第三章 基因工程载体
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基因工程第三章2-Jun-finalversion
三、粘性质粒
粘性质粒是带有λ噬菌体的Cos位点和整个pBR322的 DNA序列的载体。
1. 粘性质粒பைடு நூலகம்组成及性质
粘性质粒（Cosmid）带有 λ噬菌体的Cos位点和整个 pBR322的DNA顺序。经感染进 入细菌细胞以后，它就好象质 粒那样在细胞中进行复制。易 环化和扩增。分子量小，可包 装30-45kb外源基因，菌体 • 温和噬菌体 • 溶源化细菌 • 溶源化 • 原噬菌体
噬菌体的侵染与包装
二、λ噬菌体载体
λ噬菌体的电子显微镜照片
（一） λ DNA分子
1.λ基因组DNA的特点
a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)，编 码50多个基因，在两端各有12个碱基组成的5’单链 互补粘性末端(Cohesive end),进入宿主细胞后,粘 性末端连接形成环状分子(Cos位点)，是包装的必需 DNA序列．
–右侧区：位于N基因的右侧，包含全部的主要 调节基因及复制基因和裂解基因。
3. λDNA的复制
• 裂解周期 –早期：环状的λDNA分子按θ型双向复制，复 制起点位于O基因内，需要O、P基因编码蛋白 的参与。 –晚期：控制滚环型复制的开关被启动，复制从 θ型转变为滚环型复制，合成出一系列λDNA 线性排列的多聚体分子。 –cos位点是λ噬菌体正确包装的必需位点。
左臂
右臂
cos位点
置换区域
cos位点
λNM781 由于λ噬菌体的感染，
寄主细胞lacZ基因的琥珀突 变被抑制,所以能在乳糖麦康 基氏(McConkey)琼脂培养基 上产生红色的噬菌斑,或是在 X-gal琼脂培养基上产生蓝色 的噬菌斑。但如果具有supE 基因的EcoRⅠ片段被外源DNA 所取代，那么形成的重组体 噬菌体在上述的两种指示培 养基中都只能产生出无色的 噬菌斑。应用指示性培养基 可对这种重组体方便的筛选 出来。
基因工程-载体
cmlr
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
第三章基因工程载体
3个会导致Ampr基因失活
9个导致Tetr基因失活
氨苄青霉素和四环素抗性 24个单一克隆位点。
pBR322的优点
① 双抗生素抗性选择标记
抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重 组体质粒的有效方法，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。 获得重组载体的寄主细胞 在Aplasmid ）:在整个细胞
周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝，如Col E1质粒。
氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增， 其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应
严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）：
plasmid 接合型质粒（自我转移的 质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。
Non
Conjugative plasmid 非接合型质粒
（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配 对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发 的转移到另一个细胞。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、 严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
① colicin E1基因的结构 cea imm 免疫基因 kil 溶菌基因
结构基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物 ③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
克隆位点
EcoR I
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1 失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但 仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。
外源DNA
Colicin E1
《基因工程》第三章 载体2
Induction
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
第三章 第一节 基因工程（基因表达载体的构建）
4．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C （图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列 操作与实验目的不符的是（ C ）
A．用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
三、目的基因及其表达产物的检测鉴定
1．检测与鉴定的内容、方法
阅读教材98~99页的内容，根据表格提示的项目填写表格中缺 少的内容。
检测水平
分子水 DNA 平的检 RNA
测 蛋白质 个体水平的检测
检测内容
方法
结果显示
1．检测与鉴定的内容、方法
检测水平
检测内容
方法
结果显示
检测转基因生物的染色体 DNA分子杂交法（基因探针
3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全 能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。
4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但 又有所不同。大肠杆菌为原核生物，而酵母菌为真核生物（具有 多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质 时比大肠杆菌有优势。 有内质网和高尔基体
2．病毒感染法 用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞， 也能使目的基因导入动物细胞内。
（三）将目的基因导入微生物细胞 1．感受态细胞 经过适当的处理（如用Ca2+处理）后，细胞质膜对DNA的通透性会
发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为 感受态细胞。
2．过程
Ca2+处理微生物细胞
感受态细胞
基因工程原理与技术-3
pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签： 多聚组氨酸残基、 结合麦芽糖蛋白、 谷胱甘肽-s-转移 酶。
亲和层析法纯 化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体 真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体 非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体 非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的 杀伤质粒)。
提取的质粒有三 种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线 形DNA。
2、质粒的复制类型 严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中 是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制 的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载 体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动 物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物 细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修 饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体 在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。
基因工程基因工程的载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
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第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
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发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
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2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
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a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因
2. 营养标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这 类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。
③ 线形DNA （ linear ，LDNA）
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一、 质粒载体
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：
SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。
OC L
SC
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一、 质粒载体
3.质粒的基本特性 质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据 在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid） (拷贝数少，为1-5个) 和松弛型复制控制的质粒（relaxed） (拷贝数多，可达10-200个拷 贝) 因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
一、 质粒载体
4.质粒的命名原则
人工组建的质粒
人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的 第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和 实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322，字母p代表质 粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表…构建的一系 质粒的编号。
两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。
具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相 同的复制子。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
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载体的要求
A、复制起点：能在受体中复制；
B、筛选标记； C、限制性内切酶切割位点； D、载体的大小：原则上要求载体越小越好； E、适当的拷贝数； F、载体的安全性：质粒不能随便转移; G、外源基因的表达：启动子。
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克隆位点
HindIII BamHI PstI
克隆位点
ScaI Amp
一、 质粒载体
i P O lacZ
β半 乳 糖 苷 酶 基 因 突 变 体
a互 补 显 色 反 应 （ 蓝 白 斑 筛 选 ）
β-半乳糖苷酶
-
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段 分解半乳糖
lacZ
分解X-gal
M15
产物呈现蓝色
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一、 质粒载体
+
-peptide
C-terminus of b-galactosiase
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一、质粒载体
大肠杆菌的质粒
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一、 质粒载体
2.质粒的空间构型 ①共价闭合环状DNA（Covalent close circular DNA， cccDNA) 呈超螺旋（SC）（super coil）
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一、 质粒载体
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
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一、 质粒载体
质粒的可转移性
bom site Tra protein from conjugative plasmid Mob gene helper plasmid
mob mRNA Mob protein
recipient cell
ห้องสมุดไป่ตู้
即mob基因的产物可打开非接合质粒的oriT位点，借助接合质 粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这 种现象称为迁移作用(mobilization)。
X-gal
X-gal
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一、 质粒载体
互补显色反应
α互 补
(α-complementation)
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一、 质粒载体
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。 该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因 为许多生物中没有这种基因。
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第三章 基因工程载体
第一节 克隆载体 第二节 表达载体 第三节 其它特殊用途载体
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本章重点掌握的内容
1. 掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、α互补、插入失活、人工染色体载体的概念。 2. 克隆载体DNA分子具备的条件。 3. 标记基因的分类及其作用。 4. pUC18/19质粒载体的组成、优点及质粒克隆载体用途。 5. λ-DNA载体的构建、类型及其优点。 6. 植物表达载体的组成、启动子的类型等
质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真 菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA 分子 — 眼虫、衣藻等）双链DNA 分子 （酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自 身 复制和表达。
并不是寄主生长所必需的，但可以赋 予寄主某些抵御外界环境因素不利影响 的能力（带有抗性基因等） 。
分子量在1-200kb之间 。
c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 LacZ基因的结构与产物 P LacZα LacZβ 转录 翻译 α β
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一、 质粒载体
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
P
O
lacZ
β-半乳糖苷酶 调控蛋白P
分解半乳糖
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r
SalI
pBR322
(4.36 kb)
遗传标记基因
ori
大肠杆菌质粒载体
复制起点
pBR322结构图
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载体的分类
按功能分类
克隆载体
表达载体 整合载体 按来源分类 质粒载体
克隆一个基因或DNA片断
用于一个基因的蛋白表达 把一个基因插入到染色体组中
噬菌体载体
柯斯质粒载体 人工染色体载体
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载体的种类和特征
受体细胞 质粒* E.coli λ噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒 粘粒载体 E.coli E.coli E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌 结构 环状 线状 环状 环状 环状 线性染色体 线性染色体 环状 环状 插入片断 ＜ 8kb 9 - 24kb ＜ 10 kb 35- 45kb ≈300 kb 100 - 2000 kb ＞ 1000 kb SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒 举例 pUC18/19 , T-载体等 EMBL系列， λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列
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一、质粒载体
质粒DNA的tra基因 （指令）
E.Coli产生菌毛
宿主与受体细胞结合 （迁移） 遗传物在细胞之间转移 大肠杆菌接合（conjunction）
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一、 质粒载体
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基
因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 物质合成 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗生素、细菌毒素、有机碱
质粒 pBR322 及其衍生质粒 pUC 系列质粒及其衍生质粒 pSC101 及其衍生质粒 ColE1 复制子 pMB1 突变的 pMB1 pSC101 ColE1 拷贝数 15～20 500～700 ～5 15～20
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一、质粒载体
质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)
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一、 质粒载体
质粒的可转移性
接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个 细胞（接合作用）。 甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质 粒的受体菌中。 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用。 值得注意的是，某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助 下，也能发生DNA转移，这个过程由 mob、tra 基因顺式因子bom 及其内部的转移缺口位点nic决定。
3. 生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ， GUS，CAT
4. 噬菌斑
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一、 质粒载体
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一、 质粒载体
抗 药 性 标 记 选 择 插 入 失 活 法
( )
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 β-半乳糖苷酶基因（lacZα和lacZβ）
β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋 白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β-半乳 糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为 α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编 码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZα和LacZβ） 均可作为标记基因。 β-半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性
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遗传物质 + 载体 重组的DNA分子 引入细胞或生物体内
复制与表达
稳定地遗传给下代
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基因工程流程图
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DNA：
1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区 （encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成 基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维 持。所以，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受 体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因工程载体。
2. 营养标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这 类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。
③ 线形DNA （ linear ，LDNA）
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一、 质粒载体
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：
SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。
OC L
SC
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一、 质粒载体
3.质粒的基本特性 质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据 在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid） (拷贝数少，为1-5个) 和松弛型复制控制的质粒（relaxed） (拷贝数多，可达10-200个拷 贝) 因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
一、 质粒载体
4.质粒的命名原则
人工组建的质粒
人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的 第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和 实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322，字母p代表质 粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表…构建的一系 质粒的编号。
两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。
具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相 同的复制子。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
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载体的要求
A、复制起点：能在受体中复制；
B、筛选标记； C、限制性内切酶切割位点； D、载体的大小：原则上要求载体越小越好； E、适当的拷贝数； F、载体的安全性：质粒不能随便转移; G、外源基因的表达：启动子。
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克隆位点
HindIII BamHI PstI
克隆位点
ScaI Amp
一、 质粒载体
i P O lacZ
β半 乳 糖 苷 酶 基 因 突 变 体
a互 补 显 色 反 应 （ 蓝 白 斑 筛 选 ）
β-半乳糖苷酶
-
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段 分解半乳糖
lacZ
分解X-gal
M15
产物呈现蓝色
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一、 质粒载体
+
-peptide
C-terminus of b-galactosiase
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一、质粒载体
大肠杆菌的质粒
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一、 质粒载体
2.质粒的空间构型 ①共价闭合环状DNA（Covalent close circular DNA， cccDNA) 呈超螺旋（SC）（super coil）
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一、 质粒载体
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
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一、 质粒载体
质粒的可转移性
bom site Tra protein from conjugative plasmid Mob gene helper plasmid
mob mRNA Mob protein
recipient cell
ห้องสมุดไป่ตู้
即mob基因的产物可打开非接合质粒的oriT位点，借助接合质 粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这 种现象称为迁移作用(mobilization)。
X-gal
X-gal
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一、 质粒载体
互补显色反应
α互 补
(α-complementation)
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一、 质粒载体
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。 该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因 为许多生物中没有这种基因。
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第三章 基因工程载体
第一节 克隆载体 第二节 表达载体 第三节 其它特殊用途载体
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本章重点掌握的内容
1. 掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、α互补、插入失活、人工染色体载体的概念。 2. 克隆载体DNA分子具备的条件。 3. 标记基因的分类及其作用。 4. pUC18/19质粒载体的组成、优点及质粒克隆载体用途。 5. λ-DNA载体的构建、类型及其优点。 6. 植物表达载体的组成、启动子的类型等
质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真 菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA 分子 — 眼虫、衣藻等）双链DNA 分子 （酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自 身 复制和表达。
并不是寄主生长所必需的，但可以赋 予寄主某些抵御外界环境因素不利影响 的能力（带有抗性基因等） 。
分子量在1-200kb之间 。
c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 LacZ基因的结构与产物 P LacZα LacZβ 转录 翻译 α β
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一、 质粒载体
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
P
O
lacZ
β-半乳糖苷酶 调控蛋白P
分解半乳糖
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r
SalI
pBR322
(4.36 kb)
遗传标记基因
ori
大肠杆菌质粒载体
复制起点
pBR322结构图
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载体的分类
按功能分类
克隆载体
表达载体 整合载体 按来源分类 质粒载体
克隆一个基因或DNA片断
用于一个基因的蛋白表达 把一个基因插入到染色体组中
噬菌体载体
柯斯质粒载体 人工染色体载体
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载体的种类和特征
受体细胞 质粒* E.coli λ噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒 粘粒载体 E.coli E.coli E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌 结构 环状 线状 环状 环状 环状 线性染色体 线性染色体 环状 环状 插入片断 ＜ 8kb 9 - 24kb ＜ 10 kb 35- 45kb ≈300 kb 100 - 2000 kb ＞ 1000 kb SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒 举例 pUC18/19 , T-载体等 EMBL系列， λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列
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一、质粒载体
质粒DNA的tra基因 （指令）
E.Coli产生菌毛
宿主与受体细胞结合 （迁移） 遗传物在细胞之间转移 大肠杆菌接合（conjunction）
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一、 质粒载体
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基
因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 物质合成 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗生素、细菌毒素、有机碱
质粒 pBR322 及其衍生质粒 pUC 系列质粒及其衍生质粒 pSC101 及其衍生质粒 ColE1 复制子 pMB1 突变的 pMB1 pSC101 ColE1 拷贝数 15～20 500～700 ～5 15～20
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一、质粒载体
质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)
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一、 质粒载体
质粒的可转移性
接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个 细胞（接合作用）。 甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质 粒的受体菌中。 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用。 值得注意的是，某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助 下，也能发生DNA转移，这个过程由 mob、tra 基因顺式因子bom 及其内部的转移缺口位点nic决定。
3. 生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ， GUS，CAT
4. 噬菌斑
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一、 质粒载体
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一、 质粒载体
抗 药 性 标 记 选 择 插 入 失 活 法
( )
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 β-半乳糖苷酶基因（lacZα和lacZβ）
β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋 白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β-半乳 糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为 α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编 码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZα和LacZβ） 均可作为标记基因。 β-半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性
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遗传物质 + 载体 重组的DNA分子 引入细胞或生物体内
复制与表达
稳定地遗传给下代
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基因工程流程图
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DNA：
1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区 （encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成 基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维 持。所以，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受 体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因工程载体。