单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基和试剂(一)
MMFSCNJ出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法
MM_FS_CNJ_0344出口食品单核细胞增生李斯特氏菌斜射光镜MM_FS_CNJ_0344出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法1.适用范围本方法适用于牛乳、乳制品、水产品、肉及肉制品食品。
其他食品可参照采用。
2.原理概要单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患疾病的致病菌。
在胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA－YE）、选择性培养基（MMA）等平板上用45°角斜射光照射可观察到蓝色菌落；水解七叶苷并与柠檬酸铁铵反应产生黑色菌落。
3.主要试剂和仪器.主要试剂（包括培养基）胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB－YE）（见B1）；胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA－YE）（见B2）；增菌培养液（EB）（见B3）；选择性培养基（MMA）（见B4）；牛津琼脂（见B5）；改良缓冲蛋白胨水（MBP）（见B6）；7％羊血琼脂（见B7）；糖发酵培养基（见B8）；半固体琼脂；尿素琼脂；硝酸盐培养基；MR－VP培养基；三糖铁琼脂（TSI）。
胰酪蛋白胨（或胰蛋白胨）；盐酸吖啶黄素；萘啶酮酸；复达新；甘氨酸酐；氯化锂；苯乙醇；放线菌酮；多粘菌素E；头孢双硫唑甲氧；磷霉素；柠檬酸铁铵；七叶苷；酚红；D－葡萄糖；D－甘露醇；哥伦比亚琼脂；酵母浸膏；牛肉浸膏。
.仪器微生物学实验室常用设备；解剖镜；斜射灯；平面镜。
4.过程简述.样品如为冷冻食品，应于2～5℃解冻，且不超过18h，若不能及时检验，应置于－15℃保存。
非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，在24h之内检验。
.前增菌和增菌前增菌：巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品，冻肉及其它加工食品均应进行前增菌。
无菌操作称取25g样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水（MBP）的均质杯内，高速均质1～2min，制成1∶10样品匀液，转入500mL广口瓶内；液体食品可用吸管吸取25mL样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水（MBP）的广口内，充分振摇制成1∶10样品匀液，于30℃培养24、48h。
乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验
乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验YLNB 4.6 1. 仪器及器材1.1 恒温培养箱：30±1℃、24±1℃1.2 恒温水浴锅：46±1℃。
1.3 显微镜：10×～100×1.4 离心机：4000 r/min1.5 均质器或灭菌乳钵。
1.6 灭菌平皿：直径90mm。
1.7 灭菌试管： 16mm×160mm1.8 灭菌吸管：1mL（具有0.01mL刻度）、10mL（具有0.1mL 刻度）。
1.9 冰箱：0－4℃1.10 锥形瓶：100mL、500mL。
1.11 架盘药物天平：0g～500g,精确至0.5g。
1.12 离心管：30mm×300mm。
1.13 灭菌注射器：11.14 单核细胞增生李斯特氏菌标准株。
1.15 马红球菌。
1.16 小白鼠：16g～18g。
2. 培养基和试剂2.1含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤(TSB－YE)：见附录A1。
2.2含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂(TSA－YE)：见附录A2。
2.3 EB增菌液：见附录A3。
2.4 LB增菌液(LB1，LB2)：见附录A4。
2.5 三糖铁(TSI)琼脂：GB/T4789.28中4.26，4.27。
2.6 SIM动力培养基：见附录A5。
2.7 血琼脂：GB/T4789.28中4.6。
2.8 改良的Mc Bride(MMA)琼脂：见附录A5。
2.9 硝酸盐培养基：GB/T 4789.28中3.17。
2.10 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)：GB/T4789.28中3.4。
2.11 糖发酵培养基：GB/T4789.28中3.2。
2.12 过氧化氢酶试验：GB/T4789.28中4.38。
2.13 盐酸吖啶黄(AcriflavineHCl)(Sigma)。
2.14 萘啶酮酸钠盐(Naladixicacid)(Sigma)。
3. 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下：检样25g(ml)EB增菌液225ml LB1增菌液225ml30℃,48h 30℃,24h30℃,24h30℃,24～48h25℃ 2d ～5d(伞状)30℃,24h30℃,24hLB2增菌液225ml选择性培养基(MMA)SIM 动力培养基 TSI 琼脂TSA-YE 培养基显微镜下观察运动硝酸盐还原实验 过氧化氢酶实验 甘露醇 木醇 鼠李糖 七叶苷 溶血实验协同溶血实验 小鼠致病力实验 革兰氏染色 MR-VP 实验4. 方法4.1 样品的收集及处理无菌取样品25g(mL)放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定引言单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，可引起严重的食物中毒和感染疾病。
为了及时诊断和控制该菌的传播，对其进行准确的生化鉴定非常重要。
本文将介绍单核细胞增生李斯特氏菌的生化鉴定方法及相关实验步骤。
实验材料与方法实验材料•单核细胞增生李斯特氏菌培养基•Listeria Enrichment Broth（LEB）•Listeria Agar Base（LAB）•乳清素蛋白水解物培养基（Trypticase Soy Broth，TSB）•乳清素蛋白水解物琼脂培养基（Trypticase Soy Agar，TSA）•碱性亮绿液实验方法1.取一份食物样品，如肉类、奶制品等，加入适量LEB中，并在37℃孵育24小时。
2.取0.1ml培养液，在TSB中进行预培养，37℃孵育24小时。
3.从TSB中取出适量菌液，用胶体金法进行菌落计数，并将菌液稀释至10-4倍。
4.取适量的稀释液分别接种于LAB和TSA琼脂培养基上，并在37℃孵育24小时。
5.观察菌落形态、颜色等特征，并记录下来。
生化鉴定实验单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定步骤如下：1.琼脂凝胶双扩散试验：将单核细胞增生李斯特氏菌抗原与相应的抗血清共同扩散于琼脂凝胶板上，观察是否发生免疫反应。
若有明显的线条或沉淀形成，则说明存在抗原-抗体反应，可以初步判断为单核细胞增生李斯特氏菌。
2.碱性亮绿液试验：将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌与碱性亮绿液接触，观察是否产生绿色荧光。
若产生绿色荧光，则说明菌株具有单核细胞增生李斯特氏菌的特性。
3.单核细胞增生李斯特氏菌脂多糖（LPS）鉴定：采用酚-硫酸法或酚-硝基苯法，将培养基中的单核细胞增生李斯特氏菌进行LPS提取，然后进行比色反应。
若出现红色或紫色沉淀，则说明存在LPS，可以进一步确认为单核细胞增生李斯特氏菌。
结果与讨论通过上述实验方法，我们可以对食物样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行生化鉴定。
(十)-单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序
DBS22 DBS22/019—2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1。
1—2000《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》的要求编写.本标准分为两种检测方法：第一法:单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。
其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。
本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心.本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的定量检验方法.本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2。
1 冰箱：2℃～5℃和—18℃.2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃.2.3 均质器。
2.4 显微镜:10×～100×.2。
5 电子天平:感量0。
1 g。
2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。
2。
7 无菌吸管:1 mL（具0。
01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.8 无菌平皿:直径90 mm。
2。
9 无菌试管：16 mm×160 mm.。
2。
10 离心管:30 mm×100 mm.2。
11 无菌注射器:1 mL。
2。
12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。
2。
14 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3。
1 含0。
6％酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE)：见附录A中A。
1.3。
2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。
食品单核细胞增生李斯特氏菌检验原始记录
食品单核细胞增生李斯特氏菌检验原始记录
样品编号：检验开始时间：年月日
样品名称：检验完成时间：年月日
检测项目：单核细胞增生李斯特氏菌检测依据：GB 4789.30-2016(第一法)
单核细胞增生李斯特氏菌定性检验
无菌操作称（量）取样品25g或ml加入225mlLB1均质杯中，均质1~2min，30±1℃培养24±2h；取0.1 ml转种于10mlLB2 增菌液内，于30±1℃培养24±2h；取LB2 增菌液划线于PALCAM琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基，于36±1℃培养24~48h，观察菌落形态。
挑取可疑菌落进行血清学试验和生化试验。
注：+生长或有可疑菌落；-未生长或无可疑菌落。
电子天平编号：使用状况试验前：试验后：
培养箱编号：使用状况试验前：试验后：
检测人：校核人：审核人：。
单核细胞增生李斯特菌
单核细胞增生李斯特菌形态特征：①革兰氏阳性的类球形杆菌②大小约为0.4~0.5 v m x 0.5 〜2.0③两端钝圆④在有些培养基中稍弯，单个、成V形或成对平行排列⑤在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性⑥兼性厌氧，无芽抱，一般不产生荚膜⑦在20~25 C时以4根周毛运动，在37 C时只有较少的鞭毛或1根鞭毛培养特性：①需氧和兼性厌氧②生长范围为2-42 C③最适温度为35-37 C④pH中性至弱碱性（pH9.6 ）⑤在6.5% NaCl肉汤中生长良好。
⑥在20-25 C培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。
⑦在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。
⑧在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的（3-溶血环。
⑨在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂（TSAYE）和改良Mc Bride（MMA）琼脂上，用45角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
生化特性：（甘露醇、木糖为阴性，其他为阳）1. 该菌触酶阳性，氧化酶阴性。
2. 发酵多种糖类，产酸不产气。
发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶昔、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。
不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。
3. 不利用枸椽酸盐，40%胆汁不溶解。
4』引噪、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。
5.MR-VP试验和精氨酸水解阳性。
生化试验：①动力试验+原理：有动力的细菌扩散生长，培养基浑浊，无动力的细菌培养基澄清。
（结果：有动力，呈伞状生长，底为弯月牙形）②过氧化氢酶试验（触酶试验）+原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
（结果：汽包产生为+）应用：葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。
单增李斯特氏菌检测详解优品文档
李斯特氏菌斜面和底层产酸，不产硫化氢。 monocytogenes
Listeria monocytogenes monocytogenes 每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株进行质量控制。 VIDAS快速筛选（可选） 穿刺SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）培养48h。 225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二次增菌25h±1h。 菌落形态：24h后菌落呈现黑色，直径为1mm，在其周围形成一个黑色环。 （设标准菌株对照）
225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取 1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二 次增菌25h±1h。
VIDAS快速筛选（可选）
FB2增菌液进行VIDAS快速筛选。 筛选为阴性的结果可直接报告未检出。 筛选为阳性的结果继续分离培养和鉴定。
分离培养
取增菌液一环，划线分离于选择性培养基 OXA、PALCAM上，35℃±1℃培养24h～48h。
鉴定
溶血试验 VIDAS快速筛选（可选）
协同溶血试验（cAMP）
刺种7％羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核 225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二次增菌25h±1h。
可代替硝酸盐还原、MR-VP、三糖铁、糖发酵、尿素酶和CAMP等试验。
英诺克李斯特氏菌 L. innocua
威尔斯李斯特氏菌 L. welshimeri
西尔李斯特氏菌 L. seeligeri
格氏李斯特氏菌 L. grayi
蓝 典 过 革 溶 动 尿 硝 MR
色型氧兰血力素酸∣
单核细胞增生李斯特氏菌及检验
单核细胞增生李斯特氏菌及检验单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的平安具有危急，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威逼人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必需加以重视。
一、生物学特性1、形态与染色该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在养分丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培育中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。
2、培育特性该菌养分要求不高，在20--25℃培育有动力，穿刺培育25天可见倒立伞状生长，肉汤培育物在显微镜下可见翻跟斗运动。
该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培育温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.84.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。
在固体培育基上，菌落初始很小，透亮，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透亮。
在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培育后可产生窄小的β-溶血环。
在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用450角入射光照耀菌落，通过解剖镜垂直观看，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
3、生化反应该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。
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单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基和试剂
(一)
单核细胞增生李斯特氏菌（LM）是一种由李斯特氏菌属（Listeria）
引起的感染性疾病，该疾病主要感染免疫功能低下人群，通常会导致
败血症和脑膜炎等严重并发症，严重威胁人类健康。
因此，开发出一
种快速、敏感、高效的LM检验培养基和试剂至关重要，这可以加速LM 的检测和诊断，有效地减少疾病的传播。
一. 检验培养基
1. 构成成分：单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基是由肉汤、肉汤胰
蛋白胨、乳糖、黄曲霉素、普鲁兰甲酸和酵母提取物等组成的。
2. 作用：肉汤是一种富含氮源和其他必需营养成分的培养基，在培养
微生物中发挥着重要的作用。
肉汤胰蛋白胨是一种蛋白质水解物，可
为细菌提供营养和生长因子，促进其繁殖。
乳糖则是一种碳源，能够
促进细胞的代谢和繁殖。
黄曲霉素作为一种广谱抗生素，可以有效地
抑制杂菌的生长。
普鲁兰甲酸和酵母提取物则可以用来增加LM在培养
基上的特异性和灵敏度。
3. 优点：单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基在培养LM时具有快速、敏感、特异性好等优点，可以大大缩短LM的检测时间，确保病菌的检
测率。
二. 检验试剂
1. 依赖性及非依赖性试剂：检验试剂可分为依赖和非依赖试剂。
依赖
试剂需要依赖细菌代谢产物或生长结果的变化来作出结果，如葡萄糖酶试剂。
而非依赖试剂则不需要依赖于细菌代谢的结果，如反应纸片试剂。
2. LM检测常用试剂：LM检测常用试剂包括气体生成剂试剂和反应纸片试剂。
前者是一种单元试剂，含有半胱氨酸脱氨酶和甲酸氢化酶等催化剂，当培养基内细菌产生气体时，该试剂会发生颜色变化，表示LM检测阳性。
而反应纸片试剂则能够迅速地检测LM生长的结果，并呈现出明显的颜色变化。
这种试剂具有使用方便、结果稳定等优点。
3. 优点：LM检验试剂具有便于使用、结果稳定和灵敏度高等特点，可以有效地加速LM的检测和诊断，从而避免其传播和蔓延。
结论：
单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基和试剂是一对极为重要的检测手段，在LM的检测过程中发挥着至关重要的作用。
它们的快速、敏感、高效能够帮助医学工作者准确、迅速地判断出LM的存在，掌控便于控制LM在流行病学上的传播和感染的趋势。
因此，它们是保障人类健康和安全的必要手段，也为LM的预防和控制提供了重要的保障和基础。