保肾通络方对DN模型小鼠肾脏病理改变及足细胞损伤的影响研究

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病最主要的微血管病变之一，已成为欧美发达国家终末期肾病的首要原因[1]。

据统计我国糖尿病患者中DN的发病率已占39.7%[2]。

尽管我们已经采取积极的早期临床干预，但是并没有有效地阻止DN的进展。

因此探讨DN的发病机制，探寻新的保肾通络方对DN模型小鼠肾脏病理改变及足细胞损伤的影响研究崔方强1赵文景1高彦彬2王悦芬1朱智耀2孟元1蔡朕1杨增坤3（1.首都医科大学附属北京中医医院，北京100010；2.首都医科大学中医药学院，北京100069；3.德州市平原县恩城镇卫生院，山东德州253103）摘要 目的：探讨保肾通络方对糖尿病肾病（DN）模型小鼠肾脏病理改变及足细胞损伤的影响。

方法：KK-Ay小鼠随机分为模型组、保肾通络方组、缬沙坦组，另外选取10只C57BL/6J小鼠作为正常对照组。

KK-Ay小鼠予高脂饲料喂养4周，造成糖尿病肾病（DN）小鼠模型，C57BL/6J小鼠予普通饲料喂养。

造模成功后，保肾通络方组按生药20g/kg每日灌胃，缬沙坦组按10mg/kg每日灌胃，正常对照组和模型组灌胃等量蒸馏水。

实验期间正常对照组普通饲料自由饮食，其他各组高脂饲料自由饮食，连续干预12周。

比较干预前和干预4、8、12周时各组小鼠24h尿蛋白定量，比较各组小鼠干预12周后血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）水平以及肾脏足细胞裂孔隔膜蛋白（nephrin）、结蛋白（desmin）的蛋白和mRNA表达，观察各组小鼠肾组织苏木精-伊红（HE）、过碘酸雪夫（PAS）染色后病理形态。

结果：与正常对照组相比，模型组小鼠24h尿蛋白定量和Scr、BUN水平明显升高（P<0.05）；与模型组相比，保肾通络方组与缬沙坦组小鼠上述指标明显降低（P<0.05）。

与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织体积增大，系膜细胞增生，细胞外基质增多；与模型组比较，给药组小鼠肾组织体积减小，系膜细胞数目减少，细胞外基质增生减轻。

与正常对照组相比，模型组小鼠足细胞nephrin蛋白及mRNA表达水平下调（P<0.05），desmin蛋白及mRNA表达水平上调（P<0.05）；与模型组相比，给药组小鼠足细胞nephrin蛋白及mRNA表达水平上调（P<0.05），desmin蛋白及mRNA表达水平下调（P<0.05）。

保肾通络方组与缬沙坦组上述指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

结论：保肾通络方可以降低DN模型小鼠尿蛋白水平，改善肾功能，减轻肾脏病理改变，延缓DN进展，其分子机制可能与上调DN小鼠足细胞nephrin蛋白表达，下调desmin蛋白表达，减轻足细胞损伤有关。

关键词 保肾通络方；糖尿病肾病；肾；足细胞损伤；病理学；小鼠；实验研究；雄性中图分类号R289.5文献标志码A文章编号1672-397X（2019）08-0082-04基金项目 国家自然科学基金青年项目（81703989）；北京市自然基金面上项目（7182069，7172096）[11] T IMMES T R，ROTHBAUM R，KIRTI，et al.Gastrin-releasing peptide-expressing nerves comprise subsets o f human cutaneous Aδ and C fibers that May s ense pruritus[J].J Invest Dermatol，2013，133（11）：2645.[12] M AO Q，SHI L，WANG Z G，et al.Chemical profiles a nd pharmacological activities of Chang-Kang-Fang，a multi-herb Chinese medicinal formula，for treating i rritablebowel syndrome[J].J Ethnopharmacol，2017，201：123. [13] D E VADDER F，PLESSIER F，GAUTIER-STEIN A，et al.Vasoactive intestinal peptide is a local mediatorin a gut-brain neural axis activating intestinal g luconeogenesis[J].Neurogastroenterol Motil，2015，27（3）：443.[14] Y ISSACHAR N，ZHOU Y，UNG L，et al.An intestinalorgan culture system uncovers a role for the nervous s ystem in microbe-immune crosstalk[J].Cell，2017，168（6）：1135.第一作者：杨璐（1984—），女，医学硕士，主治中医师，研究方向为中医脾胃病。

通讯作者：刘万里，博士，主任中医师，博士研究生导师。

1480537828@修回日期：2019-03-29编辑：吴 宁doi：10.3969/j.issn.1672-397X.2019.08.028治疗靶点显得至关重要。

研究表明，足细胞损伤是导致DN患者蛋白尿产生及肾脏病理改变的重要病理机制[3-5]。

裂孔隔膜蛋白（nephrin）是足细胞的标志蛋白，对于维持足细胞正常的结构及功能起着至关重要的作用。

结蛋白（desmin）是足细胞损伤的标志蛋白，在足细胞损伤时其表达明显上调。

因此nephrin表达下调及desmin表达上调是足细胞损伤的一个重要标志[6-7]。

保肾通络方是由北京中医医院肾病科协定处方保肾方Ⅱ号加虫类药（蝉蜕、地龙、全蝎）组方而成，临床防治DN疗效确切[8]，但其作用机制尚不明确。

本实验观察保肾通络方对KK-Ay小鼠足细胞nephrin及desmin表达的影响，进而探讨其改善DN肾功能、减轻肾脏病理损伤的分子机制。

1 实验材料1.1 实验动物 无特定病原体动物级（SPF）雄性KK-Ay小鼠及SPF雄性C57BL/6J小鼠，8周龄，体重（30±5）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2014-0004。

本实验方案已通过首都医科大学附属北京中医医院实验动物伦理委员会审核批准（实验动物福利伦理号：2018040202）。

1.2 药物与试剂 保肾通络方由生黄芪30g、党参15g、生地30g、女贞子20g、菟丝子20g、鬼箭羽15g、三棱10g、水蛭5g、蝉蜕9g、地龙6g、全蝎6g组成。

本实验应用的保肾通络方颗粒剂由首都医科大学附属北京中医医院药剂科制备，每1g颗粒剂含4.01g 生药，临床成人用量为每日1.91g（生药）/kg。

柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液（北京鼎国昌盛生物技术有限公司，0.1mol/L，pH为4.4，批号32J00101），Nephrin抗体（abcam公司，ab183099），Desmin抗体（abcam公司，ab32362），尿蛋白定量检测试剂盒（南京建成，货号C035-2），肌酐测定试剂盒（ROCHE，瑞士，批号657881），尿素氮测定试剂盒（ROCHE，瑞士，批号658513），缬沙坦胶囊（北京诺华制药有限公司，批号X1440）。

1.3 主要仪器 酶标仪（北京市新风机电技术公司，ZS-3），离心机（Sigma，3K18），实时荧光定量PCR仪（PRISM 7700，ABI，美国），血糖仪及配套试纸（美国强生公司），全自动生化分析仪（上海科华生物工程股份有限公司），电泳仪（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，DG-300C），迷你双垂直电泳槽（北京市六一仪器厂，DYCZ-24DN），迷你转印电泳槽（北京市六一仪器厂，DYCZ-40D）。

2 实验方法2.1 造模、分组与给药 8周龄雄性KK-Ay小鼠予高脂饲料（北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK京2014-0008）喂养4周，另外选取10只C57BL/6J小鼠作为正常对照组（NC），予普通饲料（北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK京2014-0008）喂养4周。

4周后检测KK-Ay 小鼠随机血糖，≥16.7mmol/L且24h尿蛋白升高为造模成功。

造模成功的KK-Ay小鼠采用数字表法随机分为模型组（DN）、保肾通络方组（BSF）、缬沙坦组（XST），每组10只。

保肾通络方组按生药20g/kg每日灌胃，缬沙坦组按10mg/kg每日灌胃，正常对照组和模型组灌胃等量蒸馏水，连续给药12周。

实验期间正常对照组普通饲料自由饮食，其他各组高脂饲料自由饮食，饲养温度22℃左右，湿度60%，光照黑暗时间为每日12h/12h。

2.2 指标检测2.2.1 24h尿蛋白定量 分别于干预前和干预4、8、12周代谢笼收集小鼠24h尿液，离心半径8cm，3000r/min离心10min后按Elisa试剂盒说明书用酶联免疫吸附法测定尿蛋白定量。

2.2.2 血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平 于干预12周末麻醉小鼠后心尖取血，静置20min左右，离心半径8cm，2000r/min离心20min，分离血清，检测血肌酐、尿素氮水平。

2.2.3 苏木精-伊红（HE）、过碘酸雪夫（PAS）染色观察肾组织病理 处死小鼠后摘取左侧肾脏，去除包膜，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，程序化脱蜡后，分别移入伊红及无色盐基性品红溶液中染色，流水冲洗切片10min，用苏木精染液复染细胞核5～10min，再用1%盐酸酒精分化，流水冲洗干净，程序化脱水透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察肾组织的病理形态学改变。

2.2.4 蛋白质免疫印迹（WB）检测nephrin、desmin蛋白表达 处死小鼠后摘取右侧肾脏，去除包膜及周围结缔组织，用灭菌剪刀剪碎肾脏，加入已经配置好的裂解液，冰上裂解30min，离心后取上清，完成蛋白提取，BCA方法检测蛋白浓度，利用10%SDS-PAGE 凝胶进行蛋白电泳，每组取20µL样品依次加入指定的电泳槽中，并取3µL Marker加入上样槽中。

电泳结束后进行转膜，一抗1∶500稀释后4℃孵育过夜，二抗孵育2h，ECL试剂暗室内胶片曝光，扫描胶片，用图像分析软件分析目标条带。

2.2.5 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测nephrin、desmin mRNA表达 采用Trizol提取小鼠肾脏总RNA，向样本中加入5mL Trizol，室温放置5min，加入0.2mL氯仿，震荡混匀，保存5～10min，离心后取出最上层，依次加入预冷异丙醇、75%DEPC 乙醇，离心后去除乙醇，加入DEPC处理过的水溶解沉淀。