大鼠原代心肌细胞培养实验

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实验内容：C57小鼠心肌细胞培养

参加人员：王朗郭源源

一、培养前准备：

1 器械：

取心脏：wpi剪2把、显微镊弯2把、眼科镊1把

取心脏后：显微剪1把、持针器2把、吉利刀片2片、眼科镊2把、

400目细胞滤网

2 器皿：

外：烧杯1个100ml

内：盛酒精小烧杯、棉签2包，鼠板盛小鼠尸体，玻璃皿100mm 2，

碎冰盆底加两个冰袋，离心管架1，6孔板，EP管，15ml离心管，50ml

离心管

3 试剂及配制

1.培养基：DMEM/F12，添加15%FBS

2.提前融化：BrdU溴脱氧尿苷100X储备液(10 mM)，小牛血清、II型

胶原酶（10mg/ml储备液）、0.25%胰酶提前融化

3.D-Hanks液：

4.酶消化液：酶终浓度：2型胶原酶0.5mg/ml，胰酶0.15mg/ml

40ml：胰酶1.2ml，胶原酶2ml，D-HANKS 36.8ml

二方法

1 心脏取出

1. 加10ml和6ml未加血清的DMEM/F12到2个100mm皿中，平皿

放入冰盆预冷。

2. 将20只小鼠婴放入100mm玻璃平皿，镊取小鼠放入75%酒精中浸

泡数秒，对其颈部以下消毒，抓取小鼠，固定住上肢与下肢，从颈部

剪下头部，剪刀由颈部伸入胸腔沿胸骨左侧剪开，轻轻挤压胸廓，让

心脏跳出，迅速用镊子取下心脏，放入盛有10ml DMEM/F12的玻璃

平皿中。

3. 轻柔清洗心脏的血液后转入另一个盛有10ml DMEM/F12液的

10cm培养皿中，用显微剪将心脏剪成1-2mm的碎片。

4. 以上过程应在冰上30min之内完成。

2 消化细胞

1. 将剪碎的组织转入15ml离心管，吸去DMEM/F12，加入酶消化液

4ml。

2. 37度水浴中轻摇，消化10min，静止数秒钟，吸取上清液，弃去。

此时消化下的细胞为不需要的红细胞、细胞碎片以及心内膜和心外膜

细胞。

3. 37度水浴中轻摇，消化4-5min。静止数秒钟，吸取上清液，放入预先放好7ml（体积为上清液体积的2-3倍）含20%小牛血清的DMEM/F12培养基的15ml离心管中终止消化，并置于冰上。

4. 重复3步骤，循环5-6次。取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。

5. 将收集好心肌细胞悬液3管，以1000rpm转速离心5min，小心倒掉上清液，在一管中加入3ml培养基，轻柔吹打重悬细胞，再转到另一管，将各管细胞集中至1个15ml离心管中，轻柔混匀。

3 差时贴壁：

1.将细胞悬液经细胞40um过滤网过滤，以滤去细胞团块，用2ml培养基冲洗滤膜。

2.将细胞接种在10mm的培养皿中进行差时贴壁70min。

3. 用0.1%明胶包被六孔板的5个孔

4. 培养皿中加入1ml培养基，清洗培养皿将沉于皿底但未贴壁的心肌细胞重悬，并转入到上述15ml离心管中。

5. 在原皿中加入含10%FBS的DMEM/F12培养基3ml 继续培养心脏成纤维细胞。

6. 在心肌细胞悬液共5ml加入Brdu 50ul终浓度（0.1mM）轻柔混匀之后，以每孔3ml加入到包被好的孔中。

7. 每个皿均按照南北方向、东西方向轻摇以分散细胞，勿漩涡摇晃。

5. 37度5%二氧化碳,静置培养48-72小时后用培养基洗涤1次，更换培养基，并加Brdu。