利用绿色荧光蛋白标记革兰氏阴性细菌
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳物创编
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI 和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
细菌原生质体衍生的纳米囊泡作为一种抗细菌感染的疫苗递送系统
细菌原生质体衍生的纳米囊泡作为一种抗细菌感染的疫苗递送系统摘要：广泛传播的感染性疾病能够通过研发有效的无佐剂的疫苗来有效控制，这导致了多种生物免疫刺激原件的使用作为候选疫苗。
最近，胞外囊泡像我们所知道的哺乳动物细胞的外体，微囊泡，还有格兰阴性菌的外膜囊泡，引起了作为下一代疫苗的广泛注意。
但是疫苗越有效越具有侵略性，就越容易增加严重的免疫毒副反应的风险。
现在为了优化现有的疫苗递送系统我们设计出一种细菌原生质体衍生物纳米囊泡（PDNVs）,清除其外膜的毒力部件，制作出一种普遍适用的无佐剂疫苗递送系统。
这种PDNVs展示出显著的高效产生率和安全性相比较于现有的疫苗递送工具，而且能诱导强烈的抗原特异性体液和细胞免疫应答。
而且PDNVs荷载了细菌抗原能够提供对细菌败血症小鼠的有效保护。
这种来源于细菌原生质体的非生物纳米囊泡开创了新一代，无佐剂，低毒性，用于防治传染性疾病疫苗的新道路。
关键词：原生质体，胞外囊泡，疫苗接种，外膜囊泡，胞外体囊泡随着感染性疾病发生率的上升，现有致病菌对常规治疗手段的耐受力的增加，开发一种有效安全的疫苗平台来克服感染性疾病带来的压力十分重要。
用脂质，多聚物，金和二氧化硅所制成的纳米载体的使用，是疫苗递送系统的新兴领域，因为他们能轻松的穿过血液和淋巴管，从而将疫苗有效的递送到目的部位。
但是还是面临许多问题需要解决，例如将预期的抗原载入递送载体中，佐剂的有效性，开发一种能够广泛使用的安全有效的疫苗。
最近，胞外囊泡，还有来源于哺乳动物细胞的外体和微囊泡，还有格兰阴性菌的外膜囊泡(OMVs)引起了广泛的关注。
胞外囊泡是球形双分子膜蛋白脂质直径在20-1000nm，所有活细胞都能产生。
这些囊泡具有潜力去发展新型诊断工具，靶向药物递送系统和疫苗，因为他们具有特异性的蛋白ＤＮＡ，ＲＮＡ和脂质集合，具有不同的生理病理功能。
胞外囊泡有高度的生物相容性纳米结构，展现出一个吸引人的疫苗递送系统，包含了免疫调整元件能够刺激抗原特异性免疫反应。
拟态弧菌的绿色荧光蛋白标记及其在感染草鱼体内的动态分布
拟态弧菌的绿色荧光蛋白标记及其在感染草鱼体内的动态分布高会会;侯立婷;李槿年;黄安宁【摘要】为了示踪研究拟态弧菌感染草鱼的动态过程,将增强型绿色荧光蛋白编码基因EGFP克隆至质粒pBAD24,并转化到拟态弧菌04-14菌株构建荧光标记重组菌.重组菌经阿拉伯糖诱导后,能高效表达EGFP蛋白;荧光显微镜观察和流式细胞仪检测均发现重组菌能够发出明显的绿色荧光信号,且传至30代后质粒稳定率仍为100％;生物学特性检测结果显示,与野生株相比,重组菌的形态、生长特性和细胞黏附性均未发生明显改变.用标记重组菌浸泡感染草鱼,定点采集鳃、肠道、肌肉、头肾、脾脏和肝脏,借助荧光信号检测4d内细菌在不同组织脏器中的动态分布.结果发现感染4h后即可在肠道和鳃中检测到绿色荧光信号,标记菌检出量分别为3.60×108和2.36×106 CFU/g,直至10 h,其含量无明显变化,12 h后含菌量逐渐下降,但持续存在直至鱼死亡.标记菌在肌肉、头肾、脾脏和肝脏中呈现相似的动力学,感染24 h后才检测到荧光信号,24～ 85 h时间段含菌量呈现先增加后下降的变化,48 h达到峰值,检出量分别为9.58×104(肌肉)、8.75×104(头肾)、1.50×104(脾脏)和4.50×104 CFU/g(肝脏),但均低于肠道中的检出量,结果表明肠道是拟态弧菌黏附定植与繁殖的主要靶器官.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2015(039)004【总页数】9页(P557-565)【关键词】草鱼;拟态弧菌;增强型绿色荧光蛋白;动态分布【作者】高会会;侯立婷;李槿年;黄安宁【作者单位】安徽农业大学动物科技学院,人兽共患病重点实验室,安徽合肥230036;安徽农业大学动物科技学院,人兽共患病重点实验室,安徽合肥230036;安徽农业大学动物科技学院,人兽共患病重点实验室,安徽合肥230036;安徽农业大学动物科技学院,人兽共患病重点实验室,安徽合肥230036【正文语种】中文【中图分类】S917.1自Thune 等[1]首次报道拟态弧菌(Vibrio mimicus)造成养殖克氏原螯虾(Procambarus clarkii)大量死亡以来,国内外学者对其致病性进行了广泛研究,明确该菌是人和水生动物共患病原菌,不仅可以引起多种水产养殖动物的腹水病暴发流行,给水产养殖业带来经济损失,而且可通过水产品导致人类食物中毒[2-4]。
大肠杆菌荧光染色方法
大肠杆菌荧光染色方法1.引言1.1 概述大肠杆菌荧光染色方法是一种常用的实验技术，用于检测和观察大肠杆菌的存在和分布情况。
大肠杆菌作为一种常见的肠道细菌，对于人类和动物的健康具有重要的影响。
因此，快速、准确地检测大肠杆菌的存在是非常重要的。
荧光染色技术是一种基于分子生物学原理的方法，通过将荧光染料与目标菌株的特定成分或结构相互作用来实现细胞的染色。
相比传统的染色方法，荧光染色具有显著的优势，如高灵敏度、高特异性和直观的成像效果。
因此，荧光染色方法在大肠杆菌的检测中得到了广泛的应用。
本文的主要目的是介绍大肠杆菌荧光染色方法的原理、优点和应用前景。
首先，我们将详细阐述大肠杆菌的重要性，包括其在人类肠道和环境中的分布情况以及与人类健康相关的疾病。
接下来，我们将重点介绍荧光染色方法的原理，包括选择合适的荧光染料和适当的染色条件，以达到对大肠杆菌的准确和可靠的染色结果。
在结论部分，我们将总结荧光染色方法的优点，如高灵敏度可以提高大肠杆菌的检测效率，高特异性可避免误判，直观的成像效果方便观察和分析。
此外，我们还将展望这种方法在临床诊断、食品安全监测、环境卫生等领域的应用前景，希望能为相关研究提供参考和借鉴。
总之，本文将全面介绍大肠杆菌荧光染色方法，旨在推广和应用这一技术，在大肠杆菌相关领域的检测和研究中发挥重要作用，为保障人类健康和环境安全做出贡献。
1.2文章结构文章结构：本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分包括概述、文章结构和目的三个小节。
在概述部分，我们将介绍大肠杆菌荧光染色方法的背景和意义。
随后，在文章结构部分，我们将详细介绍本文的组织结构和各节的内容。
最后，在目的部分，我们将阐述本文的主要目的和意义。
正文部分主要分为两个小节，分别是大肠杆菌的重要性和荧光染色的原理。
在大肠杆菌的重要性部分，我们将介绍大肠杆菌在生物学研究中的重要地位和广泛应用领域。
随后，在荧光染色的原理部分，我们将详细讲解大肠杆菌荧光染色方法的原理、步骤和关键技术。
小动物活体成像的原理及区别
小动物活体成像的原理及特点小动物活体成像主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。
生物发光是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。
利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。
通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。
传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。
相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。
另外, 这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质和方法, 非常安全。
因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。
一、技术原理1. 标记原理哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素（luciferin），即可在几分钟内产生发光现象。
这种酶在ATP 及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。
对于细菌，lux操纵子由编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光，不需要外源性底物。
基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。
标记细胞的方法基本上是通过分子生物学克隆技术, 将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选, 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。
目前, 常用的细胞株基本上都已标记好, 市场上已有销售。
绿色荧光蛋白分子标记在环境微生物学研究中...
第一作者:叶海仁,男,1979年出生,在读硕士研究生,主要从事基因工程及应用微生物研究。
3国家自然科学基金项目(20276070)及国家863计划项目(2002AA 649310)绿色荧光蛋白分子标记在环境微生物学研究中的应用3叶海仁 钟卫鸿 陈建孟(浙江工业大学生物与环境学院, 杭州310032)摘要 绿色荧光蛋白(green fluo rescent p ro tein ,GFP )分子标记是现有遗传标记中最简单方便的一种方法,GFP 及GFP 突变体在微生物降解污染物、生物膜菌群构架、环境生态学和环境检测生物传感器等研究领域取得了很好的应用效果。
关键词 绿色荧光蛋白 环境微生物 分子标记Application of green f luorescen t prote i n marker i n the research on env ironm en t al m icrobiology Y e H airen ,Z hong W eihong ,Chen J ianm eng .Colleg e of B iolog ical &E nv ironm ental E ng ineering ,Z hej iang U niversity of T echnology ,H ang z hou 310032Abstract :T he characteristics of GFP and its app licati ons as a mo lecular m arker in environm ental m icrobi o logy research w ere discussed .T he GFP m ay be the mo st si m p le and convenient mo lecular m arker in environm ental m i 2croo rganis m s .It w as found that the GFP m arkers p lay a key effect on the research of m icrobe structure in bi ofil m ,m icrobes bi odegrati on ,p lant 2m icrobe interacti ons ,bacterial 2p ro tozoan interacti ons and bi o senso rs .Keywords :Green fluo rescent p ro tein Environm ental m icroo rganis m s M o lecular m arker 基因工程微生物(genetically engineered m icroo rgan 2is m s ,GE M S )越来越多地被用于农业害虫控制和污染环境的生物修复,其进入开放的环境后对人类健康和环境的影响引起了人们的广泛关注。
绿色荧光蛋白穿梭载体的构建及其在嗜酸乳杆菌中的应用
绿色荧光蛋白穿梭载体的构建及其在嗜酸乳杆菌中的应用曾娟娟;王磊;赵迪;吕阳;王蕾;易丹;陈洪波;丁斌鹰;侯永清【摘要】为深入研究嗜酸乳杆菌的作用机理,以温敏型穿梭载体pSET4s为基本骨架,将绿色荧光蛋白(GFP)和嗜酸乳杆菌上、下游同源臂插入该载体,构建GFP标记的穿梭表达载体pSET4s-P1-GFP-P2.利用电转化方法将穿梭表达载体pSET4s-P1 GFP-P2转化入嗜酸乳杆菌,通过抗性和温度双重筛选获得能稳定表达GFP的重组嗜酸乳杆菌,将Western blotting和荧光显微镜观察验证的重组菌命名为△MG6243 (GFP).利用荧光显微镜观察和平板计数的方法对重组菌进行遗传稳定性和生物学特性研究.结果显示,重组菌在蓝光激发下可见明显绿色荧光,连传10代仍可见明显荧光,与野生菌相比,其生长特性、酸碱盐耐受性均无显著差别.结果表明,本试验已成功构建稳定表达GFP基因的重组嗜酸乳杆菌,利用温敏型穿梭载体pSET4s实现了外源基因在嗜酸乳杆菌中非抗性、整合型表达,为嗜酸乳杆菌基因重组菌的构建奠定了基础,同时GFP的标记作用也为嗜酸乳杆菌在动物体内分布、定植规律和作用机理创造了可行的条件.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)010【总页数】9页(P2551-2559)【关键词】嗜酸乳杆菌;同源重组;绿色荧光蛋白【作者】曾娟娟;王磊;赵迪;吕阳;王蕾;易丹;陈洪波;丁斌鹰;侯永清【作者单位】武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室,武汉430023;武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室,武汉430023;武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室,武汉430023;武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室,武汉430023;武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室,武汉430023;武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室,武汉430023;武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室,武汉430023;武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室,武汉430023;武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室,武汉430023【正文语种】中文【中图分类】Q78pSET4s是猪链球菌的自杀性质粒，是温敏型的自杀质粒，含有LacZ’基因和11个酶切位点。
GFP标记的短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)转座突变株的构建初探
GFP标记的短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)转座突变株的构建初探沈新迁;胡晓璐;刘通;孙文良;陈云鹏【摘要】Bacillus pumilus is one of the most important biocontrol bacteria for plant. In this study, a pMOD-egfp-Tet transposition complexes was prepared using Tn5 transposase,and then subjected to the construction of Tn5 transposon insertion mutagenesis for B. Pumilus DX01 by electrotransformation. Over one thousand of GFP-taggeci transformants were obtained. The analyses of genetic stability test and molecular identification showed that exogenous DNA was successfully integrated into the genome of B. Pumilus and strong green fluorescence was observed in transformed cells, which indicated that gfp gene was expressed constitutively in mutants.%以水稻叶面附生菌短小芽孢杆菌(B.pumilus)为研究对象,通过构建pMOD-egfp-Tetr转座复合体,采用电击转化法对短小芽孢杆菌DX01菌株进行了Tn5转座插入诱变,获得了大量的转化子.对转化子进行了遗传稳定性分析和分子鉴定,并且在荧光显微镜下观察到了强烈的绿色荧光,研究结果表明外源DNA已经成功整合进细菌的基因组中,gfp基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达.【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》【年(卷),期】2012(030)004【总页数】6页(P15-20)【关键词】短小芽胞杆菌;Tn5转座;电击转化;绿色荧光蛋白【作者】沈新迁;胡晓璐;刘通;孙文良;陈云鹏【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海 200240;上海交通大学农业与生物学院,上海 200240;上海交通大学农业与生物学院,上海 200240;上海交通大学农业与生物学院,上海 200240;中国科学院天津工业生物技术研究所,天津 300308;上海交通大学农业与生物学院,上海 200240【正文语种】中文【中图分类】Q754短小芽孢杆菌（B.pumilus）是一种重要的植物生防菌，其能够大量分泌肽类抗生素、抗菌蛋白等拮抗性物质［1］，因而对草莓灰霉病（Botrytis cinerea Pers）［2］、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）［3，4］等多种植物病原菌具有广谱抗性。