防院内感染的传播。
本文将从细菌培养的原理、方法、操作步骤、结果解读和应用方面进行详细介绍。
一、细菌培养的原理1.1 细菌的生长特点：细菌是单细胞微生物，具有快速繁殖的特点，能在适宜的培养条件下迅速增殖。
1.2 营养需求：细菌在培养基中需要提供适当的营养物质，如碳源、氮源、矿物盐等，以支持其生长和繁殖。
1.3 条件要求：细菌培养需要一定的温度、湿度、氧气和pH值等条件，以创造适宜的生长环境。
二、细菌培养的方法2.1 选取培养基：根据细菌的特性选择适合的培养基，如富含血液的富营养基、选择性培养基等。
2.2 接种细菌：将患者样本或分离的纯培养物接种到培养基上，利用无菌技术避免外源性污染。
2.3 培养条件：将接种好的培养基置于恒温培养箱中，控制适宜的温度和湿度，观察细菌的生长情况。
三、细菌培养的操作步骤3.1 样本采集：从患者体液、分泌物或组织中采集样本，避免外部污染。
3.2 培养基接种：将样本接种到含有适宜营养物的培养基上，避免交叉污染。
3.3 培养观察：定期观察培养基上的细菌生长情况，记录菌落形态、颜色、大小等特征。
四、细菌培养结果的解读4.1 菌落鉴定：根据菌落的形态、气味、颜色等特征初步判断细菌种类。
4.2 生化试验：进行生化试验，如革兰氏染色、氧化酶试验等，进一步确认细菌种类。
4.3 抗生素敏感性测试：对分离出的细菌进行抗生素敏感性测试，指导临床治疗。
五、细菌培养的应用5.1 临床诊断：通过细菌培养可以明确感染病例的病原体，指导临床治疗方案的制定。
5.2 感染控制：对院内感染进行细菌培养可以及时发现感染源，采取有效控制措施，预防感染的传播。
5.3 药物研发：细菌培养结果可以为药物研发提供参考，指导新药的开发与临床应用。
厌氧菌操作流程
厌氧菌培养操作规程第一部分 标本采集和运送有厌氧菌感染指征时，需进行微生物学诊断。
而标本的采集和运送是否合格，对厌氧菌检验结果影响很大。
要求标本绝对不能被正常菌群所污染。
采集时尽量避免接触空气。
临床在进行厌氧菌培养前还应与实验室联系，做好接种培养的准备，进行床边接种或采用输送培养基。
一、标本采集标本应从正常无菌部位或通过严格无菌技术采集，血液、胸腔液、腹腔液、心包液、关节液、胆汁、脑脊液及通过外科无菌手术抽出的脓液等，与常规方法相同。
用特殊技术或方法采取的标本，采集部位与方法如下：1、肺部 肺部分泌物可经气管在环甲膜平面以下抽取，或用纤维支气管镜。
带有保护取样刷不被正常菌群污染的套管。
将取样刷剪下。
可放入运送培养基或床边直接接种。
2、胸腔 直接胸腔穿刺。
3、尿道 耻骨联合上方经皮肤穿刺膀胱抽尿。
4、脓肿 封闭性脓肿用无菌空针抽取。
如已破溃，用无菌棉拭子擦去表面脓液。
取深部分泌物。
5、女性生殖道 消毒阴道从后穹隆穿刺，取脓液。
若取子宫分泌物则用无菌导管抽取，导管外套以一个保护膜套管，插入子宫后才戳穿保护膜套管，在子宫内取标本。
6、窦道或深部伤口 用空针连着导管，尽可能深入抽取。
伤口底部、边缘和窦道壁上刮下来的组织也是很好的标本，更能反映感染的细菌。
若标本量太少，可适当加少量无菌盐水，冲洗后再吸出。
7、血液标本 毛囊和皮脂腺深部的丙酸杆菌易造成污染。
用碘酊消毒后必须等一定时间，不要立即抽血。
其它注意事项：必须通过用于厌氧菌正常栖居地才能取到的标本，如痰、支气管镜采样（无特殊保护套）、咽拭子、排出的尿及阴道拭子不能做厌氧菌培养，粪便标本厌氧菌培养．只能做难辨梭菌及肉毒杆菌的培养。
在无条件床边采样时，尽快将空针中的气体排尽，用消毒空针抽取厌氧培养标本，将针头插入无菌像皮塞。
必须用棉拭子采集的标本．可立即做床旁接种或插入运送培养基中送细菌室培养二、标本运送1、标本送入厌氧运送装置后，应尽快送到实验室，最迟不超过6小时。
医院常规细菌培养
手术室
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1
空气培养方法及标准
程序要求：在做空气培养前1小时，关闭室 内门窗，打开层流，减少室内人员走动，使 空气静止。从检验科取培养皿，途中应用包 布包裹，做培养者戴好口罩帽子，将培养皿 放于需做培养的房间内，打开5分钟。在采 样时禁止有人走动，采样结束后，盖好玻璃 培养皿，填写培养单，贴好标记，用包布包 裹后送细菌室培养。培养结果报告，由专人 保存，除霉雨季节每月做两次空气培养，其 余时间每月做一次
布点方法：如图
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2
①面积≤30平米，设一条对角线取三点， 即中间一点，两端各距墙1米处各取一点 (手术室层流手术室面积27平米）
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3
②室内面积>30平米，设两条对角线，东，
西，南，北，中取五点，其中东，西， 南北距墙均1米（飞秒手术室面积为32平 米）
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4
采样方法：用9cm直径普通培养皿放在 采样点暴露5 分钟后送检培养
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10
医护人员手采样 采样时间：在接触病人、从事医疗活 动前进行采样。 结果计算：手细菌菌落总数=平皿上菌 落的平均数×采样液稀释倍数
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11
采样方法
剪指甲、洗手 着装整洁，帽子遮住全部头发，口罩遮盖口鼻； 取一支灭菌棉拭子，取标记“手”的试管 盖严试管 嘱被检人五指并拢 将浸有无菌生理盐水采样液的棉试子一支在双手指 曲面从指根到指端来回涂擦各两次，并随之转动采 样棉试子,五指分开,涂擦指缝、指尖
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6
看表、5分钟；
取平皿
注意事项:放平皿时先放最里边（内边 ），收取时先收最外边点上的平皿
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7
细菌培养主要操作程序
细菌培养主要操作程序第一天标本接种前的准备及标本接种从冰箱中取出当天需要的平板数量与种类适量，放入35℃温箱内烤干待用。
标本接种：痰：用无菌棉纤挑取病变部位，于血平板和麦康凯平板涂划第二区，后用接种环划二到四区。
咽拭子:镊子钳取无菌试管中的拭子于一区，以下步骤同痰标本。
尿：用接种环分别取一环于血平板和麦康凯平板分区划线接种。
粪便：用无菌棉纤沾取病变部位分别于麦康凯和SS平板的一区划线接种，后用接种环划二至四区。
直肠拭子或其它拭子:镊子钳取无菌试管中的拭子于一区划线，以下步骤同粪便。
其它：如静脉导管等需要增菌培养后接种血平板和麦康凯平板。
化验申请单要求真菌培养则接种FV平板。
第二天观察菌落分纯初步鉴定和部分药敏试验根据取材部位、菌落形态和生长情况涂片、转种。
杂：取优势菌转种血平板，孵育至第三天。
若为痰或咽拭子标本涂片看有无霉菌，有——报告咽菌+FV，无——报告咽菌。
粪便或直肠拭子标本为肠道正常菌群——报告未培养出肠道致病菌。
无生长：继续培养至第三天观察。
尿标本应报告细菌浓度。
纯：涂片为一种细菌，且生长良好，可直接进行初步鉴定和部分药敏试验。
如大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的生化鉴别：枸椽酸、靛基质、鸟氨酸、赖氨酸。
初步鉴定和部分药敏试验G+球菌或球杆菌做触酶试验G－杆菌做氧化酶试验↙↘↙↘阳性阴性单独转G－球杆菌阳性阴性↓↓↙↘↓↓葡萄球菌链球菌、粪球菌（+-）非定肠定↓↓↓七叶苷（+）高盐（+）非敏肠敏葡定、敏链定、链敏链定、肠敏第三天上机、量药敏、出报告注：单独转的标本：链、粪肠球菌的共同点：触酶（－）、涂片G+球菌↓、七叶苷、高盐↙↘阳性阴性↓↓粪肠球菌链球菌↓↓链定、药敏（Ｍ-H）链定、药敏（血平板即血敏，含血0.5单位的M-H）。
厌氧菌操作流程
厌氧菌培养操作规程第一部分 标本采集和运送有厌氧菌感染指征时，需进行微生物学诊断。
而标本的采集和运送是否合格，对厌氧菌检验结果影响很大。
要求标本绝对不能被正常菌群所污染。
采集时尽量避免接触空气。
临床在进行厌氧菌培养前还应与实验室联系，做好接种培养的准备，进行床边接种或采用输送培养基。
一、标本采集标本应从正常无菌部位或通过严格无菌技术采集，血液、胸腔液、腹腔液、心包液、关节液、胆汁、脑脊液及通过外科无菌手术抽出的脓液等，与常规方法相同。
用特殊技术或方法采取的标本，采集部位与方法如下：1、肺部 肺部分泌物可经气管在环甲膜平面以下抽取，或用纤维支气管镜。
带有保护取样刷不被正常菌群污染的套管。
将取样刷剪下。
可放入运送培养基或床边直接接种。
2、胸腔 直接胸腔穿刺。
3、尿道 耻骨联合上方经皮肤穿刺膀胱抽尿。
4、脓肿 封闭性脓肿用无菌空针抽取。
如已破溃，用无菌棉拭子擦去表面脓液。
取深部分泌物。
5、女性生殖道 消毒阴道从后穹隆穿刺，取脓液。
若取子宫分泌物则用无菌导管抽取，导管外套以一个保护膜套管，插入子宫后才戳穿保护膜套管，在子宫内取标本。
6、窦道或深部伤口 用空针连着导管，尽可能深入抽取。
伤口底部、边缘和窦道壁上刮下来的组织也是很好的标本，更能反映感染的细菌。
若标本量太少，可适当加少量无菌盐水，冲洗后再吸出。
7、血液标本 毛囊和皮脂腺深部的丙酸杆菌易造成污染。
用碘酊消毒后必须等一定时间，不要立即抽血。
其它注意事项：必须通过用于厌氧菌正常栖居地才能取到的标本，如痰、支气管镜采样（无特殊保护套）、咽拭子、排出的尿及阴道拭子不能做厌氧菌培养，粪便标本厌氧菌培养．只能做难辨梭菌及肉毒杆菌的培养。
在无条件床边采样时，尽快将空针中的气体排尽，用消毒空针抽取厌氧培养标本，将针头插入无菌像皮塞。
必须用棉拭子采集的标本．可立即做床旁接种或插入运送培养基中送细菌室培养二、标本运送1、标本送入厌氧运送装置后，应尽快送到实验室，最迟不超过6小时。
细菌的人工培养
任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；
常规高压蒸汽灭菌： 1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟；0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟
培养基制备的一般程序
调配
培养基灭菌
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟
溶化
矫正pH
★ 含糖培养基：113 ℃灭菌15分钟 过滤澄清 ★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次 分装 灭菌 检定 ★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
保存
1、选用和设计培养基的原则和方法
目的明确 营养协调 理化条件适宜
经济节约
1）目的明确
根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。
培养化能自养型的氧化硫杆菌的培养基组成为： S 10g MgSO4.7H2O 0.5g NH4)2SO4 0.4g CaCl2 0.25g H2O 1000ml FeSO4 0.01g H2PO4 4g
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生物的 基础理论和应用方面的研究
含有一般微生物生长繁殖所 需的基本营养物质的培养基 按 用 途 不 同 划 分 基础培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的 一类营养丰富的培养基。特殊营养物质包括血 液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等 在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质， 用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体 抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物 中分离出来的培养基 的生长
4）经济节约
以粗代精
以氮代朊
以野代家
以废代好 以简代繁
以纤代糖