丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书
血清丙型肝炎病毒抗体检测作业指导书
血清丙型肝炎病毒抗体检测作业指导书（ELISA）原理在微孔条上预包被丙型肝炎病毒（HCV）重组嵌合抗原，采用ELISA法检测丙型肝炎病毒抗体。
样品加入已有样品稀释液的包被抗原反应孔，在随后的温育过程中，若样品中含特异抗体，则该抗体与包被抗原形成抗原抗体复合物被吸附到固相，再加入酶标记的第二，最终形成抗原-抗体-酶标二抗复合物，洗涤除去未结合的游离酶，加入显色剂后显色。
标本采集2.1 采集前病人准备：受检者应空腹2.2 标本种类：血清或血浆2.3 标本要求：采集病人静脉血2ml，室温放置不超过4小时，分离血清备用。
标本储存：2-8°C保存不应超过1周，-20°C不应超过3个月，-70°C长期保存，应避免反复冻融。
标本运输：密封，室温运输。
标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。
试剂6.1 试剂名称：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒6.2 试剂生产厂家：河南华美生物工程有限公司。
6.3 包装规格：96Test/Kit6.4 试剂盒组成：包被反应板，样品稀释液，酶标记抗体，阳性对照血清，阴性对照血清，浓缩洗涤液，底物A，底物B，终止液，封口膜，密封袋。
6.5 试剂储存条件及有效期：2-8°C避光保存，有效期6个月。
仪器设备7.1 仪器名称：自动酶标仪7.2 仪器厂家：KHB7.3 仪器型号：ST360操作步骤8.1 平衡：将试剂盒各组分取出，平衡至室温（18-25°C），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。
8.2 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。
8.3 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。
8.4 加样品稀释液：用加样器在微孔反应条板孔中加入样品稀释液，每孔100μl，空下四孔准备加对照。
8.5 加标本和留空白：将每份待检标本各10μl分别加入已有样品稀释液的各孔中，留下一孔不加标本作空白对照，标好位置。
丙型肝炎病毒核酸定量检测操作程序
丙型肝炎病毒核酸定量检测操作程序
标本编号：操作时间：操作者：
1、将RNA提取液A和B及样品从-20℃取出，平衡至室温
（ - ）。
2、用移液器加（）ul血清到（）ul RNA提取液A和（）ul RNA提取液B中，振荡混匀。
3、将混匀好的标本静置（）分钟，放入高速冷冻离心机（）转离心（）分钟。
4、弃上清，沉淀中加入（）ul 75%的预冷乙醇洗涤(预冷乙醇用DEPC水配置）。
5、将洗涤好的标本放入高速冷冻离心机（）转离心（）分钟,弃上清，沉淀再用（）ul 75%的预冷乙醇洗涤一次。
6、弃上清(切忌吸头碰到沉淀），沉淀用（）℃恒温（）分钟烘干，放置到室温。
7、加（）ul反应液，（）ul逆转录酶，（）℃（）分钟进行逆转录，（）℃（）分钟灭活，（）转瞬时离心。
8、吸取（）ul上清到反应管，瞬时离心（）秒。
9、将反应管通过传递窗到产物扩增区准备扩增。
10、用ABI 7500扩增仪进行扩增.。
丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书
丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书1.目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的丙型肝炎病毒核酸的定性检测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断。
2.范围适用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。
3. 职责操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。
专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。
实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。
4. 原理采用荧光PCR技术，以丙型肝炎病毒基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行一步法RT-PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT)实现对未知样本的检测。
另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。
5. 样本要求适用标本类型：血清标本采集用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血 2 ml，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min；吸取上层血清，转移至灭菌离心管。
标本保存和运送所采集的标本可立即用于测试或长期保存于-70℃，也可保存于-20℃待测，保存期为3个月，标本应避免反复冻融。
标本运送采用干冰（或者冰袋）保持低温，运输时间不应超过4天。
拒收标本：拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆。
6. 仪器和试剂设备AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。
试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司产品标准批号：YZB/国 7271-2013最低检出量：最低检出量为500 IU/ml试剂各组分见表1：表1 试剂盒组分表7. 操作步骤试剂准备（试剂储存和准备区）进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面，并在检验流程记录表上做相应记录。
PCR反应液配制取出HCV反应液A、HCV反应液AB，室温溶化后振荡混匀，8000rpm离心数秒后使用。
PCR定量丙肝RNA作业指导书
丙型肝炎病毒(H C V)核酸扩增(PCR)荧光定量检测标准操作程序一、目的：明确丙肝病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行丙肝病毒核酸定量的检测,保证检测结果及时可靠。
二、范围：适用于进行丙肝病毒核酸定量检测的检验人员。
三、职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
四、检测原理：本试剂盒从血清或血浆中提取HCV RNA，在逆转录酶作用下将RNA逆转录为HCV cDNA，在引物的指导下，以四种脱氧核苷酸为底物，通过耐热DNA聚合酶的酶促作用，对cDNA进行体外扩增，用Taqman探针法检测扩增产物。
通过标准曲线，即可计算出被检物的含量。
五、试剂：1. 来源：上海复星HCV核酸扩增荧光定量检测试剂盒〕。
2. 规格：32人份/盒。
3. 试剂盒组成：3.1 病毒RNA提取试剂：用于从血清或血浆中提取HCV RNA。
裂解液 4ml×1瓶含有硫氰酸胍的溶液助沉剂1瓶含有助沉剂的冻干粉末去抑制剂1瓶含有去抑制剂的冻干粉末洗涤液A 14ml×1瓶含有硫氰酸胍的溶液洗涤液B 4ml×1瓶含有Tris的溶液洗脱液1×2支含0.04% NaN3的灭菌双蒸水（无RNase）核酸提取柱32支×1包含连接套管3.2 核酸扩增（PCR）―荧光检测试剂：RT―PCR试剂PCR主反应液 250ul×1支含有一对引物和dNTP的溶液酶混合物 180ul×1支含有Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂的溶液荧光探针20ul×1支含有荧光探针的溶液250ul×1支阴性对照含有0.05% NaN的HCV RNA阴性的混和人血清3强阳性对照 250ul×1支含有约2×106 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA弱阳性对照 250ul×1支含有约2×104 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA工作标准品1 250ul×1支含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA工作标准品2 250ul×1支含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA工作标准品3 250ul×1支含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA工作标准品4 250ul×1支含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA工作标准品①～④的参数和强、弱阳性对照的定值允许范围根据批号不同而不同。
丙型肝炎病毒IgG抗体定量测定作业指导书
丙型肝炎病毒IgG抗体定量测定作业指导书一、目的：规范丙型肝炎病毒IgG抗体测定的标准操作程序，确保丙型肝炎病毒IgG抗体测定的结果准确有效。
二、适用范围：在AutoLumo A2000化学发光检测仪上定量测定人血清中的丙型肝炎病毒IgG抗体。
三、临床意义丙型肝炎是一种广泛流行的病毒性疾病，据 WHO调查，全世界估计有1.7亿人感染丙型肝炎病毒 (HCV)，在不同的国家慢性丙型肝炎病毒感染的流行病学统计是在 0.5％～20％，我国一般人群抗 HCV阳性率为3.2％。
而急性丙型肝炎绝大多数都会形成有慢性感染的过程，慢性丙型肝炎病毒感染是肝硬化和肝癌的主要原因之一[1,2]。
丙型肝炎的诊断有赖于 HCV抗体的血清学检定及病毒学检测。
HCV抗体阳性代表机体对病毒感染的应答，一般在感染 1～2月后出现抗体，急性和慢性丙型肝炎的区别在于 HCV核心 IgG量的差异，慢性病人的 IgG抗体水平比急性的要高些，并且通常有更长的免疫活性。
通过自然恢复或经治疗清除病毒的急性丙型肝炎患者，IgG会在几年之后消失或低于检测下限而无法检出[3]。
临床上也应注意到一些血液透析、免疫功能缺陷和自身免疫性疾病患者可出现抗-HCV假阳性，可以采用抗-HCV RIBA或HCV RNA检测确认，有助于确诊这些患者是否合并感染HCV。
四、方法原理本试剂盒采用间接法原理进行检测。
以HCV抗原包被磁微粒，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG制备酶结合物，通过免疫反应形成抗原－抗体－酶标记抗体复合物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与HCV IgG抗体的含量成正比。
五、标本的采集与处理5. 1. 采用正确医用技术收集血清样本（详见标准血液标本前处理流程）。
5.2. 样本中勿添加叠氮钠作为防腐剂。
5.3.样本中的沉淀物和悬浮物可能会影响试验结果，应离心除去，并确定样本未变质方可使用。
5.4. 样本处理、收集后在室温放置不可超过8小时；如果不在8小时内检测需将样本放置在2～8℃的冰箱中；若需48小时以上保存或运输，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。
丙型肝炎病毒操作规程
丙型肝炎病毒操作规程
《丙型肝炎病毒操作规程》
一、引言
丙型肝炎病毒是一种引起慢性肝炎的病毒，其传播途径主要包括血液传播和性传播。
在进行丙型肝炎病毒的实验操作时，需要严格遵守相关的操作规程，以确保实验人员和周围环境的安全。
二、实验室安全措施
1. 实验室应配备相应的专业化安全设备，包括生物安全柜、防护眼镜、手套等，并应定期维护和检查；
2. 实验室工作人员应接受相关的防护培训，并定期进行健康检查；
3. 实验室应定期清洁消毒，确保无菌环境。
三、操作规程
1. 操作人员在进行丙型肝炎病毒实验操作前，应穿戴好防护服装和防护设备；
2. 实验操作前，应做好必要的实验准备工作，准备好所需的材料和试剂；
3. 实验操作时，应严格按照操作规程进行，不得随意更改实验步骤；
4. 实验操作结束后，应做好实验设备的清洁消毒工作，并及时处理好实验废物。
四、应急措施
1. 在实验操作中如发生意外情况，应立即停止操作，并及时向上级主管报告；
2. 意外情况发生后，应根据相关应急预案进行处理，确保实验人员和周围环境的安全。
五、结语
丙型肝炎病毒的实验操作需要严格遵守操作规程，以确保实验人员和周围环境的安全。
希望通过本规程的制定和执行，能够有效预防丙型肝炎病毒的传播，并为研究工作提供安全保障。
（第六册）PCR室作业指导书检验SOP文件正文
（第六册）PCR室作业指导书检验SOP文件正文ISO15189质量管理体系范本文件（第六册）PCR室作业指导书文件编号：ABCD-3-PR-01~31第A版编制：审核：批准：生效日期：2006年8月8日ABCD人民医院检验科编制说明本分册文件可以作为单独申请卫生部PCR实验室认可的全套作业文件，因此作为ISO15189质量管理体系的PCR室作业文件，要对其重复部分进行删减，各检验科根据各自用途要求与特点进行选用，特此说明。
2006年8月8日目录修订页PCR实验室的设置及管理1．目的：建立实验室的合理设置和科学管理，防止实验污染，保证检测结果的可靠性。
2．适用范围：本程序适用于分子诊断室的设置、工作流程和日常管理等。
3．负责人：4．细则：4．1 分子诊断室为检验科下设的专业实验室，从事临床标本的基因扩增检测及相关科研工作。
4．2 本实验室采用实时荧光定量PCR技术作为临床基因诊断的主要手段，实验室分为三个区：试剂准备区（第一区）、标本处理区（第二区）、扩增分析区（第三区）。
每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。
各区标签颜色：红色（第一区）、白色或绿色（第二区）、蓝色（第三区）；专用工作服：粉红色（第一区）、白色（第二区）、蓝色（第三区）。
标本的接收则在检验科标本接收处进行。
4．3 各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，不可混用。
4．4 各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP文件。
4．5 严格遵守从“试剂准备区→标本处理区→扩增分析区”的单一流向制度，不得逆向进入前一工作区。
4．6 非本实验室工作人员，未经许可不得入内；进修、实习或其他科室人员因科研活动需要，进入实验区域（试剂准备区、标本处理区、扩增分析区）需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行，在本实验室人员监督指导下进行。
4．7 实验完毕后做好清洁消毒工作。
丙型肝炎病毒抗体IgG (抗-HCV·IgG)标准操作程序SOP文件
4、加酶：除空白对照孔外，每孔加入2滴酶标记物，轻轻振荡封板后，置37℃水浴15分钟。
5、洗涤：同步骤3。
6、显色：每孔加底物液A、B各1滴，轻拍混匀后，置37℃水浴15分钟。
7，每孔加终止液50ul。
2、试剂用前先平衡至室温。含血球的标本易出现假阳性，应避免使用。
3、未用完的板条应及时封存于易封袋中。
4、滴加试剂前，应将滴瓶翻转数次混匀。滴加时瓶身应保持垂直。
5、若浓缩洗涤出现结晶，可于37℃放置至溶解。洗涤要充分，各孔均须加满，防止孔口内游离酶不能洗净。
6、本试剂盒应视为为有传染性物质，请按传染病实验室规程操作
临界值（C.O.）=0.140+阴性对照平均OD值；
样本OD值＞临界值,为抗-HCV·IgG阳性;否则为阴性。
注：阴性对照孔OD值小于0.05时，按0.05计算；大于0.05时，按实际值计算。
[质量控制]
每批检测同步进行质控品测定，绘制室内质控图。其它按室内质量控制管理规定进行。
[参考范围]
酶联免疫吸附试验：阴性
[临床意义]:
（1）在输血后患肝炎有80－90%的病人是丙型肝炎，其中大部分为阳性。
（2）在乙型肝炎患者中，特别是经常使用血制品（血浆、全血）的病人可以引起丙肝病毒的合并感染，使疾病转为慢性化、肝硬化或者肝癌。所以对乙型肝炎的复发病人或是慢性肝炎病人要进行HCV－Ab的检测。
[注意事项]
1、不同批号的试剂不可混用。
ＡＢＣＤ医院
免疫实验室
文件编号：
ABCD-SOP-01-15
丙型肝炎病毒抗体IgG(抗-HCV·IgG)
丙型肝炎病毒(HCV)核酸定量检测标准操作规程(PCR-荧光探针法)
丙型肝炎病毒（HCV）核酸定量检测标准操作规程（PCR-荧光探针法）1.目的：规范HCV-RNA（PCR）检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围：HCV-RNA荧光定量检测。
3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献：4.1 中山大学达安基因股份有限公司丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书。
4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书。
5.内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法5.2 实验原理：用一对丙型肝炎病毒特异性引物和一条丙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以逆转录液、逆转录酶、PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，先将RNA逆转录成cDNA，再通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测,从而检测丙型肝炎病毒RNA。
主要用于HCV病毒感染的辅助诊断及其疗效监测的标准。
5.3 性能参数：5.3.1精密度：检测下限为1.0x103copies/ml。
5.3.2 线性范围：1.0x103～1.0x108copies/ml。
5.4 标本采集：5.4.1 使用标本类型：血清。
5.4.2 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集，采集后及时分离出血清在2～8℃条件下保存。
用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.4.3 标本保存和运送：分离后的血清在2～8℃条件下保存应不超过72小时，-20℃可保存1个月，要长期保存的需分装后储存于-70℃。
丙型肝炎病毒IgG抗体定量测定作业指导书
丙型肝炎病毒IgG抗体定量测定作业指导书一、目的：规范丙型肝炎病毒IgG抗体测定的标准操作程序，确保丙型肝炎病毒IgG抗体测定的结果准确有效。
二、适用范围：在AutoLumo A2000化学发光检测仪上定量测定人血清中的丙型肝炎病毒IgG抗体。
三、临床意义丙型肝炎是一种广泛流行的病毒性疾病，据 WHO调查，全世界估计有1.7亿人感染丙型肝炎病毒 (HCV)，在不同的国家慢性丙型肝炎病毒感染的流行病学统计是在 0.5％～20％，我国一般人群抗 HCV阳性率为3.2％。
而急性丙型肝炎绝大多数都会形成有慢性感染的过程，慢性丙型肝炎病毒感染是肝硬化和肝癌的主要原因之一[1,2]。
丙型肝炎的诊断有赖于 HCV抗体的血清学检定及病毒学检测。
HCV抗体阳性代表机体对病毒感染的应答，一般在感染 1～2月后出现抗体，急性和慢性丙型肝炎的区别在于 HCV核心 IgG量的差异，慢性病人的 IgG抗体水平比急性的要高些，并且通常有更长的免疫活性。
通过自然恢复或经治疗清除病毒的急性丙型肝炎患者，IgG会在几年之后消失或低于检测下限而无法检出[3]。
临床上也应注意到一些血液透析、免疫功能缺陷和自身免疫性疾病患者可出现抗-HCV假阳性，可以采用抗-HCV RIBA或HCV RNA检测确认，有助于确诊这些患者是否合并感染HCV。
四、方法原理本试剂盒采用间接法原理进行检测。
以HCV抗原包被磁微粒，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG制备酶结合物，通过免疫反应形成抗原－抗体－酶标记抗体复合物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与HCV IgG抗体的含量成正比。
五、标本的采集与处理5. 1. 采用正确医用技术收集血清样本（详见标准血液标本前处理流程）。
5.2. 样本中勿添加叠氮钠作为防腐剂。
5.3.样本中的沉淀物和悬浮物可能会影响试验结果，应离心除去，并确定样本未变质方可使用。
5.4. 样本处理、收集后在室温放置不可超过8小时；如果不在8小时内检测需将样本放置在2～8℃的冰箱中；若需48小时以上保存或运输，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。
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丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书1.目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的丙型肝炎病毒核酸的定性检测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断。
2.范围适用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。
3. 职责3.1 操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。
3.2 专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。
3.3 实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。
4. 原理采用荧光PCR技术，以丙型肝炎病毒基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行一步法RT-PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT)实现对未知样本的检测。
另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。
5. 样本要求5.1 适用标本类型：血清5.2 标本采集用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2 ml，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.3 标本保存和运送所采集的标本可立即用于测试或长期保存于-70℃，也可保存于-20℃待测，保存期为3个月，标本应避免反复冻融。
标本运送采用干冰（或者冰袋）保持低温，运输时间不应超过4天。
5.4 拒收标本：拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆。
6. 仪器和试剂6.1 设备AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。
6.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司产品标准批号：YZB/国7271-2013最低检出量：最低检出量为500 IU/ml试剂各组分见表1：表1 试剂盒组分表7. 操作步骤7.1试剂准备（试剂储存和准备区）7.1.1 进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面，并在检验流程记录表上做相应记录。
7.1.2PCR反应液配制7.1.2.1 取出HCV反应液A、HCV反应液AB，室温溶化后振荡混匀，8000rpm离心数秒后使用。
7.1.2.2取出N个（N = 待测样本数+ 4个HCV阳性定量标准品+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品+空白孔）PCR反应管，HCV单人份扩增体系配制见表2：表2PCR反应液配置表将各组分充分混匀，混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将30 ul扩增体系分装到PCR反应管，反应液分装时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区。
7.1.3 75%乙醇配制：取2.25 ml的DEPC H2O，加入6.75ml的无水乙醇，振荡混匀，配制成75%乙醇，盖紧盖子，经传递窗传递到标本制备区。
7.2 RNA提取（标本制备区）7.2.1 进入标本制备区，从传递窗中取出PCR反应管和75%乙醇，放入标本制备区冰箱冷藏。
7.2.2 从冰箱取出待测样本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、RNA提取液A、RNA 提取液B和内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。
7.2.3 打开金属浴，调节温度为65℃，使仪器自动升温。
7.2.4用镊子夹取n个1.5 ml灭菌离心管放于安全柜内离心管架上。
（n= 待测样本数+ 3 = 待测样本数+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品）7.2.5向离心管中各加入10 ul内标溶液，再分别加入200ul样本，800 ul RNA提取液B，盖紧管盖，振荡混匀15s以充分混匀，室温放置5min（每隔1min旋涡振荡5s，使裂解更充分，处理结束后瞬时离心。
）7.2.6加入200 ul无水乙醇，盖紧管盖，漩涡振荡混匀15s以充分混匀，瞬时离心，再加入20 ul RNA 提取液A，漩涡振荡混匀5s，室温静置1min。
8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。
7.2.7 再加入200 ul RNA提取液B，盖紧管盖，充分混匀（用移液枪吹打），室温下8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。
7.2.8 加预冷的75%乙醇400ul充分混匀，8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。
7.2.9加预冷的75%乙醇400ul充分混匀，8000 rpm离心1min，小心吸弃上清。
7.2.10 打开管盖，放入金属浴，65℃干燥5 min，使液体挥发完全。
7.2.11 温育5min后，用镊子从金属浴中取出离心管，加入50 ul DEPC H2O，用移液枪吹打混匀，室温静置1min后，8000 rpm离心1min。
离心管内的上清液即为病毒核酸溶液，建议立即使用，如需保存，置于-70℃。
7.2.13 取出已分装好的PCR反应管，向对应编号的PCR管中加入处理好的的样品（包括待测标本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品）上清液各20 ul，空白对照不加模板，盖紧反应管。
8000rpm离心数秒，经传递窗移至扩增检测区。
（用移液枪小心吸取上清液，尽量不要碰到底层沉淀。
）7.3 PCR扩增（扩增区）7.3.1 从传递窗中取出PCR反应管，放入仪器样品槽内。
7.3.2 在“Set up”按对应顺序设置空白管、阴性质控品、阳性室内质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品及待测标本，并在“sample name”一栏中设置样本名称，探针检测模式设置：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC，Quencher Dye2：none；Passive Reference：NONE。
具体设置方法参考《AB 7500核酸扩增仪标准作业指导书》。
7.3.3 打开“Run Method”窗口设置循环条件：50℃15 min，1个循环；95℃5min ，1个循环；94℃15s → 55℃45 s（收集荧光），45个循环；7.3.4 保存文件，运行仪器。
8. 结果分析8.1 反应结束后，操作人员可根据实际情况自行调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值。
Start值可以在3-15，End值可设在5-20。
在Log图谱窗口设置的Threshold的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线。
点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面查看结果，记录样本数值（C）。
8.2 如果反应体系扩增曲线在FAM检测通道无明显对数增长期，且在VIC检测通道有对数增长期，则判定样品的HCV RNA阴性。
8.3 如果反应体系扩增曲线在FAM、VIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道CT≤45；或者扩增曲线在FAM检测通道有对数增长期且CT≤45 ，在VIC检测通道无对数增长期，则判定样品的HCV RNA阳性性。
9. 质量控制每次实验均需检测阴性质控品、HCV 强阳性质控品、HCV临界阳性质控品。
质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判断。
9.1 试剂盒自带质控（1）阴性质控品：FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期，VIC检测通道扩增曲线有明显对数增长期。
（2）HCV 阳性质控品：FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期，且强阳性质控品FAM检测通道CT≤30，临界阳性质控品FAM检测通道≤36。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S型曲线，且0.97≤r≤1。
9.2 室内质控每次实验应选择适当的HCV RNA质控品做室内质控。
9.3以上要求（9.1和9.2）需在同一次实验中同时满足，否则，本次试验无效，需从新进行。
10. 干扰因素10.1环境中存在RNase，可降解RNA，导致实验结果假阴性，因此实验过程应戴手套，帽子，防止皮屑、毛发等的RNase，实验用品需高压灭菌后使用，尽量避免污染。
10.2临床标本中内源性抑制物：血红蛋白、免疫球蛋白、白细胞内乳铁蛋白、脂类、等都可抑制PCR反应，标本应避免溶血、脂血、黄疸等。
10.3 外源性抑制物：肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、手套上的滑石粉、标本容器上的抑制物等，标本应按采集要求采集，操作中应小心谨慎，标本容器及实验用具应鉴定合格。
10.4标本的交叉污染：操作过程中应细心认真，防止交叉污染，尽量使用带鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取，以及时发现交叉污染。
11. 生物参考区间：1.0×102 IU/ml~1.0×108 IU/ml12. 警示/危急值：HCV RNA检测无警示/危急值。
13. 异常结果处理如遇HCV RNA检测结果与临床诊断或资料，或与近期历史检测结果不相符合，应及时与临床医生联系、沟通，查找原因并采取措施，于《疑问报告发放处理记录表》中记录处理过程。
如需复查，需及时保存标本。
14. 临床意义HCV感染诊断的指标，指导临床治疗。
15. 变异的潜在来源标本保存不当或反复冻融，都会影响检测结果的准确。
16. 注意事项16.1 实验过程中必须穿专用工作服、戴手套、口罩、帽子、必要时戴防护眼罩，接触标本后必须及时更换手套。
16.2 阳性质控品和检测样本均应视为具有传染性物质，应避免接触到皮肤和粘膜。
16.3 实验过程必须严格分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用。
16.4 样品的处理操作应在生物安全柜内进行。
16.5所用检测试剂使用前应完全解冻，瞬时离心后使用，应避免反复冻融。
16.6 样本核酸提取后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于-20℃待用（24 h）。
16.7操作过程中应防止交叉污染，尽量使用鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取。
16.8 加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，尽快盖紧管盖。
上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。
16.9 标本制备区所用到的试管、吸头等需打入盛有消毒剂的容器，并与废物一起灭菌后方可丢弃。
16.10 扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。
16.11 实验中用过的吸头请直接打入盛有10%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。
16.12 每次实验均应有质量控制。
16.13 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精处理工作台和移液枪，然后用紫外线灯照射30 min。
17. 记录保存与丙型肝炎病毒核酸定量相关的使用维护保养要如实详细记录，并按要求定期归档保存。
18. 参考文献中山大学达安基因《丙型肝炎病毒核酸定量检测（PCR-荧光探针法）试剂盒说明书》19. 相关表格19.1SYHR-MP0304-15.01.V1 《基因检测流程记录表》。