【资源】自己整理的慢病毒质粒的知识
质粒的基本知识
质粒 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。
这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。
没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。
实验小站慢病毒系列（三）——慢病毒常见问题汇总
实验小站慢病毒系列（三）——慢病毒常见问题汇总实验小站慢病毒系列（三）慢病毒常见问题汇总◆ ◆ ◆◆常用术语病毒感染复数（MOI）：传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。
其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。
噬菌体的数量单位为pfu。
一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。
后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值，以下提到的MOI都是沿用这个概念。
然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。
能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。
MOI=病毒滴度×体积/细胞数量病毒的滴度（BT）：指单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。
滴度是一个病毒自身复制的数量概念，有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度，1）VP(病毒颗粒)或OPV（光学颗粒单位）2）GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3）PFU（空斑形成单位）4）TCID50（50%组织培养感染剂量）慢病毒技术中，病毒颗粒滴度（BT=TU/ml，transducing units）计算公式：TU/μl=(P×N/100×V)×1/DF，P=%GFP cells，N=转染时的细胞数，V=每孔加入病毒稀释液体积（μl），DF=稀释因子（dilution factor）=1（undiluted)、101（diluted 1/10）、102（diluted 1/100）常用慢病毒滴度检测方法常见问题解答Q.目前存在许多病毒载体系统，包括：腺病毒、逆转录病毒和慢病毒，针对我的实验应该使用哪个系统?腺病毒：针对大多数细胞有几乎100%的感染效率，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞，不整合到宿主细胞。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体(详细信息见附录及《质粒得扩增提取》）（大肠杆菌-８0℃保存2-3年,质粒-２0℃保存2—3年,病毒液—80℃保存１年)(１)载体质粒:两端得LＴR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp 得序列及位于env序列中得RRＥ,含宿主RNＡ聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）:包含了pｏl、gａｇ包装成分（３）包膜质粒（pＭD2、G):用其她病毒得包膜蛋白代替了ｅnv基因、三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力得病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTＲEME—ＧENＥ(－20℃保存，不可分装），一种脂质与其她组份构成得混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存)：5ＸPＥG800０／NaＣｌ溶液(聚乙二醇)：NaCl ８、766 g; PEG８00050ｇ溶解在2０0mｌMilｌi-Q纯水中,高压蒸汽灭菌＊＊也可直接从公司买来病毒液（—80℃封口膜封口冻存管保存,4℃保存３天）:滴度一般为10８TU/ml6、10ｍｇ/ml polyｂreｎｅ（-20℃分装保存）:溴化己二甲铵。
就是带正电得小分子，与细胞表面得阴离子结合,提高慢病毒对细胞得感染效率,通常加入pｏｌybrｅnｅ能提高感染效率２～1０倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度(1～１0μｇ/ｍl）7、无血清培养基:ｏｐtｉmｅn8、贴壁细胞(复苏后3代以上得细胞)９、puromｙcin:嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤＜一〉病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转)第一天１、种板,10×1０５个293Ｔ细胞，加入全培养基双抗ＤMＥM４—5ml，过夜2、配制5ＸPＥG８0０0/NaCl溶液称取NaCｌ8、766 g； PEG800０ 50g溶解在200ml Miｌli-Ｑ纯水中;1２1摄氏度３０miｎ湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天１、配管2、加入２ml全培养基DMEM3、将1加入2,孵育10ｈ，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9：00与1７：0０各收取一次5ｍｌ培养液,共20mｌ（－80℃保存)2、过滤:用孔径为０、４5mm得过滤器除去上清中得29３T细胞3、加入5ml 5ＸPEＧ８０0０/NaＣｌ溶液,每30miｎ－1ｈ上下摇匀一次4、４℃过夜第六天１、4℃,3500rｐｍ，20ｍiｎ２、弃上清,倒扣纸上静置1－2min，吸干残余液体３、加入120—１50μlＰBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶４、５0μｌ分装，—80℃保存。
质粒的基本知识
质粒质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。
这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。
没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。
慢病毒质粒常见问题汇总
慢病毒质粒常见问题汇总
Q1：逆转录病毒和慢病毒是一回事吗？可以用逆转录病毒包装质粒包装慢病毒吗？A1：慢病毒是逆转录病毒家族的一部分，通常称之为“逆转录病毒”的是逆转录病毒家族的另一个独立成员——g-逆转录病毒。
尽管慢病毒和g逆转录病毒使用相同的基因进行包装（即gag、pol和env），但这些蛋白质的亚型以及病毒的长末端重复序列（LTRs）是不同的。
慢病毒和逆转录病毒包装载体不能互换。
虽然差异看起来很微小，但决定了慢病毒和逆转录病毒之间的关键生理差异。
慢病毒能够进入一个完整的核膜，能感染分裂细胞和非分裂细胞，而逆转录病毒只能感染分裂细胞。
在选择合适的基因递送系统时，需要考虑特定的靶细胞或组织。
Q2：可以使用慢病毒转移载体进行瞬时转染吗？A2：技术上可以。
但是否真的有效，需要看情况。
大多数转移质粒使用弱病毒LTR启动子来驱动目的基因的表达。
因此，蛋白质表达水平往往比使用专门为瞬时表达设计的质粒载体或病毒转导时要低得多。
虽然不理想，但病毒结构的瞬时表达是一个有用的工具，它可以在投入大量时间和资源构建稳定的细胞系之前快速检查结构是否正常。
当瞬时表达病毒结构时，需要使用合适的细胞系。
一些常见的实验室细胞系，包括293细胞系，用腺病毒蛋白E1A永生化，该蛋白已被证明能抑制HIV-1 LTR 的表达。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
慢病毒包装步骤及经验总结
慢病毒包装步骤及经验总结慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的⼀种，它能够将靶基因导⼊到⼀些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从⽽⼤⼤增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若⼲代，可以进⾏稳转细胞株的筛选。
因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从⽽保证其⾼效表达并且对细胞不产⽣随机整合可能产⽣的伤害。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋⽩。
为产⽣⾼滴度的病毒颗粒，需要利⽤表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进⾏病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离⼼取得上清液后，可以直接⽤于宿主细胞的感染。
慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进⼊细胞后，在细胞浆中被其⾃⾝携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进⼊细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达⽬的蛋⽩或产⽣RNAi⼲扰。
慢病毒包装系统由⼀个包装质粒混合物（Mix）和⼀个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，如下图（图⽚来⾃MIT）：载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件等。
不同系统包装质粒混合物也不⼀样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，⽐例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋⽩的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调节因⼦rev基因，VSVG含有提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因。
以下介绍⽤293T细胞在六孔板（35mm）中包装病毒，其他孔板相应增加或减少体积。
准备试剂篇? 核⼼质粒；? 指数⽣长的293T细胞；? 病毒包装质粒Mix:1 µg/µl（Mix=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2），不同载体系统所⽤的包装病毒质粒也不⼀样，此系统可⽤于包装PBOBi，PLKO， Plv等载体质粒。
慢病毒制作
contorl
PEF
2、FUW-teto-表达载体慢病毒的包装
三质粒体系：FUW-teto，PMD.2G，PSPAX DOX诱导质粒
病毒包装注意
1、PMD.2G：PSPAX：目的质粒=1:2:3（共24ug） DOX辅助质粒同样视为目的质粒 2、感染时，目的病所有和病毒接触过的耗材均要用84消毒液处理
病毒收集
最后一次收集病毒后的转染GFP的293T细胞可以在荧光显微镜下观察GFP 阳性细胞，确定转染效率
收集后的病毒首先进行1200rpm，5min的离心，去除293T细胞后用0.45um 的 滤器过滤；
过滤后的液体分批用100.000NMWL的过滤柱过滤，过滤前用PBS把柱子润湿， 加PBS5ml后离心3000rpm，润湿后加15ml的病毒，4000rpm，4℃离心20分钟。 可收获浓缩病毒200ul左右。分装成小包装-80℃冻存备用。（millipore病毒离 心柱可重复使用三次） 每个10cm大皿可以收集30ml病毒，测定滴度后进行感染，浓缩的病毒分装 到小管可以-80℃，最多可以保存1年。
滴度(transduction units，TU)的测定公式: 如果加1ulGFP的浓缩病毒有10%的目的细胞为阳性的话，滴度= 10%×target cell numbers (1×104 for PEF) /0.001ml = 1×106TU/ml。 在感染目的细胞时用的病毒量按照计算出的滴度，使目的细胞能够达到 100%感染效率。
目的细胞病毒感染
接种目的细胞，密度1×104/孔/24孔板，接种的第二天换新鲜无双抗的普 通培养液进行感染，分别加入计算好滴度的病毒，同时加有8µg/ml的 polybrene来增强感染效率。感染后的24个小时换成新鲜的培养液。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
【资源】自己整理的慢病毒质粒的知识慢病毒——基因转移的潜在新载体用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。
目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等,但是这些载体均存在不足之处,严重影响了基因治疗的有效性及安全性。
在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。
慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞,还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点,在基因治疗中具有广泛的应用前景。
现以HIV-1 为例,就慢病毒载体的生物学特征、慢病毒载体的构建、在基因治疗中的应用以及生物安全性等方面作一综述。
一、慢病毒载体的生物学特征慢病毒包括灵长类慢病毒,如人类免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV) ,以及非灵长类慢病毒如猫免疫缺陷病毒( FIV) 、马传染性贫血病毒(EIAV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和维斯纳-梅迪病毒(VMV)等。
目前,HIV-1、HIV-2、SIV、FIV 及EIAV被广泛研究用作基因治疗的载体,而其中又以HIV-1最为热门。
1.1 HIV-1 病毒形态与结构成熟的HIV-1 病毒直径100～120nm、呈20 面体对称结构、球形,电镜下可见一致密圆锥状核心,内有病毒RNA 分子和酶,后者包括逆转录酶、整合酶(integrase) 和蛋白酶(protease)。
HIV-1的最外层为脂蛋白包膜,膜上有表面蛋白(gp120) 和相嵌蛋白(gp41) 两种糖蛋白,gp120为刺突,gp41为跨膜蛋白。
包膜内面为P17 构成的基质蛋白(matrix) ,包膜内为衣壳蛋白(P24)包裹的RNA。
1.2 HIV-1 病毒基因组结构及其功能特征HIV-1 的基因组由两条相同的正股RNA 链在5′端通过部分碱基互补配对而成二聚体。
病毒基因组全长约9200bp ,含有gag、pol、env3 个结构基因以及tat 、rev、nef 、vif 、vpr 、vpu 6 个调节基因。
在病毒基因组的5′端和3′端各有相同的一段核苷酸序列,称为长末端重复序列(long terminal repeat ,LTR) 。
gag基因编码p55的蛋白前体,经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7) 、内膜蛋白 (p17) 和衣壳蛋白(p24) 。
pol 基因编码病毒复制所需的酶类,env 编码gp120 和gp41 两种包膜糖蛋白,决定病毒感染宿主的靶向性。
tat 基因编码的gp14 是一种反式激活的转录因子,与LTR 结合后能促进病毒所有基因的转录。
rev 基因编码的产物gp19 能促进未经拼接的大mRNA 分子从细胞核向胞浆转运,并相对减少拼接后小mRNA 分子的数量。
nef 基因编码负调节蛋白,对病毒的结构蛋白和调节蛋白的表达均有下调作用。
vif 编码产物与病毒体的感染性有关,vpu 产物与病毒的装配、成熟和释放有关,而vpr 编码产物的功能尚不清楚。
1.3 HIV-1 生活史HIV-1 病毒通过gp120 与宿主细胞的CD4 分子和趋化因子受体结合,然后将病毒的基因(RNA) 、蛋白及酶等释放到宿主细胞内;随后,逆转录酶将病毒RNA 转录成DNA,病毒DNA 在整合酶的作用下插入宿主细胞核的基因组中,此时的病毒DNA 也称为原病毒;紧接着,原病毒转录成mRNA ,mRNA 从细胞核进入细胞质,并利用宿主细胞的原料合成病毒的各种成分(蛋白质) ,新合成的各种蛋白、酶及RNA 等聚集在宿主细胞的膜下,病毒的包膜蛋白(gp120 ,gp41) 插入宿主细胞的细胞膜并形成一种未成熟的病毒(此时病毒无传染性) ;最后蛋白酶将病毒核心中的许多过长的蛋白及酶切短,便形成成熟的病毒。
病毒利用宿主细胞的细胞膜将自己包被起来,离开该细胞去寻找新的宿主。
1.4 慢病毒载体转导非分裂期细胞的分子机制慢病毒载体能转导非分裂期细胞,3 种分子元件决定了这种能力:MAN、IN 和vpr 。
这3 类蛋白利用细胞核的输入机制,靶向作用于细胞核的前整合复合物( PIC)。
细胞核的输入系统包括: 胞质蛋白、importin-a 、importin-b 及核孔蛋白。
importin-a含有一个细胞定位序列(NLS) 的结合位点,当含有NLS的蛋白与importin-a 结合在一起,发生构象变化,与importin-b 相互作用,然后importin-b通过与核孔蛋白结合,靶向作用于核孔复合物。
而在实际构建时,vpr 可以完全敲除而不影响慢病毒载体感染非分裂期细胞的能力。
二、慢病毒载体的构建2.1 早期HIV21 来源的慢病毒载体早期构建的HIV21 来源的慢病毒载体,是作为研究HIV21生物特性的工具,而非作为基因转移载体。
该慢病毒载体包含了完整的病毒基因组,仅仅是在env 基因框内插入了一个报告基因,由于存在病毒滴度较低,以及产生有复制能力的反转录病毒(RCR) 的巨大风险,这种载体从未被考虑用于基因治疗。
但是,这种载体可以应用于病毒的生物学研究。
2.2 第一代HIV-1 来源的慢病毒载体以Naldini以及Kafri构建的三质粒系统为代表。
该载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3 种质粒组成。
载体质粒携带了5′端LTR 和全部5′端非翻译区域(包括gag 编码序列的350 个核苷酸) ,另外还带有rev 应答元件(Rev responsive element ,RRE) 及3′端LTR。
其瞬时表达盒采用巨细胞病毒(CMV) 启动子及增强子元件,在某些研究领域,可以携带绿色荧光蛋白基因、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因作为生物标记。
包装质粒由HIV-1 前病毒基因组作简单修改得到,其5′端LTR 由异源病毒启动子/ 增强子元件取代。
为了防止来自辅助质粒的RNA 衣壳化, 特意将5′端主要剪接供体位点 (splice donor site) 和gag 编码序列起始端之间的包装信号区(E/Ψ region) 删除,而下游的启动子由外源多聚腺苷酸信号(poly A)取代。
另外,利用点突变将env 编码序列打断,但仍然保留rev 反应元件。
这样的辅助结构能表达所有的病毒蛋白,包括tat 及rev(env除外) 。
env 由单独的包膜质粒携带并在病毒生产过程中共转染后表达。
本系统包膜质粒的改进之处在于,引入了VSV-G 基因表达包膜结构,这样做的结果至少具有3个方面的积极意义: ①包膜的更换进一步降低了HIV-1 载体恢复成野生型病毒的可能; ②使HIV 载体感染宿主的范围不再仅限于CD4 + 细胞,而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞; ③VSV 的包膜赋予HIV 载体颗粒高度的稳定性,使其能够通过超速离心而浓缩,达到高滴度。
使HIV-1 载体滴度由105 转录单位(TU) / ml 达到 108TU/ ml 。
这样的改进无疑是HIV 载体系统走向应用而迈出的一大步。
2.3 第二代HIV-1 来源的慢病毒载体尽管第一代载体产生RCR 的几率极小,仍然不能忽略产生的可能性。
毕竟包装质粒可以表达除env 外所有HIV-1 病毒蛋白,其中部分蛋白与HIV-1的毒力密切相关,且已发现部分蛋白对细胞存在潜在的毒害作用,比如:vpr 可引起细胞周期停滞,vif能抑制某些细胞的生长而Nef 能引起凋亡。
1997年,Zufferey 等将包装质粒上的 vif 、vpr 、vpu 和nef 基因敲除,从而得到第二代慢病毒载体,而其他方面与上述第一代载体系统一致。
研究发现即使全部4 个调节基因都被敲除。
病毒颗粒的产量也不会受到影响。
这种载体仍然具有体外感染非分裂期细胞、在体感染分化成熟大鼠神经元的能力,但是目前尚不能确定这种载体是否能转染全部种类细胞。
由于敲除的调节基因与野生型HIV-1 病毒的生活周期以及毒力密切相关,所以这些载体即使发生多位点重组形成RCR ,亲代病毒仍不具有致病性。
2.4 第三代HIV-1 来源的慢病毒载体利用慢病毒来源的包装系统的最大问题在于生产过程中可能产生复制型病毒。
当质粒DNA 转染进入包装细胞,以及辅助质粒及载体质粒的RNA 包装入同一病毒颗粒时,将有可能发生重组。
减少这种可能性的方法之一就是减少辅助质粒与载体质粒的同源性。
另一个方法便是将gag/ pol 和rev 编码序列隔离,分散在不同的质粒。
这样的包装系统需要四质粒来代替原有的三质粒包装系统。
质粒一携带了gag/ pol 编码序列及RRE;质粒二包含了编码rev 的序列;质粒三是载体质粒;质粒四表达env。
采用四质粒代替三质粒系统、除去tat 均减少了产生复制型病毒的可能性,从而增加了载体系统的安全性。
2.5 自身失活型(SIN) 慢病毒载体由于具有逆转录方式的特点,在逆转录过程中存在于病毒基因组3′端U3 区的启动子/增强子元件将被复制,并置于前病毒两端的LTR。
因此,3′LTR 的U3 区启动子发生失活突变后,将在逆转录过程中转移至5′LTR。
如果这样的载体整合入靶细胞,将不会产生完整长度的载体RNA ,因此命名为“自身失活型载体”。
这种技术最先应用于莫洛尼氏小鼠白血病病毒(MoMLV) 载体和鸟类的脾坏死病毒(SNV) 载体。
进一步研究表明,U3 区的频繁突变将导致病毒滴度下降,原因是该区域的某些序列是载体有效多聚腺苷酸化所必需的。
在HIV-1 基因组内,核心多聚腺苷酸化信号存在R 区。
现已证实,U3 区序列能影响多聚腺苷的酸化效率。
与MoMLV 相比,将HIV-1的3′LTRU3 区(除上述多聚腺苷酸化增强相关序列,以及病毒整合酶识别的U3 区5′末端外) 删除后并不会影响滴度。
这种删除能确保病毒RNA 逆转录并整合入靶细胞染色体后,从5′LTR 端启动子起始的复制被有效抑制。
这种设计的另一个优势是能增强瞬时表达效率,这可能与减少了病毒LTR 和细胞启动子之间的启动子竞争有关。
2.6 其它类型在改进慢病毒载体生物安全性的同时, 科学家们在基因转移效率方面对病毒载体做了一些改构,以期提高目的基因的转导效率及在靶细胞中的表达效率。
Zufferey 等将美洲旱獭肝炎病毒的翻译后调节元件(WPRE) 插至载体3′末端。
翻译后水平WPRE可以促进转录物出核,还可以通过上调初级转录物的多聚腺苷化,来增加胞内信使RNA 总量,最终改进转移基因的表达效率。
另外,科学家尝试在SIN 载体中修复118bp 的cPPT序列,发现在分化与非分化灵长类动物细胞中,载体转导效率显著提高。
三、慢病毒载体的包装大部分研发人员目前都使用瞬时转染293T 细胞的方式生产病毒载体。