山葵组培中抗褐化剂的筛选及其对增殖和生长的影响
乌头愈伤组织诱导中抗褐化剂的筛选
乌头愈伤组织诱导中抗褐化剂的筛选作者：郝克伟来源：《现代农业科技》2008年第12期摘要以乌头的叶片为外植体，在愈伤组织的诱导阶段，以低无机盐浓度1/2MS为基本培养基，加入KT 1mg/L、2，4-D 1mg/L、NAA 0.1 mg/L，考察了不同浓度配比的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、AC（活性碳）、Vc（维生素C）对乌头愈伤组织诱导的作用效果及褐化率。
结果表明，0.04%的PVP在乌头愈伤组织诱导阶段为最佳抗褐化剂。
关键词乌头；愈伤组织诱导；褐化；抗褐化剂中图分类号 S332.9文献标识码A文章编号1007-5739（2008）12-0021-02附子具有祛风除湿，温经止痛，回阳就逆，补火助阳的功能，是我国传统的中药材之一[1]。
世界上80%的附子（乌头子根）产于我国，四川江油是附子的地道产区，目前附子的人工栽培主要靠子根进行无性繁殖，耗种量大，而且由于病毒感染等原因，导致种性退化，产量和品质降低，而利用组织培养技术，可建立乌头无毒种苗快繁体系，对品种进行更新、提纯与复壮，大大提高乌头引种与驯化速度，使大规模的生产种苗成为可能，具有很好的生产与市场前景；同时，还可以从中筛选出无性系变异，扩大乌头的种质资源，为中药材的标准化生产提供依据[2]。
但田迎秋等[3]研究表明，在乌头愈伤组织诱导过程中外植体容易褐化，严重影响诱导率。
褐化对中草药植物组织、细胞培养，尤其是对木本药用植物组织培养往往是一种严重障碍。
褐化受基因型、材料的年龄和大小、取材的部位和时间、光照、温度、培养成分和pH 值等因素影响[4-6]。
本试验通过选取向四川江油附子GAP基地提供种源的四川青川乌头植株为原始材料，以乌头的叶片为外植体，确立以叶片为外植体的组织培养愈伤诱导阶段的最适抗褐化剂，减小褐化，增加组织培养成功率，为江油附子GAP基地优质种苗生产奠定基础。
1材料与方法1.1材料试验材料由四川省绵阳市青川乌头种源地提供，经四川农业大学田孟良博士鉴定为乌头（Aconitum carmichaeli Debx.），栽种于四川省雅安市农科所农场，2007年4月上旬取植株幼嫩叶片为材料。
植物组织培养中褐变的影响因素及防止措施
收稿日期2016-01-28近年来,随着科学技术的迅猛发展,植物组织培养已成为生物学科中的重要研究技术和手段之一,其被广泛应用于科研和生产,在农学、花卉、林业、医药业等领域中取得了巨大的经济、社会效益。
但是,植物组织培养过程中褐变问题普遍存在,褐变的发生会严重影响外植体的生长与分化,甚至导致培养材料的死亡,褐变问题已成为组织培养中的一大难题。
褐变的影响因素是复杂的,随外植体种类、基因型、取材部位及生理状况等的不同而危害程度有所区别,国内外也研究报道了一些减少或防止褐变的方法。
本文系统归纳了植物组织培养褐变的影响因素和防止措施,对深入研究褐变问题和组织培养技术都有着非常重要的意义。
1褐变的影响因素1.1外植体基因型在植物组织培养中,有些品系容易褐变,诱导困难,而有些品系褐变较少,愈伤组织化容易些,组培容易成功,其原因之一可能是酚类物质含量及多酚氧化酶活性上的差异。
1.2外植体的生理状态外植体本身的生理状态不同,接种后褐变的程度也不同。
致褐物质的含量会因生理年龄、季节、取材时间及部位的不同而不同。
1.3培养基成分和培养条件无机盐浓度、培养基pH 值、培养基状态及植物激素等不适宜,均会引起褐变的产生。
此外,培养过程中温度过高或光照过强,也会加速褐变的产生。
1.4培养时间接种后转瓶时间的早晚也是影响褐变的因素,接种后外植体培养时间过长,未及时转瓶,会使培养材料伤口积累过多酚类物质,导致褐变。
2褐变的防止措施2.1外植体的选择2.1.1基因型。
在相同培养条件下,甜菜二倍体品系外植体发生褐变的频率低于四倍体品系。
Dalal 等[1]比较2个葡萄品种“Pusa Seedless ”和“Beauty Seedless ”的褐变时,发现后者比前者严重,酚类化合物含量也是后者明显高。
因此,在组织培养中应注意不同基因型的筛选,选择褐变程度较小的材料来进行培养。
2.1.2生理年龄。
外植体年龄对褐变有较大影响,Chevre 分析表明欧洲栗幼龄材料酚类化合物含量少,而成龄材料比较多。
山葵愈伤组织诱导与增殖研究
山葵愈伤组织诱导与增殖研究王跃华;段茂华;任三军;陈传凤;彭双;严幸林;孙燕霞【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2015(43)1【摘要】为了获得山葵愈伤组织诱导和增殖的最佳培养条件，选择山葵真叶片、真叶柄和胚轴为外植体，以MS为基本培养基，配以不同浓度的2，4－D和6－BA植物激素进行愈伤组织诱导，并将诱导的愈伤组织接种于增殖培养基中进行培养。
结果表明：诱导山葵愈伤组织的最佳培养基配方为MS＋4 mg／L 2，4－D＋0．5 mg／L 6－BA，培养25 d后真叶片、真叶柄、胚轴的愈伤组织诱导率分别为（100．0±0．00）％、（60．5±3．29）％、（62．5±3．74）％；山葵胚轴外植体产生的愈伤组织增殖倍数最高，培养35 d后的愈伤组织增殖倍数可达（2．48±0．93）倍。
【总页数】2页(P53-54)【作者】王跃华;段茂华;任三军;陈传凤;彭双;严幸林;孙燕霞【作者单位】成都大学生物产业学院，四川成都610016;成都大学生物产业学院，四川成都 610016;广元市玺府开发有限公司，四川广元648017;成都大学生物产业学院，四川成都 610016;成都大学生物产业学院，四川成都 610016;成都大学生物产业学院，四川成都 610016;成都大学生物产业学院，四川成都 610016【正文语种】中文【中图分类】S567.23+9.043【相关文献】1.北五味子愈伤组织增殖及胚性愈伤组织诱导的研究2.半夏疏松愈伤组织的诱导与增殖的研究3.荔枝叶片胚性愈伤组织诱导及其继代增殖研究4.大花葱愈伤组织诱导分化及不定芽增殖研究5.野生欧洲李叶柄愈伤组织诱导及增殖研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物组织培养过程中的常见技术难题研究进展
植物组织培养过程中的常见技术难题研究进展叶添谋【摘要】总结了植物组织培养过程中几个突出的常见难题.包括污染、褐化、玻璃化等.这些问题是组培中的常见难题,严重影响和阻碍了组培工作的顺利进行,造成了较大的经济损失.综述近年来在该方面研究的成果,并结合自身多年的实践经验,针对其中的一些难题提出解决办法和设想,以供进一步研究参考.【期刊名称】《韶关学院学报》【年(卷),期】2010(031)003【总页数】7页(P84-90)【关键词】组织培养;污染;褐化;玻璃化;畸形苗;变异苗【作者】叶添谋【作者单位】韶关学院农业科学系,广东,韶关,512005【正文语种】中文【中图分类】S722.3+7植物在组织培养过程中，普遍存在几个常见的问题，即微生物污染问题、褐（黑）变问题、玻璃化等现象.近年来植物组织培养技术发展很快，有关这几个问题的研究也越来越深入.本文根据国内外的最新研究成果和作者在组培试验研究中所遇到的具体情况，对这几个问题发生的原因及其控制方法逐一进行介绍，并结合自身多年的实践经验，针对其中的一些难题提出解决办法和设想，以供相关人员参考. 植物组织培养中的污染，主要来自两方面：一是植物材料本身带菌；二是操作者及空气中所带微生物所致.另外，污染还可能由于培养基带菌，操作用具带菌的交叉污染所致［1，2］.污染的微生物分为细菌及真菌两大类.细菌污染的特点是：菌斑呈粘液状，而且在接种后2～3 d即可发现.主要是工作人员使用了未经充分消毒的工具(镊子、剪刀、烧杯、培养皿等)及呼吸时排出的细菌所引起的.有时也因操作人员用手接触材料或器皿边缘，这也增加了微生物落入材料或器皿的机会.还应特别注意避免交叉污染，如，已灭菌的接种工具被消毒不够彻底的超净工作台面污染后又污染消毒过的材料和已灭菌的培养基等［2，3］.真菌污染的特点：一般多由接种室(箱)的空气污染造成.形成的原因，一是接种室的空气本身未经很好消毒，二是操作时由于打开瓶盖时真菌孢子落入瓶内，或在去掉包头纸及解除捆扎包头纸的橡皮筋时，扬起了真菌孢子，致使接种室空间污染［3，4］.需要指出的是，要特别注意潜伏性内生菌的污染，这是往往被操作者所忽视的问题.在植物体中除了根尖和茎尖的顶端分生组织以外可以认为其他部位都是有菌的，只是程度不一样而已.特别是维管系统中带菌的机会最大，但是在培养的初期往往不会表现出来，只是到了外植体坏死的时候突然在外植体表面出现了污染，这种情况就属于潜伏性污染［5］.因为在培养的初期，细胞的生命力比较旺盛，即使组织中有菌潜伏，但是由于细胞本身的防御系统（包括膜系统、酶系统和细胞分裂等），微生物不能侵入到细胞里面，所以看不出来，当培养到一定阶段，由于各种环境因素的变化，比如培养基严重失水，或者其他原因等,潜伏性污染便会表现出来.在组织培养的各个环节中要严格按照无菌操作的要求，操作者心里的无菌概念要非常清晰，要明确什么是消毒？什么是灭菌？前者是指不彻底的杀菌，后者是指彻底的杀菌.只有通过高压蒸汽灭菌、火焰灼烧和升汞等消毒剂彻底处理过的物品器械才能认为是无菌的，否则都必须认为是有菌的.要尽量减少和杜绝杂菌的存在，才可能最大限度避免交叉污染的发生.现在常用的方法有：（1）外植体的灭菌要彻底.要获得完全无菌的接种材料，可从两方面入手：选取植物组织内部无菌的材料和通过消毒处理杀死材料表面所存在的各种微生物，根据不同材料选用不同的消毒剂及其合适的浓度和处理时间，运用不同的消毒方法.常用的消毒剂有：5～10%漂白粉、70～75%酒精、0.1～0.2%升汞及2～10%次氯酸钠.对于有茸毛、粗糙不平的地下部分等难消毒的材料，消毒前一般用70%酒精浸泡数秒到数十秒或在消毒剂中加数滴吐温－80，以达到有效消毒的目的［3-5］.外植体的消毒要非常细心，比如茎段消毒，经过消毒剂处理后，要把两端切去约0.5 cm，这样可大大减少污染概率.还有，在消毒后最好把外植体分成三份分别置于不同的无菌的培养皿中，这样可以减少交叉污染的概率.在消毒过程中，要使所有的外植体都要充分接触药剂，不能暴露于液面否则造成交叉污染.（2)严格遵守无菌操作规程.工作人员在操作过程中必须严格遵守以下无菌操作规程，才能尽可能减少或避免培养材料和培养基的污染.操作人员在进入接种室前洗手，换上消毒过的工作服、鞋帽和口罩；操作前用70%酒精擦洗双手，操作中也经常用酒精擦手；每次操作都要灼烧用具(镊子、剪刀、接种针等).要特别强调的是，酒精擦过的表面和消毒液处理过的材料不可能完全没有菌，只是菌的数量大大减少了，只有经过酒精灯灼烧过的和高压蒸汽灭菌过的物品才可以认为是无菌的，还有在超净工作台中要充分利用酒精灯的作用，这样可以大大减少污染.操作时一定要细心，心里要很明白哪些动作很可能会染菌［1，7］.（3）加入抗生素.培养基中加入适当的抗生素，可有效防止污染，常用的抗菌素有青霉素、链霉素、土霉素等，用量在5~20 mg/L［4］.(4)无菌培养.外植体经过消毒灭菌后，接种于灭菌过的培养基中，即进入无菌培养的环节.培养室内需清洁少菌，可在室内装紫外灯，定期开灯灭菌，还可用高锰酸钾和甲醛混合液定期熏蒸，或者用75%酒精喷雾［1，5］.(5)控制外植体的接种数量.外植体第一次接种时要用小容器，一个容器只接一个外植体，不能接多，因为按照污染的概率计算，接种的数量越大，污染的概率就越大［3，8］.(6)转瓶继代培养.根据笔者的经验，如果一旦发现已经有了污染的苗头，最好马上转接到新的培养基上，如果没有时间，可以暂时把整个培养容器放入冰箱中4℃保存，第二天再做，这样可以抑制微生物的生长.这样做虽然比较麻烦，但是却可以拯救一些珍贵的而稀少的培养材料（外植体），因为在污染的早期，孢子还没出现，这时候转接污染的机会相对减少.但是即使这样做也不能保证完全不污染，最好在转接时把外植体用75%的酒精消毒0.5 min，这样比较保险些.通过这样的办法可以拯救了不少珍贵的材料，如果一发现污染就把整个容器的材料丢弃，这样太可惜了，当然材料很充分的时候是没有关系的，但是对于一些珍稀的材料则应该想方设法加以拯救为宜［1，8］.2.1.1 外植体材料的基因型外植体材料的基因型不同，褐变程度也不同.比如大多数块茎、鳞茎（如马铃薯、百合、水仙等）、天南星科植物（魔芋、芋头等）、松柏科植物（红豆杉、松、柏等）、茶科植物（山茶、油茶等）、木兰科植物（荷花玉兰、白兰等）很容易褐化，而蔷薇科植物（玫瑰、月季等）、金缕梅科植物（红花继木等）、木犀科（桂花等）不容易褐化，容易的褐化的植物多于不容易褐化的植物.因此，对于易褐变的植物，在组培中应注意筛选褐变程度轻的材料作为外植体.但是有一点需要说明的是，虽然有些植物容易褐化，但是并不影响丛生芽或者愈伤组织的诱导，比如在接种菊花的茎段时，虽然茎段已经褐化，但是休眠芽却能够顺利被诱导出来或者能够出现愈伤组织，在这种情况下可以不考虑褐化问题.只有在褐化严重影响了愈伤组织或者芽的诱导的情况下才要采取措施抑制褐化的出现.褐化严重时就会转为黑化，组织坏死［1，2］.2.1.2 外植体材料的生理状态材料本身的生理状态不同，接种后褐变的程度也不同，其原因可能是不同生理状态的材料，酚类物质的含量及PPO活性都不同.邱璐等用桑树基部发出的幼芽作外植体比用桑树上部高大枝条上的壮芽作外植体褐化轻，褐化率低，幼龄树比老龄树褐化轻、褐化率低.一般而言，用分生部位作外植体接种后形成的醌类物质少，褐变轻，而分化部位作外植体后形成的醌类物质多，因此容易褐变.这与分生组织生长速度快、细胞分裂频率高有一定关系.另外，外植体中致褐物质的含量也因季节的不同而不同，冬季褐变少，夏秋季褐变最严重，存活率最低［3，5］.2.1.3 培养基成分2.1.3.1 无机盐浓度.过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体的褐变，如柚棕用MS无机盐培养基易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且可以获得愈伤组织和胚状体.张寒霜等在研究低酚陆地棉胚发生过程中发现，培养基成分中KNO3加倍时易使继代愈伤发生褐化.邱璐等在云桑组织培养中也发现，使用1/2MS培养基，降低无机盐浓度，能有效减轻褐化现象，降低褐化率［4，6］.2.1.3.2 生长调节物质.细胞分裂素(6-苄基氨基嘌呤或激动素)有刺激多酚氧化酶活性提高的作用.在桑组织培养过程中BA的使用浓度低、褐化轻，随BA浓度的提高，其褐化率升高.王异星等在荔枝的细胞悬浮培养中采用1 mg/L6-BA+2 mg/L2,4-D 的配比，培养细胞生长较1 mg/L6-BA+1 mg/L 2,4-D增殖快而不易褐变，说明选择最佳的生长调节剂使外植体快速生长，提高分化量，是克服褐变的有效措施［8］.2.1.4 其他影响因素愈伤组织增殖继代方法影响着褐变.如低酚陆地棉愈伤组织继代培养时，如果将愈伤组织及其下胚轴一起转移到继代培养基上，它可以保持活力继续增殖生长，但如果将愈伤组织切离外植体后转接，则易出现褐化，且14 d后才能再生出新鲜的愈伤组织.接种或继代后培养时间过长，未及时转移，也会引起材料的褐变，甚至导致全部死亡，这在培养过程中是经常可见的.培养基硬度对褐变也有影响.在云桑的组织培养中，琼脂用量大，培养基硬度大，则褐变率低；随着琼脂用量的减少，培养基硬度减小，组织褐变加重.此外，培养条件不适宜，如温度过高或光照过强，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养组织的褐变.因此，在培养初期一般都采用遮光并保持较低的温度(20℃左右)，可以减轻褐变的发生［7，8］.2.2.1 选择适当的外植体处于旺盛生长状态的外植体，具有较强的分生能力，其褐变程度低，为组培之首选.Danhu Yu和Carole P认为生长在避阴处的外植体比生长在全光下的外植体褐变率低，腋生枝上的顶芽比其他部位枝的顶芽褐变率低.对于容易褐变的植物则应注意对其不同品系基因型进行筛选，以采用褐变程度轻的材料来进行培养为佳［10，13］.2.2.2 在培养基中加入还原性物质或吸附剂在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚.但是其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用在生产应用中可不受限制［10，11］.加入活性炭（0.1～1%）可以吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5－羟甲基糠醛等，从而有利于培养物的生长.但是要注意的是，活性炭同时也可以吸收培养基中的激素等成分而使之降低浓度［12］.2.2.3 对培养材料进行预处理何琼英等在苦丁茶体细胞组织培养前，将苦丁茶茎段经常规消毒后用可溶性聚乙烯毗咯烷酮(PVP2 g/L)预处理，浸泡l0～15 min，并在培养基中加入1 g/L的活性炭，获得较好的防褐效果［13］.用抗氧化剂溶液进行预处理，或在抗氧化剂溶液中切割剥离外植体，或在接种之前用无菌水反复清洗外植体，洗尽切口处渗出的酚类物质，均可起到减轻褐变伤害的作用［1］.根据笔者的经验，把姜花、茶花等易褐变的外植体接种前放入冰箱（4℃）中两天再取出接种后置于15～20℃中培养可以大大降低褐化程度，或者是在接种时用1～2%的盐水处理1 min外植体也可以有效降低褐化［1，12］.2.2.4 选择适当的培养条件在培养时选择适当的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平以及pH值对于防止褐变的发生是十分重要的.对于易褐变的材料，初期培养时在黑暗下进行，并保持较低温度(15～20℃)，可降低PPO活性，防止酚类物质氧化，因而能减轻褐变的发生.可以说在所有影响褐化的因素中温度是最重要的，笔者在多年的组培实践中发现容易褐化的材料在夏天无法进行，但是到了秋冬季则褐化的程度大大降低［1，13］. 2.2.5 其他措施对于易褐变的材料，在培养初期进行连续转移，可以减轻由于醌类物质的积累对培养物的毒害.1 mmol/L的NaCl在抑制荔枝多酚氧化酶活性的同时，还可促进细胞体积的增加，而且它对人体无毒，来源广，价格低廉，是一种有应用价值的防褐剂［17］.在培养基中加入50 mmol/L的蜂王浆在促进组织增殖生长的同时，也有一定的防褐作用.另外，在荔枝细胞悬浮培养过程中，加入50 mmol/LAgNO3或5 mmol/LVC均可部分抑制PPO活性,防止细胞褐变发生［10-14］.3.1.1 培养材料不同品种及同一植物的不同外植体部位对试管苗玻璃化有显著影响.张翠玉等报道，不同品种植物玻璃苗的发生频率有较大差异，一类是容易玻璃化的品种，如香蕉、草本花卉；一类是较易玻璃化的品种，如红檵木、马铃薯等；一类是不易玻璃化的品种，如松柏科植物、桑科植物格林姣红.这种差异可能与各个品种内源激素水平不同有关［15，17］.周菊华等观察瑞香当年生嫩枝的芽、中部茎段和基部茎段3种外植体结果表明，用基部茎段作外植体时无玻璃苗，中部茎段的玻璃苗可高达75%，芽则介于基部和中部茎段之间［19］.3.1.2 培养的环境条件试管苗培养过程中，光照、温度、湿度、pH值均间接影响着玻璃化的发生.肖玉兰等研究发现，光照强度在10 000～20 000 Lx范围内，随着光照强度提高，玻璃苗显著减少.培养温度相对降低或用40℃热激处理，pH值7.0培养，均可消除玻璃化现象.相对湿度降低也可有效防止玻璃苗发生［18，19］.3.1.3 培养基成分研究表明，MS培养基是控制玻璃化发生的较理想的培养基.培养基中增加K、P、Fe、Cu、Mn、Zn元素的含量，降低B含量，增加硝态氮，降低铵态氮，均可避免玻璃苗发生［17，18］.3.1.3.1 琼脂种类和浓度琼脂作为一种中性支撑物，在植物组培中已成为公认的事实.但许多研究表明，琼脂是形成玻璃苗的重要影响因素.戴桂林等发现，由于琼脂中N、Mg、Mn、Fe、B、Zn等含量的差异，导致玻璃苗发生率明显不同.可见，并不是琼脂的物理性质，而是其化学组成在影响玻璃苗发生［18］.张燕玲等报道，琼脂浓度与玻璃苗发生率呈极显著负相关(r=-0.982)，说明提高琼脂浓度是控制玻璃化的有效途径.但琼脂作为培养基的主要凝固剂，其浓度过高，会大大降低试管苗的繁殖系数，且生长缓慢［19］.3.1.3.2 碳源和植物激素在离体培养中，碳源的种类和含量对试管苗的玻璃化也有较大影响.Zimmerman等报道，接牵牛玻璃苗叶片的还原糖含量明显较高，而肌醇含量则较低［19］.另据郭达初等报道，用相同含量的葡萄糖替换蔗糖会增加香石竹嫩梢培养物的玻璃苗率.李云等在珠美海棠中也观察到了同样的现象，但认为葡萄糖和蔗糖对试管苗的影响未达到显著水平.张燕玲等研究表明，糖含量与丝石竹玻璃苗率呈极显著负相关，在含糖20 g/L的培养基中，玻璃苗率为100%，含糖60 g/L的培养基，玻璃苗率则降至70%.［17］培养基中的细胞分裂素易导致玻璃苗产生.周菊华等发现，同是瑞香芽外植体，当培养基中激素为KT+ IBA时，KT为1 mg/L和2 mg/L的玻璃苗率无多大差异，均为8.3%左右.使用相近浓度的BA+NAA时，玻璃苗率却猛增至37.5%.李瑶等在香石竹培养中［16，17］也发现，当6-BA浓度增加，玻璃苗的比例也增高.说明激素种类和浓度对玻璃苗的发生有重要影响.但激素对玻璃苗的影响程度随外植体种类和琼脂浓度的不同而异.Leshem等观察到，NAA的用量增加也会导致玻璃化，这可能是过量的NAA诱导了培养物内源细胞分裂素浓度过高造成的［15，17］.张燕玲等在试验中发现，加入细胞分裂素BA和KT.或是改变细胞分裂素的浓度，对丝石竹玻璃苗形成都没有影响.［18］另外，Debergh等认为外源赤霉素，Kevers等和Phan E.认为乙烯对玻璃化的发生没有明显的影响.而张昆瑜等观察到在培养基中加入乙烯前体ACC或乙烯利对克服香石竹试管苗玻璃化有良好作用.因此，外源激素对试管苗玻璃化的影响并不完全一致，有待进一步研究［21］.根据笔者的经验，在培养基中加入5～10 mg/L的PP333可以有效的防止少花龙葵试管苗玻璃化的出现，可以起到很好的壮苗的效果.3.1.3.3 封口材料陈龙清等在日本早小菊的培养中以棉塞封口的在不断继代中无一出现玻璃化，而以聚乙烯塑料薄膜封口的，随继代次数增加出现玻璃化，继代5次时有30%的玻璃苗出现［16］.李云等报道，球美海棠用塑料膜封口比纸封口材料显著地增加病情指数，只要降低培养瓶中的相对湿度，就可以降低玻璃苗率［15，17］.用棉塞和纸等透气性较好的封口材料封口有效地降低了容器中的相对湿度，从而抑制了玻璃苗的出现.此外，用40℃热水处理瑞香愈伤组织培养物，可以完全消除再生苗的玻璃化，且能够提高愈伤组织的芽分化的效率. Coors等报道，热击可降低内源细胞分裂素的水平，这也许是热击可以消除玻璃苗的原因［19］.培养基的pH值大小也能影响试管苗的玻璃化，香石竹在pH 6.2的培养基上的玻璃苗率要显著高于pH 7.0的培养基中玻璃苗率.聚乙烯醇(PVA)对试管苗玻璃化也有影响，均能降低玻璃苗的产生［18］.试管苗玻璃化现象是观赏植物快速繁殖和工厂化生产、茎尖脱毒、种质保存等方面的一大障碍，给生产造成极大损失.因此，在实际工作中，有必要采取措施使试管苗的玻璃化现象降低到最低限度，直至消除玻璃化现象.综合有关的资料和研究成果和笔者的实际工作经验，可以采取以下预防措施.(1)在MS培养基中，减少或除去NH4NO3，或采用低水平的NH4＋如，改良的MS和B5等基本培养基［16］.(2)适当降低细胞分裂素6-BA的用量，在继代培养中，采用附加不同种类和浓度的激素如KT，IBA等的培养基.(3)增加琼脂（1%以上）和蔗糖（4%以上）的用量，避免采用葡萄糖作碳源［19］.(4)在培养基中可附加聚乙烯醇(PVA)、活性炭等［15，16］.(5)用棉塞代替聚乙烯塑料薄膜作为封口材料，利用固体培养基，增加琼脂浓度，从根本上降低培养基中的水势［21］.(6)增强光照强度，如果有条件比如在温室里面可以置于太阳光中培养［15］.(7)在培养基中加入5～10 mg/L的PP333（多效唑）.近20年来，植物组培技术由于自身独特的优势，在无性系快速繁殖、脱毒苗的培育、加快育种进程、优良品种选育和种质资源低温保存等方面都取得了明显的经济效益、社会效益和生态效益，其在科研和生产应用上的作用也越来越重要.但是由于微生物污染、褐化、玻璃化和遗传性状变异等问题困扰和制约着植物组培的发展. 在接种和培养过程中，污染率常常高达10%以上.防止细菌特别是内源细菌污染是一项重中之重的工作.对此，目前的理想措施就是在培养基中加入抑菌剂、抗生素等.实践中，抗生素一般不稳定，遇酸、碱或加热都易分解而失去活性，对瓶苗的分化和生长有一定的抑制，在组培规模化育苗中应用，由于抑菌剂、抗生素不耐热，须人工在超净工作台逐瓶加入，工作量大，成本增加.从而降低经济效益，所以寻找和开发性能稳定、价格适宜的抑菌剂还有待更深入的研究.抗生素消除细菌的研究比较多，但是目前酵母菌污染的研究相对较少.霉菌污染在植物组培中造成的损失非常大.霉菌污染的一个重要特点是污染迅速，难控制.目前，关于霉菌污染抑制可采用制霉素，但同样存在不稳定，遇酸、碱或加热易分解而失去活性，工作量大，成本增加等问题，且该方面的研究还很少.有人建议用防腐剂抑制污染，但还未见报道.因此，加强组培过程中常见的菌(细菌、霉菌、酵母菌)防治技术研究非常必要［1-5］.引起组织培养过程中外植体褐变的因素不外乎两方面，一方面是外植体本身的原因，包括外植体的生理、生长状态、外植体的遗传特性等，另一方面是外植体所处的培养环境，包括培养基的成分及外界光、温、湿等条件的影响.抑制褐变的措施也是针对引起褐变的不同的原因着手，多项研究表明，防止组织培养过程中的褐变没有固定的模式，外植体不同，所采用的方法也是不一样的.到目前为止，组织培养过程中的褐变现象研究已进行了几十年，积累了大量的资料，也提出了各种假说.但还是不能确切地阐述组织培养褐变的详细过程.通过对褐变现象研究状况的回顾和了解，可以得到以下共识：组织培养褐变是酚类物质被氧化的结果，其中PPO能促进褐变的发生.引起褐变的因素是复杂的，就内因来讲，外植体材料的生理状态、基因型、同基因型的不同栽培条件、营养状况、生长部位和大小都会影响褐变的发生［15］；就外因而言，培养基的成分、外加激素的含量及比例、培养条件(温度、光照时间、光照强度、通气状况等)等也会影响褐变的发生，褐变的发生往往是多种因素同时作用的结果，在导致褐变的诸多因素中，膜结构的破坏或细胞中物质区域化分布的破坏是酚类物质的酶促氧化和组织发生褐变的关键.因此，深入了解有关机制对于从理论上认识组织褐变，找到影响褐变主导因子和克服褐变的有效方法，并从实践上防止褐变的发生，对解决组织培养生产过程中的褐变这一难题，促进组培技术的日臻完善，具有重要的理论和现实意义［10-14］.近年来，国内外对玻璃化现象的研究愈来愈深入.在对玻璃化现象的研究报道中，虽有材料的个体差异，但大多能得到相似的结果，在某些问题上已达成共识，更重要的是解决了许多疑点、难点.例如，已证实玻璃化现象只是植株的一种表型特征，其玻璃化的组织器官在一定条件下仍可恢复.高国训等均将玻璃化苗逆转为正常植株，说明玻璃化并不会遗传到后代.另外，叶绿素、蛋白质、木质素、酚、乙烯及各种酶活性变化在玻璃苗形成过程中的作用已基本弄清.因此，植物生理学、生物化学、组织培养学等多学科的合作将会为研究玻璃苗形成机理、可以普遍使用且经济有效的预防措施及玻璃苗逆转等提供更有利的条件，使组织培养这一生物技术发展得更加完善［15-19］.参考文献:［1］缪耀梅,李开彪,叶添谋.组织培养过程中污染和褐化的防治［J］.韶关学院学报:自然科学版,2003,24(6):102-103.［2］陈桂芳,娄利华.植物组织培养中几个常见的技术问题［J］.重庆林业科技,2000,(4):50-51.［3］杨海莲，孙晓璐，宋未.植物内生细菌的研究［J］.微生物学通报，1998，25(4)：224-227.［4］Knauss J F，Miller J W.contaminant,Erwinia carotovora,affecting commercial plant tissue cultures［J］.In Vitro,1978，14：754-756.［5］简兴，王米力，石大兴.红掌组培苗继代过程中细菌污染的防治试验［J］.亚热带植物科学，2003，32(2)：52-54.。
植物组培过程中的褐化问题
组培过程中的褐化问题许多植物的组织培养中发现有褐变现象，尤以木本植物组织培养中褐变严重。
褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。
褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。
[1] 褐变的机理正常细胞内，区域性分布使底物与PPO不能接触并不发生褐变，当细胞膜的结构发生变化和破坏时，酶和底物就结合在一块，在氧的作用下，生成醌，从而引起褐变。
引起褐变的条件：氧、引起褐变的酶、底物，缺一不可。
引起褐变的酶：多酚氧化酶（PPO是主要的）、过氧化物酶（POD）、、苯丙氨酸解氨酶等。
引起褐变的酶的底物：主要是酚类化合物，可分成3类：第一类是苯基羧酸，包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等；第二类是苯丙烷衍生物，包括肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等；第三类是黄烷衍生物，包括花青素、黄酮、芸香苷等。
[2] 影响褐变的因素因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。
A.植物种类及基因型红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。
豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题，橡胶的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织的诱导容易；而有些品系花药容易褐变，因而愈伤组织的诱导困难。
在组织培养中，有些品种、品系难以成功，而有些则容易成功。
油菜叶原生质体品种373褐化比品种94591、95386严重B.外植体部位及生理状态荔枝茎的愈伤组织中度褐变，而根的愈伤组织全部褐变。
欧洲栗幼年型的材料培养时含醌类物质少，成年型材料培养时含醌类物质多，后者比前者褐变严重。
油棕幼嫩外植体（如胚）培养较少褐变，高度分化的叶片接种后则容易褐变。
C.培养基成分及培养条件硬紫草从长期继代培养且次生代谢物含量高引起培养物的褐变。
组织培养褐化原因以及防止措施
褐化原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。
在组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题。
而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。
因此，能否有效地控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。
(一)褐变的原因影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。
1.与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。
一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。
多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。
2.与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。
因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。
3.与外植体取材时间有关一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。
即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。
4.与培养基有关过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。
例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。
植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。
培养基的PH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。
植物组织培养中的褐化现象及解决途径_郭艳
植物组织培养中的褐化现象及解决途径郭艳1，杨海玲2（1.山西林业职业技术学院园艺系，山西太原030009；2.唐山职业技术学院，河北唐山063000）摘要：外植体褐化是植物组织培养过程中经常遇到的问题，这已成为影响组培成功的主要障碍。
结合近几年的研究，对导致植物组织培养中外植体发生褐化的形式和发生机理、影响褐化的内外因素以及防止和减少褐化的基本途径等进行了阐述，并对解决组织培养中褐化这一难题提出了展望。
关键词：植物；组织培养；褐化；解决途径中图分类号：S311文献标识码：A文章编号：1002-2481（2009）07-0014-03Advances in Studies on Browning in Plant Tissue CultureGUO Yan 1，YANG Hai-ling 2（1.Department of Horticulture ，Shanxi Forestry Vacational College ，Taiyuan 030009，China ；2.Tangshan College of Vacational Technology ，Tangshan 063000，China ）Abstract ：M aterial browning is a problem in plant tissue culture and is a very important factor that can influence the success of plant bined with the recent years ’research,the purpose of this article is to summarize several aspects such as the theories of browning in plant tissue culture,the factors on browning,the countermeasures against browning in practice,and to discuss the possible solutions to the browning.Key words ：Plant;Tissue culture;Browning;Preventing methods收稿日期：2009-05-18作者简介：郭艳（1978-），女，山西和顺人，助教，硕士，主要从事植物与植物生理和果树栽培教学与研究工作。
山葵黑根病菌拮抗菌的筛选、鉴定及防治研究的开题报告
山葵黑根病菌拮抗菌的筛选、鉴定及防治研究的开题报告一、研究背景与意义山葵是我国传统的叶菜类蔬菜之一，具有风味独特、口感鲜美等优点，受到消费者的喜爱。
然而，近年来，由于气候变迁、种植密度过大、虫害病害的侵袭等因素，山葵栽培中出现了一些病害问题，其中黑根病是山葵的一种重要病害，它能够造成山葵根部组织腐烂，影响山葵生长发育，严重时会引起植株死亡。
传统的控制方法主要是采用化学药品进行喷洒土壤消毒，但长期使用化学药品会对环境造成污染，同时也会导致病菌产生耐药性，因此需要寻找新的病害防治方法。
利用拮抗微生物进行农业生产中的病害防治已经成为了一个热门的研究方向，因为相比于传统的化学药品，利用拮抗菌进行生物防治的方法更加环保、安全，而且不会对土壤产生负面影响。
二、研究内容和目的该研究的主要内容是：筛选出能够有效抑制山葵黑根病菌的拮抗菌，并对其进行鉴定，寻找其中具有较好效果的菌株，并进行进一步的研究。
研究的目的如下：1.筛选出适合防治山葵黑根病的拮抗菌，为黑根病的防治提供微生物防治的新方案。
2.确定最适合的防治方法，为山葵产业健康发展提供保障。
三、研究方法1.采集山葵黑根病菌样本进行分离纯化，并进行形态特征观察和生理生化指标检测，对其进行鉴定。
2.从山葵根际土壤中分离和筛选出潜在的拮抗菌株，通过体外和体内试验验证其对山葵黑根病菌的拮抗效果。
3.较好效果的拮抗菌株进一步进行生物学特性及遗传多样性等方面的研究。
四、预期成果本研究主要的预期成果如下：1.筛选出具有较好黑根病防治效果的拮抗菌株。
2.确定最适合的拮抗菌菌剂制备方法和处理方案，为山葵黑根病防治提供科学依据。
3.对具有拮抗效果的菌株进行初步的生物学研究，为其后续的推广应用提供理论基础和技术支持。
五、研究进度和计划本研究的工作计划如下：1.前期工作（3个月）：采集山葵黑根病菌的样本，并进行分离纯化和鉴定；同时，对山葵根际土壤中分离和筛选出的拮抗菌进行初步评估。
2.中期工作（6个月）：对具有较好拮抗效果的菌株进行体外试验和体内试验，筛选出具有较好效果的菌株，并对其进行生物学特性研究。
关于山药组织培养褐化反应的研究
关于山药组织培养褐化反应的研究论文关键词:山药组织培养外植体褐化抗氧化剂培养基质论文摘要:笔者从山药不同外植体(叶、茎段、零余子)、培养基中添加抗氧化剂和不同培养基质3个方面进行试验研究。
结果表明，山药不同外植体的褐化程度也不一样，茎段褐化程度最轻;MS培养基中添加150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)能有效抑制外植体的褐化;在山药组培苗的快繁阶段采用液体基质培养方式能显著降低褐化程度，提高山药组培苗成活率。
山药(Chinese yam)具有较高的药用价值及营养价值，主要食用器官为地下块茎，为大众化的滋补食品，通过组织培养技术不仅可进行快速繁殖，而且能使优良品种种性得以保存延续[1，2]。
但山药在组织培养过程中存在着严重的褐化发应，经常发现山药组培苗或外植体枯死及其基部培养基颜色黑褐化，这种褐化现象又称为酚污染，严重影响外植体的脱分化和培养物的再分化[3]。
因此，为了山药组织培养工厂化育苗的顺利进行，笔者就山药组织培养过程中的褐化现象及有效控制等方面进行了研究探讨。
1材料与方法1.1材料供试材料为寸金薯叶片、茎段、零余子等常用组培外植体为材料[2]，山药品种寸金薯来自福建龙岩大池镇。
1.2方法1.2.1不同外植体褐化反应研究观察从生长植株上取其幼嫩茎节间部茎段、完全伸展的叶片及结出的零余子为外植体，先将外植体用自来水反复冲洗后，在无菌条件下，用70%酒精消毒20~30s，再放入2%次氯酸钠溶液中消毒10~15min，再用无菌水漂洗3~4次，最后将外植体切成大小适合的小块接种在已配好的MS培养基中进行培养[1，2，4]。
叶片大小为0.3~0.5cm方形，茎段（含节间）0.6~0.8cm，零余子切成0.5~0.6cm左右大小的方块，琼脂0.7%，PH值为5.8，培养温度25±2℃，光照强度为2000lx，每天光照时间16h。
共3种处理，每种处理30瓶，每瓶一个外植体，重复3次，培养30d后观察外植体褐化程度。
真菌诱导子和抗褐变剂对喜树悬浮细胞生长及喜树碱生物合成的影响
真菌诱导子和抗褐变剂对喜树悬浮细胞生长及喜树碱生物合成的影响潘学武;董妍玲;石亚亚【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2010(0)20【摘要】研究真菌诱导子和抗褐变剂对喜树悬浮培养细胞生长和喜树碱合成的影响。
试验通过在喜树悬浮培养细胞的不同时期,加入不同浓度的真菌诱导子或抗褐变剂的方法,研究其对细胞生长和喜树碱合成的影响。
结果表明,米根霉提取物作为真菌诱导子,对喜树碱的生物合成最有效。
植酸作为抗褐变剂,对细胞生长和喜树碱的生物合成最有效。
在15天加入终浓度2g/L的植酸,再在18天加入终浓度30mg/L的米根霉诱导子处理,细胞干重在24天时达到最大值26.9g/L,是对照细胞干重最大值的1.2倍;喜树碱总产量在26天时达到最大值34.2mg/L,是对照总产量最大值的9.0倍。
对照的细胞干重和喜树碱总产量在20天时达到最大值。
喜树细胞悬浮培养中,添加真菌诱导子和抗褐变剂是提高喜树碱产量的有效方法之一。
【总页数】6页(P21-26)【关键词】喜树;喜树碱;真菌诱导子;抗褐变剂;悬浮培养【作者】潘学武;董妍玲;石亚亚【作者单位】武汉生物工程学院生物工程系;武汉大学生命科学学院植物发育教育部重点实验室;武汉生物工程学院生物技术系【正文语种】中文【中图分类】Q943.1【相关文献】1.Cu2+诱导刺激对喜树悬浮培养细胞喜树碱生物合成的影响 [J], 董妍玲;潘学武2.水杨酸对真菌诱导子诱导红豆杉悬浮细胞膜脂过氧化和紫杉醇生物合成的影响[J], 兰文智;余龙江;吴元喜3.黑曲霉真菌诱导子对喜树培养细胞喜树碱积累的影响 [J], 潘学武;董妍玲;石亚亚4.抗褐变剂对喜树细胞悬浮培养的影响 [J], 潘学武;董妍玲;石亚亚5.真菌诱导子对新疆紫草悬浮培养细胞的生长和紫草素合成的影响 [J], 刘长军;侯崇生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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２ 结果与分析
２．１ 不同抗褐化剂对山葵组培苗褐化的控制效果 由表 １可见，继代培养第 １个月时，山葵组培苗褐化程度
相对较轻且缓慢，除 ＤＴＴ０．０３５ｇ／Ｌ处理显著高于对照（Ｐ＜
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江苏农业科学 ２０１８年第 ４６卷第 ７期
０．０５）外，其他处理间差异不显著；继代培养第 ２个月时，不同 抗褐剂对山葵组培苗的抗褐化效果表现出一定差异，除活性 炭处理和 ＡｇＮＯ３２个低浓度处理没有出现褐化外，其他处理 均出现不同程度的褐化，其中，仅 Ｎａ２Ｓ２Ｏ３ ２．０００ｇ／Ｌ处理的 组培苗褐化指数显著高于对照（Ｐ＜０．０５）；继代培养第 ３个 月时，不同抗褐化剂的整体抗褐化效果依次为 ＡｇＮＯ３ ＞活性 炭 ＞维生素 Ｃ＞ＤＴＴ＞柠檬酸 ＞ＰＶＰ＞Ｌ－半胱氨酸 ＞清水 ＞ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３，其中，ＡｇＮＯ３３个浓度处理的组培苗褐化指数为 ０， 抗褐化效果显著优于对照（Ｐ＜０．０５），抗褐化效果相对最好， 活性炭抗褐化效 果 次 之，３个 浓 度 处 理 中，０．２００、０．８００ｇ／Ｌ 处理的组培苗褐化指数为 ０，低浓度的 ＰＶＰ、Ｌ－半胱氨酸、维 生素 Ｃ、ＤＴＴ及高浓度的柠檬酸也表现出较好的抗褐化效果， 但均没能完全消除褐化；继代培养第 ３个月时，Ｌ－半胱氨酸
山葵［Ｗａｓａｂｉｊａｐｏｎｉｃａ（Ｍｉｑｕｅｌ）Ｍａｔｓｕｍ］别 称 山 嵛 菜，为 十字花科山嵛菜属多年生草本半阴生植物，原产于中国和日 本，是一种名贵珍稀的香辛蔬菜，其浓辛辣味郁，具有利尿、清 热、发汗、解毒、杀菌、增进食欲、预防血栓、抑制癌细胞生长等 功效，被誉为“绿色黄金”，在日本、东南亚国家及港澳台地区 深受欢迎，是一种重要的出口创汇蔬菜［１－２］。目前，山葵主要 采用种子和分株繁殖，但繁殖速度慢、品性易退化，而山葵组 织培养技术可为山葵快速繁殖、复壮提供技术支持［３］。
江苏农业科学 ２０１８年第 ４６卷第 ７期
刘香江，杨 丽，吴红芝．山葵组培中抗褐化剂的筛选及其对增殖和生长的影响［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（７）：３３－３６． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．０７．００７
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山葵组培中抗褐化剂的筛选及其对增殖和生长的影响
刘香江，杨 丽，吴红芝
（云南农业大学，云南昆明 ６５０２０１）
摘要：以岛根 ３号山葵为试验材料，研究活性炭（ＡＣ）、聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）、Ｌ－半胱氨酸、柠檬酸、抗坏血酸 （维生素 Ｃ）、二硫苏糖醇（ＤＴＴ）、硝酸银（ＡｇＮＯ３）、硫代硫酸钠（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）这 ８种不同浓度抗褐化剂在山葵组培继代培 养过程中的抗褐化效果及其对山葵增殖和生长的影响。结果表明，活性炭、ＡｇＮＯ３ 抗褐化效果相对较好，活性炭 ０２００～０．８００ｇ／Ｌ、ＡｇＮＯ３０．００５～０．０２５ｇ／Ｌ继代培养 ３个月时的山葵组培苗褐化指数为 ０；维生素 Ｃ抗褐化效果次 之，Ｎａ２Ｓ２Ｏ３ 抗褐化效果相对最差；活性炭处理的植株长势相对最好，但增殖系 数 相对 较低，ＤＴＴ处 理 的 植 株 增 殖 系 数 相对最高，长势相对较好，但不能完全消除褐化；Ｎａ２Ｓ２Ｏ３ 处理的植株增殖系数相对最低，且长势最差。０．０２５ｇ／ＬＡｇＮＯ３ 处理的效果相对最好，继代培养 ３个月时的褐化指数为 ０，增殖系数为 ５．２２，且植株长势良好，为理想的抗褐化剂。 关键词：山葵；组织培养；褐化剂；增殖系数；活性炭；硝酸银 中图分类号：Ｓ５６７．２３＋９．０４３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）０７－００３３－０３
收稿日期：２０１６－１１－１４ 基金 项 目：云 南 农 业 大 学 ２０１５年 研 究 生 科 技 创 新 项 目 （编 号：
２０１５ｙｋｃ２９）。 作者简介：刘香江（１９９０—），女，云南红河州人，硕士，主要从事山葵
组织培养、多倍体诱导研究。Ｅ－ｍａｉｌ：１５４６２７７２６５＠ｑｑ．ｃｏｍ。 通信作者：吴 红 芝，博 士，教 授，主 要 从 事 花 卉 新 品 种 培 育 研 究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕｕ１１２８＠１６３．ｃｏｍ。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料 本试验于 ２０１６年在云南农业大学园林园艺学院组培室
进行，供试山葵品种为岛根 ３号，以山葵继代培养获得的丛生 芽为试验材料。 １．２ 试验方法
选取生长良好，且长势一致的丛生芽接种到继代培养基 ＭＳ＋０．２５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．０５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／ＬＫＴ＋蔗 糖 ３０ｇ／Ｌ＋琼脂 ６．２５ｇ／Ｌ（ｐＨ值为 ６．０）上，培养基中分别添 加活性炭（ＡＣ）、聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）、Ｌ－半胱氨酸、柠檬 酸、抗 坏 血 酸 （维 生 素 Ｃ）、二 硫 苏 糖 醇 （ＤＴＴ）、硝 酸 银 （ＡｇＮＯ３）、硫代硫酸钠 （Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）８种 抗 褐 化 剂，编 号 及 使 用 浓度见表 １，以不添加任何抗褐化剂的处理为对照。每处理 接种 １０瓶，每瓶接种 ４株苗，每株苗 ３个芽，重复 ３次。每隔 ３０ｄ统计 １次褐化指数［６］、增殖系数和组培苗生长情况，共观 察记录 ９０ｄ。培养条件为温度（１６±１）℃，光照时间 １２ｈ／ｄ、 光照度 ７２００ｌｘ。根据山葵组培苗褐化颜色，将山葵褐化程度 分为无、浅、中、较深、深、最深共 ６级，分别用 ０、１、２、３、４、５表 示，则褐化指数计算公式为：褐化指数 ＝∑（褐化级别 ×相应 褐化级别的株树）／（调查总株树 ×５）×１００％。增殖系数计 算公式为：增殖系数 ＝（调查当日总芽数 －接种芽数）／接种 芽数。组培苗生长情况根据肉眼观察，调查叶的大小、叶色、 茎粗细、是否有黄叶这 ４个指标。 １．３ 数据统计分析
褐化是由于植物材料在组织培养过程中受到伤害，体内 分泌的酚类物质在酚氧化酶作用下被氧化成褐色的醌类物 质 ［４］，而 醌 类 物 质 对 植 物 材 料 产 生 毒亡。在山葵组培快繁试验中发现，山 葵是一种对外界环境刺激特别敏感的植物，不适合的光照、温 度、湿度、激素等外界因子都会对山葵生长造成影响，使其褐 化，尤其在夏季最为严重。因此，解决山葵组培中的褐化问题 是山葵组织培养的关键技术之一。目前，有关山葵组织培养 的研究多集中在愈伤组织的诱导、苗的增殖、生根、复壮等，除 刘琴研究认为山葵的褐化现象会严重影响愈伤组织诱导的成 功率［５］外，有关其褐化的控制鲜见报道。本试验以继代培养 的山葵无菌苗为材料，通过在培养基中添加不同浓度的 ８种 抗褐化剂，观察统计山葵无菌苗褐化指数、增殖系数、生长情 况等，筛选出既能较好地控制组培苗褐化，又不影响其生长的 抗褐化剂类型及其适宜浓度，以期能较好地解决山葵组织培 养过程中的褐化问题。