高效液相色谱仪10114讲课稿

检
塞色谱柱筛板引起柱压升高。保护柱除了可以过滤颗粒物外， 测
因为带1厘米长的填料，强保留物质就先留在保护柱的柱芯填
器
料里面，这样可以避免色谱柱被强保留物质污染。
(4) 液相色谱检测器
分类
按检测原理： 光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射） 热学检测器(如吸附热） 电化学学检测器（如库伦、安培） 电学检测器（电导、介电常数）
反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的
键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被 冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
高压泵应具有以下性能
✓ 流量稳定，精度在1%左右 ✓ 输出压力高，通常20~30MPa，最高50 MPa ✓ 流量范围宽，一般在0.01~10mL/min范围内 ✓ 能抗溶剂腐蚀 ✓ 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 ✓ 操作方便、容易维修
✓ 根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵
（3） 色谱柱
色谱柱是高效液相色谱的心脏，在HPLC的使用中， 保持色谱柱的柱效，延长柱子的使用寿命非常重要。
色谱柱流速方向
色谱柱的参数
色谱柱（Column） 结构：柱管多用不锈钢制成，色谱柱两端的柱接头内装有 筛板，目的是防止填料漏出。 填料：多以硅胶为基质，适用PH 2～8 粒度多为0.2～20 μm(以5～10μm居多) 。
常用的压力范围：150～350×105 Pa 欧美等国家习惯使用psi作单位 PSI英文全称为Pounds per square inch。 定义为英镑/平方英寸， 它们之间的换算关系为： 1bar≈14.5psi =105Pa ， 145psi = 1Mpa 1psi = 6.895kPa=0.06895bar
高效液相色谱
2010/8/21
一、高效液相色谱仪
Agilent 1100
Waters 2487
二、高效液相色谱法的特点
借助气相色谱 的理论演变
经典的柱色谱
高效液相色谱的模块
20世纪70年代后发展迅速，它在技术上采用高压泵，高 效固定相和高灵敏度的检测器，实现了分析 速度快，分离效率高和操作自动化。
CH3 Si CH3
O Si O
O
Si O
O
O
Si O
O
O Si OO
O
Si O
O
O
Si O
O
O
O Si O
O
O Si O
O
Si O
O
OO O
Si O O Si
O
HO Si
OO
O
主要是由于修饰到硅胶上的硅烷化 试剂不同。 C8是修饰的带8个碳原子的硅烷， C18是修饰的带18个碳原子的硅烷。
C18较C8极性小，C18更适合分析中等到小极性的化合物， C8更适合中等偏大极性 化合物。
样品环(Loop)
规格：有10µL、20µL、50µL等不同容积， 可以根据需要 选配。 作用：用来贮液，也用来测量样品溶液的体积。 将样品环装满后进样，进样量即为样品环的容积，此种进 样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。 用定量环进样精密度好，在使用外标法时，应使用此种操 作方式。
自动进样器
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
规格：常规分析柱(常量柱) 内径2～5mm(常用4.6mm， 3.9mm)，柱长10～30cm (15cm，25cm居多）
制备柱 （21.2mm、30mm、50mm） 半制备柱（〉5mm，7.8mm、9.8mm、10mm）
C18柱（C8柱）
H3C
H3C
H3C
进样装置 （正面）
进样装置 （背面）
图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱， 样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品 注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时，进样阀的 流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。 六通进样阀具有使用方便，进样量准确等优点。
C18柱（C8柱）性能影响因素
物理性质
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率
•封端
正相柱和反相柱
正相柱：固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团，如胺基(NH2)和
氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。
预柱和保护柱
从泵来的流动相
预柱
进样口
保护柱
预柱是针对流动相来保护色谱柱
保护柱是针对样品来保护色谱柱
分 析
柱
precolumn——预柱，guard column——保护柱 安装位置不同：预柱是泵后进样口前，途经流动相；保护柱
是进样口后分析柱前，途经样品和流动相。
作用不同：预柱则只能起到过滤颗粒物作用，防止颗粒物堵
特点：高压、高效、高速
分离对象：适用高沸点、热不稳定有机及生化试样
分离分析 （与GC区分）
三、流程及主要部件
1. 流程
2. 主要部件
(1) 高压输液泵
单元泵
双元泵
高压泵作用：输送流动相。 也即是贮液瓶中的有机溶剂或缓冲溶液靠高压泵送入色 谱柱。由于色谱柱的阻力很大，高压泵必须克服阻力以 恒定流速输送流动相，这是保证色谱仪精确度的前提。
气动放大泵（恒压泵） 往复泵（恒流泵）是目前液相色谱使用最普遍的一种 高 压泵。其中又分单头往复泵和双头往复泵。 往复泵的优点是泵头内腔体积小，容易洗净，故更换 溶剂十分方便，尤其适合做色谱条件试验时使用。
气动放大泵
往复柱塞泵
(2) 进样装置
手动进样阀通常使用耐高压的六通阀 (美国Rheodyne 公司专利技术)， 其结构如图所示：
H3C
CH2
CH2
CH2
CH2
H2C
H2C
H2C
H2C
CH2
CH2
CH2
CH2
H2C
H2C
H2C
H2C
CH2 H2C
CH2 H2C
CH2
CH2
H2C
H2C
H3C HΒιβλιοθήκη CH2 Si CH3 H3C
H
CH3
Si
CH3H3C H
CH2 Si
CH3 HH3C
CH2
Si
CH3H3C H
CH2
Si CH3 H3C H