基因克隆步骤完整版
克隆基因的方法
克隆基因的方法随着生物技术的不断发展，克隆基因的方法已经成为分子生物学和基因工程领域中不可或缺的工具。
克隆基因的方法可以用来研究基因的结构、功能和调控机制，也可以用来制备重组蛋白、疫苗和基因治疗药物等。
本文将介绍克隆基因的方法，并探讨其在生物学和医学领域中的应用。
一、克隆基因的方法克隆基因的方法包括以下步骤：1. DNA提取：从目标生物体中提取DNA，可以使用化学方法或商业化的DNA提取试剂盒。
2. PCR扩增：使用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因序列。
PCR是一种体外DNA合成技术，可以在短时间内扩增目标序列，具有高灵敏度和高特异性。
3. 限制性内切酶切割：使用限制性内切酶切割PCR产物，得到两端具有粘性末端的DNA片段。
限制性内切酶是一种特异性的DNA酶，可以切割DNA的特定序列，从而产生具有特定末端的DNA片段。
4. 连接：将两端具有粘性末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。
连接可以使用DNA连接酶或T4DNA连接酶等酶催化的反应。
5. 转化：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达。
转化可以使用化学方法或电穿孔法等。
6. 筛选：筛选带有目标基因的克隆。
筛选可以使用选择性培养基、荧光标记、PCR等方法。
二、克隆基因的应用1. 基因研究克隆基因的方法可以用来研究基因的结构、功能和调控机制。
例如，可以克隆和表达目标基因蛋白，研究其生物学功能和相互作用关系。
还可以使用基因敲除和转基因技术，研究基因在生物体发育、代谢和疾病等方面的作用。
2. 蛋白制备克隆基因的方法可以用来制备重组蛋白。
例如，可以克隆并表达具有生物活性的蛋白，如生长因子、激素、抗体等。
重组蛋白可以用于药物研发、生物制剂生产和科学研究等方面。
3. 疫苗研究克隆基因的方法可以用来研制和生产疫苗。
例如，可以克隆和表达病原体的抗原蛋白，制备亚单位疫苗或基因工程疫苗。
基因工程疫苗具有高效、安全、经济等优点，已经成为疫苗研究和生产的重要手段。
8-3-基因克隆的基本过程
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
5
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
6
1. 制备目的基因和相b + + -
8
2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
9
2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
10
2.DNA分子的体外连接
常用方法： 遗传学方法 免疫学方法 核酸杂交法 PCR技术 酶切鉴定
20
4.DNA重组体的筛选和鉴定
常用方法： 遗传学方法 免疫学方法 核酸杂交法 PCR技术 酶切鉴定
21
思考题：
如 何 克 隆 p53 基 因 的 部 分 序 列 （GenBank登录号:AF136270.1）？
基因克隆的基本过程
1
基因克隆主要步骤： 制备目的基因和相关载体； 将目的基因和有关载体进行连接； 将重组的DNA导入受体细胞； DNA重组体的筛选和鉴定； DNA重组体的扩增、表达和其他研究。
3
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolyme人工合成
DNA合成过程示意图
基因克隆技术的基本步骤
基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。
在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。
本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。
一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。
目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。
质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。
大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。
2. 合适的克隆位点。
载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。
3. 可重复复制。
质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。
二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。
这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。
三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。
方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。
连接成功后，形成了一个混合DNA。
由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。
四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。
大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。
宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。
五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。
常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。
克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。
例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。
利用同源序列法克隆基因的基本步骤
利用同源序列法克隆基因的基本步骤一、概述基因克隆是现代生物学研究中的重要技术手段之一，其主要目的是在体外构建包含目标基因的DNA分子。
同源序列法是一种常用的基因克隆方法，通过在一个已知基因的上下游区域找到相同的DNA序列，然后利用PCR或限制酶技术将目标基因从细胞中扩增、截取并插入到适当的质粒载体中。
本文将介绍利用同源序列法克隆基因的基本步骤。
二、材料与设备准备1. 目标基因的DNA序列- 确定目标基因的DNA序列，并设计引物2. PCR试剂盒3. DNA酶- 包括限制酶和连接酶4. DNA纯化试剂盒5. DNA电泳仪器6. 质粒载体及相关试剂7. 载体宿主细胞三、PCR扩增目标基因1. 初始步骤- 设计适当的引物，确保引物的序列与目标基因的同源序列相匹配 - 准备PCR试剂盒和PCR仪器2. PCR扩增- 按照试剂盒说明书的操作步骤，进行PCR扩增反应- 调节PCR反应条件，使扩增得到高特异性和高产量的目标DNA片段四、DNA片段纯化1. 提取PCR产物- 使用DNA纯化试剂盒，将PCR产物从反应混合物中纯化出来2. 纯化后的DNA片段检测- 使用DNA电泳仪器，检测纯化后的DNA片段是否符合预期大小五、限制酶切与质粒载体处理1. 限制酶切- 根据预先设计好的限制酶切位点，对目标基因DNA片段和质粒载体进行限制酶切2. 质粒载体处理- 在限制酶切反应后，使用连接酶将目标基因DNA片段连接到质粒载体上六、DNA片段转化与宿主细胞处理1. DNA片段转化- 将连接好的质粒载体转化到适当的宿主细胞中2. 宿主细胞处理- 处理转化后的宿主细胞，筛选带有目标基因的正反应克隆子七、目标基因测序确认1. 选取克隆子- 从宿主细胞中分离带有目标基因的正反应克隆子2. 目标基因测序- 对克隆子进行测序确认，确保目标基因的序列正确无误八、结语利用同源序列法克隆基因是一项关键而复杂的实验技术，需要准备充分的材料与设备，严格按照步骤进行操作。
整个基因克隆实验规程完整
整个基因克隆实验规程完整Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。
相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。
实验步骤1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。
2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min；7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min；8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。
RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。
本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。
一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。
基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。
2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。
3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。
通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。
通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。
例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。
二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。
基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。
基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。
常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。
3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。
4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。
可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。
基因克隆、假病毒操作步骤
实验名称：基因克隆实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等；操作步骤：1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化，在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接T4lages 1.010×T4buffer 2.0EZ-T 1.0目的基因8.0DdH2O 8.0＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul3、取100µl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；4、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时；6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振荡培养3h；7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；实验名称：假病毒的制备实验器材：荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工小剂量抽提试剂盒、生工胶回收试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、冰、LB培养基、氨苄、卡那、卡那抗性平板、甘油等；操作步骤：1、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含氨苄（1：1000）的5ml LB 培养基中过夜培养中，37℃，200r/min；2、收集菌体抽提质粒，用生工小剂量抽提质粒试剂盒跟据说明书进行抽提，在抽提过程中要注意防污染（在最后一步的洗脱可以用预热的洗脱液洗脱，在加洗脱液的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；3、用抽提好的质粒做双酶切用NEB公司的体系，同时做一管PET28-MS2的双酶切20ulBamH 1 2.5ul BamH 1 1.0ul HindIII 2.5ul HindIII 1.0ulBSA 5.0ul BSA 2.0ulBuffer2 5.0ul Buffer2 2.0ul产物20ul PET28-MS2 8.0H2O 15ul H2O 15ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿50.0 ul20.0ul37度3小时，4、配置1%的大空胶，将双酶切产物跑胶，割胶（在割胶的时候要注意产物不要在紫外灯光下暴露太久），用生工胶回收试剂盒进行回收根据说明书进行纯化；PET28-MS2直接用生工PCR产物回收试剂盒进行纯化；5、将回收好的酶切产物进行连接用NEB的连接体系，16℃，过夜连接T4lages 1.0ul10×T4buffer 2.0ulPET28-MS2 4.0ul目的片段8.0ulDdH2O 6.0ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul6、取100µl摇匀后的BL21感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；7、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；8、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（卡那抗性），37℃倒置培养12~16小时；9、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（卡那）的LB液体培养基中，37℃振荡培养，培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；10、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；11、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含卡那霉素的5ml LB 培养基中过夜培养，37℃，200r/min；12、将1ml 过夜培养的菌液接种到100ml 含卡那青霉素的LB 培养基中，37℃，200r /min 振荡培养4 -6h 至OD 600值大约在0.6-0.8；13、加入终浓度为1mmol/L (IPTG)，在37℃条件下，200 r /min诱导表达16h；14、10,000 rpm，4℃，离心10min，收集菌体，加入1×超声buffer 5 ml重悬菌体；<摇床一小时>15、超声处理：置于冰上超声，功率300W，超声时间2<5>s，间隔时间3<5>s，全程3min，超声12<10>个循环；16、将破碎完全的表达产物12,000 rpm，4℃，离心30min，沉淀细胞碎片，收集上清到另一干净的离心管中，得到含病毒样颗粒的表达产物，分装保存-80℃保存；17、将得到的病毒样颗粒的双酶消化验证实验分别取4 份用NEB公司的DNaseI、生工的RNaseA 进行消化37℃消化1h-2h18、1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶消化结果；19、去第1次消化产物进行第2次消化37℃1h-2h（用NEB公司的DNaseI）DNaseI 40ul10×DNaseIBuffer100ul消化产物10ulTE 850ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿1ml20、DNaseⅠ消化后，加入终浓度为5mM的EDTA终止反应，然后65度10分钟使DNaseⅠ失活；21、提取RNA标本后上荧光定量，检验病毒颗粒的浓度和质粒的消化情况。
基因克隆的方法
基因克隆的方法基因克隆是一种将特定的DNA片段从一个组织或生物体中复制并插入到另一个生物体中的技术。
这种技术已经帮助我们研究和理解生命过程的许多方面，包括遗传学、发育生物学和分子生物学等领域。
基因克隆的方法通常包括以下几个步骤：1. DNA片段的提取首先，需要从源组织或生物体中提取出含有目标基因的DNA片段。
这可以通过使用化学物质或机械方法来破坏细胞壁和细胞膜来完成。
然后，可以使用酶切（酶切），即将DNA 分子切割为多个部分，以获取需要的DNA片段。
接下来，需要将目标基因片段插入到载体DNA中，这种DNA通常来自细菌或病毒。
这些载体通常被称为质粒，由于它们可以独立地复制和转移到不同的生物体中，因此它们是进行基因克隆的理想选择。
这个过程的关键是要使用酶切和酶连反应将基因片段和质粒DNA连成一体。
3. 转化完成DNA插入之后，需要将质粒DNA插入到目标生物体中。
这个过程通常被称为转化。
质粒DNA可以通过添加化学物质，电击或热冲击等方法，使其进入目标细胞中。
如果转化成功，则目标细胞将含有与原细胞相同的基因，并且可以将该基因传递给其细胞后代。
4. 克隆筛选最后，需要进行克隆筛选，以确定哪些细胞包含所需的质粒和基因。
可以通过对转化沿用枝接派系进行筛选，这些派系通常包含一些荧光标记或抗生素耐受基因。
这样，只要细胞包含标记，就可以通过添加抗生素来杀死不含标记的细胞，从而将所需的基因克隆出来。
在生物技术的发展中，基因克隆的方法已经得到了广泛应用。
它可以用来生产抗生素、激素和其他药物，也可以用来改变植物和动物的遗传特征，以增加其产量或提高其抗病能力。
基因克隆还可以用来研究基因功能，发现新的基因或揭示遗传疾病的机制。
但是，由于基因克隆涉及到对生命体系进行干预和修改，因此我们必须注意其潜在的风险和不良后果，并确保其在道德和法律方面的合规性和可行性。
1.基因克隆的步骤
基因克隆的步骤一、RNA的提取1. 提取RNA前将洗净干燥的瓷研钵放入-70℃预冷10 min；2. 从液氮罐中取出样品组织放入预冷的研钵中，加液氮淹没后立即研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干；3. 趁冷，将样品粉末50-80 mg加入1.5 mL离心管后再加入1 mL Trizol，样品体积应不超过所使用Trizol体积的10%，然后按照Trizol试剂盒说明操作；4. 室温静止5-15 min。
对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织Trizol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物，需12000g、4℃离心10 min，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中；5. 每mL Trizol中加0.2 mL氯仿。
小心盖上离心管，剧烈地涡旋振荡15 sec，室温（24℃）静置3-5 min；（必需步骤）6. 12000 g、4℃离心15 min，此时混合物分成三部分：底层为苯酚-氯仿层，中间层，上层水相层，RNA完全存在水相中；7. 把小于80%的水相层（每mL Trizol约可吸0.5-0.55 mL）转移至一新的离心管中，并弃去下面的有机相（小心避免吸到中间层）。
往水相中加入异丙醇来沉淀RNA，每使用1 mL Trizol，便加500 uL的异丙醇，颠倒混匀，室温下孵育样品10 min；8. 4℃、12000 g离心样本10 min弃去上清，每mL Trizol加入1 mL 75%乙醇，涡旋混匀，室温沉淀10 min后，7500 g、4℃离心5 min，弃上清。
再用离心机甩一下（5000rpm，离心1 s）；9. 小心吸走乙醇，短暂地在室温下置2-5 min，让RNA团风干，不要用离心干燥装置或真空干燥装置，因为过度干燥会导致很难用水重新溶解RNA，然后在55-60℃温浴10 min，然后-70℃保存。
[RNA]（ng/uL）=A260×40×稀释倍数[DNA]（ng/uL）=A260×50×稀释倍数纯DNA：OD260/OD280≈1.8（＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）二、M-MLV RT反转录1. oligo dT 1 uL + dNTP（2.5 mM）4 uL + 1-5 ug total RNA + 水= 12 uLHeat mixture to 65℃ for 5 min and quick chill on ice；2. 上述12 uL液体+ 5×Buffer 4 uL + 0.1 M DTT 2 uL + RNase OUT 1 uLMix contents of the tube，incubate at 37℃for 2 min3. 上述19 uL液体加M-MLV RT 1 uLIncubate tube at 25℃for 10 min；Incubate 50 min at 37℃；70℃for 15 min。
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1总RNA提取
(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用
(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷
(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；
(4) 4o C，12,000g，离心15 min；
(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；
(6) 4o C，12,000g，离心10 min；
(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗
(8) 4o C，7,500g，离心5 min；
(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成
纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：
Total RNA 1μg
5× gDNA Eraser Buffer 2μL
gDNA Eraser 1μL
RNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42o C，2min；
RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：
5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL
PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL
RT Primer Mix 1μL
上一步的反应液10μL
RNase Free dH2O 补齐至20μL 操作条件为：
(1) 37o C放置15 min；(2) 85o C，5 sec；(3) 4o C保存。
3 PCR
按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操作，，PCR反应体系如下：
Premix Taq25 μL
模板5μL
引物1 (10 μM) 1 μL
引物2 (10 μM) 1 μL
ddH2O 18μL PCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C 延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。
PCR反应完毕，取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反应产物）。
4 基因克隆及测序
4.1 PCR产物切胶回收
将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA片段。
使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下：
(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(2) 按100 mg agarose胶加入100μL 溶液PC，置于50o C中10 min左右，中途混匀几次，至胶完全融化；
(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(4)向吸附柱CB2中加入600μL 漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g 离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(5) 重复上一步骤；
(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；
(7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50µL 洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400×g室温离心2 min，收集到的洗脱液即为回收的DNA纯化液；
(8) 取5µL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液中DNA含量。
4.2目的片段与载体连接
(1) 胶回收产物与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18-T载体的试剂盒说明书。
在灭菌的0.5 mL 离心管中配制如下溶液（10 μL）：
回收DNA 4μL
Ligation Solution 5μL
pMD18-T Vector 1μL
(2) 16o C反应30分钟，所得产物保存于－4o C冰箱备用。
4.3连接产物转化E.coli DH5α
(1) 将5 µL连接产物加入到100µL E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；
(2) 42o C水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；
(3) 每管加入500 µL LB培养基（室温放置），37o C 160-180 rpm振荡培养45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；
(4) 在含有Amp（100 µg/mL）的选择性平板上加入60-100 µL 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；
(5) 将培养皿正放，37o C约50 min，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养10-16 h。
4.4转化子的筛选及鉴定
(1) 用无菌枪头挑取LB平板上3-5个单菌落，分别接种到3.5 mL LB液体培养基中（含100 µg/mL Amp），37o C，165rpm振荡培养10-12 h；
(2) 用5 µL菌液做模板，进行PCR鉴定（50 µL 体系），操作步骤同3。
阳性菌液由Invitrogen生物公司测序鉴定，余下的菌液4o C保存备用；
(3) 测序结果在Genbank数据库中进行比对分析。
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