实验十七 血清尿素的测定(二乙酰一肟法)
测定血清尿素的实验报告
一、实验目的1. 掌握血清尿素测定的原理和方法。
2. 熟悉二乙酰-肟法测定血清尿素氮的实验操作。
3. 了解实验中可能出现的误差及其处理方法。
二、实验原理血清尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）是血液中尿素氮的浓度，是反映肾功能的重要指标。
尿素氮是蛋白质代谢的终产物，主要由肝脏产生，通过肾脏排泄。
二乙酰-肟法是一种常用的测定血清尿素氮的方法，其原理如下：在酸性反应环境中加热，尿素与二乙酰缩合，生成色素原二嗪，称为Feorin反应。
因为二乙酰不稳定，所以通常由反应系统中二乙酰-肟与强酸作用，产生二乙酰，二乙酰与尿素反应，综合生成红色的二嗪。
其颜色的深浅与血清中尿素含量成正比。
三、实验材料1. 试剂：- 碱性试剂：在三角烧瓶中加蒸馏水约100ml，然后加入浓硫酸44ml及85%H3PO466ml冷至室温，加入硫氨脲50mg及硫酸镉2g溶解后加蒸馏水稀释至1升，置棕色瓶放冰箱保存，可稳定半年。
- 二乙酰-肟溶液：称取二乙酰-肟20g，加蒸馏水约900ml溶解后，再用蒸馏水稀释至1升置棕色瓶中，贮存放于冰箱内可保存半年不变。
- 尿素标准贮存液（100mmol/L）：称取干燥纯尿素（MW60.06）0.6g，溶解于水中并稀释至100毫升，加0.1g叠氮钠防腐，置冰箱内稳定六个月。
- 尿素标准应用液（5mmol/L）：取5.0ml贮存液用去氨蒸馏水稀释至100ml。
2. 仪器：- 分光光度计- 离心机- 实验室试管四、实验步骤1. 标准曲线的绘制：- 取5支试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0ml尿素标准应用液，用去氨蒸馏水稀释至5.0ml。
- 向每支试管中加入2.0ml碱性试剂，混匀。
- 将试管置于沸水中加热5分钟，取出冷却至室温。
- 以540nm波长，1cm光程，测定各管吸光度。
- 以尿素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定：- 取2支试管，分别加入0.5ml血清和0.5ml尿素标准应用液，用去氨蒸馏水稀释至5.0ml。
二乙酰一肟法测尿素的原理
二乙酰一肟法测尿素的原理二乙酰一肟法是一种常用于测定尿素含量的方法。
该方法基于尿素能与二乙酰一肟发生反应生成氨基脲的原理。
下面将详细介绍二乙酰一肟法测尿素的原理。
尿素是生物体代谢产物，也是一种重要的氮源。
测定尿素的含量对于了解生物体的氮代谢及肾功能等具有重要意义。
二乙酰一肟法是一种常用的尿素测定方法，其基本原理为将尿素与二乙酰一肟发生酰化反应，生成氨基脲。
具体的操作步骤如下：1. 取一定量的尿液样品，加入适量的三氯乙酸，使尿液中的尿素脱氢酶等酶失活。
2. 加入适量的二乙酰一肟试剂，与尿素发生反应生成氨基脲。
二乙酰一肟试剂的作用是使尿素与一肟酯发生酰化反应，生成稳定的酰尿素化合物。
3. 反应结束后，在碱性条件下，氨基脲水解，生成氨气。
可以利用此氨气的生成量来测定尿素的含量。
4. 使用比色法或者气相色谱法等进行测定，根据标准曲线计算出尿液中的尿素含量。
二乙酰一肟法测尿素的原理主要基于尿素与二乙酰一肟反应生成酰尿素的特性。
此反应是一个酯化反应，发生在酸性条件下。
二乙酰一肟试剂作为试剂，可反应生成具有稳定性和可检测性的酰尿素化合物。
此后，在碱性条件下，酰尿素水解生成氨气。
为了提高测定的准确性，二乙酰一肟法还可以结合其他方法进行测定。
例如，可以在水解反应结束后，用酚酞指示剂测定氨气生成量的酸度滴定法，或者使用离子选择电极进行电位测定。
这些方法可以更加准确地测定尿素的含量。
总结起来，二乙酰一肟法是通过尿素与二乙酰一肟试剂发生酰化反应生成氨基脲，再经过水解反应生成氨气来测定尿素含量的一种方法。
这种方法简单、灵敏且准确，因此被广泛应用于尿液中尿素含量的测定。
血清尿素浓度实验报告
1. 熟悉血清尿素浓度测定的原理和方法。
2. 掌握生物化学实验的基本操作技能。
3. 了解血清尿素浓度与肾功能、蛋白质代谢的关系。
二、实验原理尿素是人体蛋白质代谢的终末产物，主要由肝脏合成，通过血液运输至肾脏排泄。
血清尿素浓度可以反映肾脏的滤过功能。
本实验采用二乙酰法测定血清尿素浓度，其原理是：在强酸条件下，二乙酰与尿素缩合成红色的二甲基氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。
三、实验材料1. 血清标本：收集患者空腹静脉血，分离血清。
2. 试剂：二乙酰试剂、硫酸、生理盐水、标准尿素溶液等。
3. 仪器：分光光度计、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 准备工作：将试剂、仪器等实验用品准备齐全，并校准分光光度计。
2. 标准曲线制作：取一系列标准尿素溶液，分别加入二乙酰试剂，室温反应一定时间后，用分光光度计测定吸光度。
以尿素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样品测定：取血清标本，加入二乙酰试剂，室温反应一定时间后，用分光光度计测定吸光度。
4. 计算血清尿素浓度：根据标准曲线，查得样品的吸光度对应的尿素浓度，即为血清尿素浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线：制作的标准曲线线性良好，相关系数R²大于0.99。
2. 样品测定：按照实验步骤对血清标本进行测定，得到吸光度值。
3. 血清尿素浓度计算：根据标准曲线，查得样品的吸光度对应的尿素浓度。
1. 实验过程中，要注意避免试剂污染，保证实验结果的准确性。
2. 标准曲线的制作要保证足够的浓度梯度，以便在测定过程中有足够的准确度。
3. 血清尿素浓度受多种因素影响，如肾功能、蛋白质摄入量、代谢分解情况等。
本实验测定的血清尿素浓度仅供参考，具体病情需结合临床综合判断。
七、实验结论通过本次实验，我们成功掌握了血清尿素浓度测定的原理和方法，了解了血清尿素浓度与肾功能、蛋白质代谢的关系。
在实验过程中，我们要严格遵守实验操作规程，确保实验结果的准确性。
八、实验建议1. 在实验过程中，加强实验室安全管理，防止意外事故发生。
二乙酰一肟法测定血清尿素(精)
3) 肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿 素含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱 肿瘤致使尿道受压等。
2．血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者 外，常见于肝功能衰竭患者。
【注意事项】
1．试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽 稳定性，但仍有轻度褪色现象，(每小时小于5%)。煮沸显色 经冷却后，应及时比色。
2．尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离 子水作50倍以上稀释。
3．尿素浓度以前习惯用尿素氮mg/dl表示，因为一个尿素分 子中有2个氮原子，所以1mmol尿素相当于28mg尿素氮 (1mmol/L尿素相当于2.8mg/dL尿素氮)；另外还有以尿素氮 mmol/L表示，则1mmol/L尿素＝2mmol/L尿素氮。世界卫生 组织推荐尿素用mmol/L表示，我国卫生部临检中心也已规 定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。
【原理】本实验采用二乙酰一肟法测定血清尿素氮。二乙酰 一肟法系根据双乙酰与尿素形成二嗪衍生物的有色复合物 的显色反应。由于双乙酰本身不稳定，故用二乙酰一肟来 代替，其反应式如下：
二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰 不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。
3．二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它 化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然 也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少 引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高，但这些色素的 最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。胆红素达171μmol/L、血红蛋 白达10g/L入物(ml) 空白管 标准管 测定管 基础管 回收管
测血清尿素含量实验报告
一、实验目的1. 掌握血清尿素含量测定的原理和方法；2. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能；3. 了解血清尿素在临床医学中的意义。
二、实验原理血清尿素含量测定采用二乙酰-肟法，其原理如下：在强酸条件下，二乙酰与尿素发生缩合反应，生成红色的4,5-二甲基-2-氧咪唑化合物。
该化合物的颜色深浅与尿素的含量成正比。
通过比色法，可以计算出血清中尿素的含量。
三、实验材料1. 试剂：二乙酰-肟试剂、血清、盐酸、氢氧化钠、蒸馏水等；2. 仪器：紫外可见分光光度计、移液器、试管、试管架等。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制：（1）取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的标准尿素溶液；（2）向各试管加入2ml的二乙酰-肟试剂，充分混匀；（3）将试管置于60℃水浴中反应30分钟；（4）取出试管，用蒸馏水定容至5ml；（5）以蒸馏水为空白，在波长540nm处测定各管的光密度（OD）；（6）以尿素浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血清尿素含量测定：（1）取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的血清样本；（2）按照标准曲线绘制步骤中的操作，进行反应和测定；（3）以蒸馏水为空白，在波长540nm处测定各管的光密度（OD）；（4）根据标准曲线，计算血清中尿素的含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：绘制标准曲线，结果显示尿素浓度与光密度呈线性关系，相关系数R²=0.998。
2. 血清尿素含量测定：根据标准曲线，计算各血清样本中尿素的含量，结果如下：样本1：尿素含量为5.2mmol/L；样本2：尿素含量为6.8mmol/L；样本3：尿素含量为7.4mmol/L；样本4：尿素含量为8.2mmol/L；样本5：尿素含量为9.0mmol/L；样本6：尿素含量为10.0mmol/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，二乙酰-肟试剂的浓度、反应时间、温度等因素对实验结果有较大影响，应严格控制实验条件，以保证结果的准确性。
实验十七 血清尿素的测定(二乙酰一肟法)
实验十七 血清尿素的测定（二乙酰一肟法）【目的】1. 掌握血清尿素的测定原理和方法。
2. 了解尿素测定的参考范围及临床意义。
【原理】尿素（urea ）在强酸、加热的条件下，与二乙酰缩合生成红色的二嗪化合物（Fearon 反应），其颜色深浅与尿素含量成正比。
与同样处理的标准液在540nm 处比色，求得尿素含量。
由于二乙酰不稳定，一般由二乙酰一肟与强酸作用产生。
其反应式如下：CH 3CH 3O O +H 2OH +CH 3CH 3O N OH +NH 2OH二乙酰一肟二乙酰羟胺CH 3CH 3O O 二乙酰+C ON H 2NH 2尿素H +CH 3C C 3N N C O+H 2O2二嗪衍生物【器材】试管、试管架、微量加样器及吸量管、沸水浴、分光光度计。
【试剂】 1．酸性试剂在三角烧瓶中加去离子水约100ml ，然后缓慢加入浓硫酸44ml 、85%磷酸66ml ，冷至室温，加入氨基硫脲50mg 及硫酸镉(CdSO4·8H 2O)2g ，溶解后移入1L 容量瓶中，加去离子水至1L 。
置棕色瓶中，4℃可保存半年。
2．二乙酰一肟溶液称二乙酰一肟20g 溶于去离子水中并定容至1L 。
置棕色瓶中，4℃可保存半年。
3．尿素标准贮存液(100mmol/L)精确称取于60～65℃干燥恒重的尿素(MW 为 60.06)0.6g ，溶解于无氨去离子水，并定容至100ml ，加0.1g 叠氮钠防腐，4℃可保存6个月。
4．尿素标准应用液(5mmol/L)取5ml上述贮存液用无氨去离子水稀释至100ml。
【操作】取试管3支，按下表操作：表3-19 血清尿素测定加入物 (ml) 空白管标准管测定管血清－－0.02尿素标准应用液－0.02 －去离子水0.02 －－二乙酰一肟溶液0.5 0.5 0.5酸性试剂 5.0 5.0 5.0混匀，置沸水浴加热 12分钟，取出置冷水中冷却 5分钟，以空白管调零，在 540nm 波长处读取各管吸光度。
血清尿素测定(精)
样本（微升） 校准液（微升） 蒸馏水（微升） 试剂R1（微升） 试剂R3（微升）
测定 10
50 1000
混匀，置37摄氏度水浴恒温5分钟 试剂R4（微升） 1000
校准 10 50 1000
1000
空白
10 50 1000
1000
混匀，置37摄氏度水浴恒温5分钟，600纳米波长，以空白管调零，测定 各管吸光度值。
血清尿素测定
尿素的测定方法
尿素（urea）是氨基酸分解代谢的最 终产物，在肝脏合成，通过血液运至肾 脏，从尿中排除。检测尿素的方法有二 乙酰一肟法和酶法。二乙酰一肟法操作 简便，仍为大多数基层医疗单位所采用。
脲酶波氏法是我们今天实验课所选用的 酶法。
பைடு நூலகம்
实验原理
脲酶水解样本中的尿素，产生两分子氨和一分 子的二氧化碳。氨在碱性条件下与酚及次氯酸 反应，在亚硝基铁氰化钠催化作用下生成蓝色 化合物，与经过同样处理的校准液进行比较， 即可计算出样本中尿素的含量。（终点法）
方法局限性
1.尿液尿素也可用此法测定，但因浓度 高（超过28mmol/L），需先用去离子 水稀释。
再乘以稀释倍数。 2.试剂变混浊或空白吸光度大于0.150，
将不能使用，应弃去。 3.所用试验器材必须清洁，避免氨污染。 4.试剂含化学成分，应避免氨污染。
环功能不全、心功能不全，休克等引起肾血流 量减少，肾小球滤过率减低而使血中尿素潴留； ②肾性：急性肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能 衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎都可出现血 中尿素含量增高。③肾后性疾患：如前列腺肿 大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道 受压等都可能使尿路阻塞引起血液中尿素含量 增加。 2.血清尿素减少 较少见，尿素减少表示严重 肝病，如肝炎合并广泛性肝坏死。
二乙酰一肟法
二乙酰一肟法在临床检验上和卫生检验上测定尿素的区别
项目 方法名称 显色颜色 吸光度比色波长 试剂瓶要求 稀释样品 加热时间 临床检验 二乙酰一肟法 红色 540nm 无特殊 不需要 较短，10-15分钟 卫生检验 二乙酰一肟安替比林法 黄色 460nm
需用棕色的具塞比色管
需要，并按稀释倍数求 出原样品中尿素的浓度 较长，45-55分钟
在卫生检验方面：
1、增加沸水浴时间，由50min缩短为20min[5]； 2、由于反应所使用的具塞比色管较难买到，可使用普通透 明比色管并在外面套上黑色塑料袋来代替棕色比色管[6]； 3、扩大标准曲线，将定容体积由25ml改为10ml，并加入稳 定剂异丙醇，从而使线性范围变宽，吸光度的值增大[7]。
混匀后，置沸水浴中加热12min，取出，置冷水中冷却5min后，用分光 光度计540nm，以空白管调至零点，读取标准管及测定管吸光度。
卫生检验
在卫生检验方面，可用于如掺伪食品中的尿素检 验，也可用于肥料中的尿素检验等。现重点研究在 游泳池水中的尿素检验。 游泳池水中的尿素检验属于公共场所卫生检验， 有国家规定的标准检验方法：二乙酰一肟安替比林 法（GB/T 18204.29-2000）。 原理：尿素与二乙酸一肟及安替比林反应呈现 黄色 ，在波长460nm处有最大吸收峰。
参考文献
[1] 李影林，中华医学检验全书，第一版，人民卫生出版社，1996，698 [2] 潘忠孝，邸秋媛，高炳德，王洪兰，血清尿素测定_二乙酰一肟改良法，中 国医科大学学报，1988，17（3） [3] 徐致义，血清尿素氮的二乙酰一肟56℃保温测定法，临床检验杂志，1988， 6（4） [4] 冯敬池，尹济群，马树臣，二乙酰一肟改良法测定学尿素，河北医科大学 学报，1998，19（5） [5] 王益萍，陈海红，沈仁富，陈金斌，陈宇鸿,二乙酰一肟分光光度法测定游 泳池水中的尿素含量，中国卫生检验杂志，2012，22（3） [6] 刘晨阳，张梅君，透明比色管在尿素测定中的应用，环境与健康杂志，1999， 16（2） [7] 张雪梅，游泳池水中尿素检测方法改进，中国卫生检验杂志，2009，19（10）
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实验十七 血清尿素的测定
（二乙酰一肟法）
【目的】
1. 掌握血清尿素的测定原理和方法。
2. 了解尿素测定的参考范围及临床意义。
【原理】
尿素（urea ）在强酸、加热的条件下，与二乙酰缩合生成红色的二嗪化合物（Fearon 反应），其颜色深浅与尿素含量成正比。
与同样处理的标准液在540nm 处比色，求得尿素含量。
由于二乙酰不稳定，一般由二乙酰一肟与强酸作用产生。
其反应式如下：
C
H 3CH 3
O O +H 2O
H +
C
H 3CH 3O N OH +
NH 2OH
二乙酰一肟二乙酰
羟胺
C
H 3CH 3
O O 二乙酰
+
C O
N H 2N
H 2尿素
H +
CH 3
C C 3
N N C O
+
H 2O
2二嗪衍生物
【器材】
试管、试管架、微量加样器及吸量管、沸水浴、分光光度计。
【试剂】 1．酸性试剂
在三角烧瓶中加去离子水约100ml ，然后缓慢加入浓硫酸44ml 、85%磷酸66ml ，冷至室温，加入氨基硫脲50mg 及硫酸镉(CdSO4·8H 2O)2g ，溶解后移入1L 容量瓶中，加去离子水至1L 。
置棕色瓶中，4℃可保存半年。
2．二乙酰一肟溶液
称二乙酰一肟20g 溶于去离子水中并定容至1L 。
置棕色瓶中，4℃可保存半年。
3．尿素标准贮存液(100mmol/L)
精确称取于60～65℃干燥恒重的尿素(MW 为 60.06)0.6g ，溶解于无氨去离子水，并定容至100ml ，加0.1g 叠氮钠防腐，4℃可保存6个月。
4．尿素标准应用液(5mmol/L)
取5ml上述贮存液用无氨去离子水稀释至100ml。
【操作】
取试管3支，按下表操作：
表3-19 血清尿素测定
加入物 (ml) 空白管标准管测定管
血清－－0.02
尿素标准应用液－0.02 －
去离子水0.02 －－
二乙酰一肟溶液0.5 0.5 0.5
酸性试剂 5.0 5.0 5.0
混匀，置沸水浴加热 12分钟，取出置冷水中冷却 5分钟，以空白管调零，在 540nm 波长处读取各管吸光度。
【计算】
血清尿素 (mmol/L) ＝ 测定管吸光度
标准管吸光度
× 5
【正常参考范围】
1.78～7.14mmol/L
【临床意义】
尿素是蛋白质分解代谢的终产物，在肝中合成，由血液运输到肾随尿排泄。
血液尿素浓度增高有生理性和病理性两方面因素。
1.生理因素高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。
血清尿素浓度男性比女性平均高0.3～0.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。
成人日间生理变异平均为0.63mmol/L。
2.病理因素
（1）肾前性：最重要的原因是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤过率减低而致血液尿素浓度增加。
见于剧烈呕吐、肠梗阻、幽门梗阻和长期腹泻等。
（2）肾性：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎等使肾小球滤过降低，而使血液尿素含量增高。
（3）肾后性：尿路阻塞可引起血液中尿素含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。
血尿素浓度降低常见于肝功能衰竭患者。
【结果及分析】
【思考题】
1. 什么是NPN，血清中NPN包括哪些物质？
2. 目前临床上常用于检查肾功能的生物指标有哪些？。