食品微生物检验技术W4304沙门氏菌检验-检验操作程序及要点-传统鉴定-4-微教材

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知识讲解

沙门氏菌操作程序及要点——传统鉴定

沙门氏菌操作程序及要点分为检验程序和操作步骤

一、检验程序

根据国标，沙门氏菌的检验程序为: 检样经无菌处理后，称取25 g(mL)样品加入到225 mL BPW中36±1℃培养8~18h；取培养物1mL 接种到10mL的TTB中同时取1mL 接种到10mL 的SC中，分别于42±1℃和36±1℃培养18~24h；取培养后的增菌液分别划线接种于BS琼脂平板和XLD琼脂平板（或HE琼脂平板、显色培养基平板）中，于36±1℃培养18~24h，BS 需延长至40~48h；培养后挑取可疑菌落做生化试验。

挑取2 个以上典型或可疑菌落——接种三糖铁琼脂，赖氨酸脱羧酶试验管和对照管、供做靛基质试验的色氨酸肉汤、尿素（pH7.2)，KCN试验管和对照管，同时划线营养琼脂平板——

如5项生化都符合——则直接判定为沙门氏菌——如五项中靛基质阳性——则补做甘露醇和山梨醇试验，如果两项均为阳性——为可疑沙门氏菌，但需结合血清学鉴定结果进行判定——如五项中H2S阴性——则需补做ONPG试验，ONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性——为沙门氏菌——也可在三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验初步判断结果后，使用商品化的生化鉴定系统进行生化鉴定——判定是否为沙门氏菌——如果5项反应中有2项以上不符合——则沙门氏菌阴性——最后报告结果

二、操作步骤

主要分为：1、样品处理与前增菌；2、增菌；3、分离；4、传统生化鉴定试验；5、系统生化鉴定试验；6、血清学鉴定。其中传统生化鉴定试验又分为三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验，靛基质、尿素和氰化钾试验、甘露醇、山梨醇以及ONPG试验三个部分。

本片以鸡肉为样品，演示沙门氏菌检验的样品处理和前增菌的操作过程。

1、前增菌：

在无菌室内，以75%酒精擦拭样品外包装，尤其是包装的开口处，用无菌剪刀在样品封口处剪开包装袋，换用一个无菌剪刀将鸡肉样品剪碎至无菌罐内，用无菌镊子称取25 g样品至盛有225 mL BPW的样品瓶中，再转入注明样品信息、检测人员以及检测日期的均质袋中，密封，用拍击式均质器拍击2 min。注意：若样品为液态，不需均质，振荡混匀即可；如需测定pH 值，用1 mol/mL的无菌NaOH 或HCl（调pH至6.8±0.2；均质完成的检测样品通过传递窗出无菌室，清理无菌室，打开紫外灯，辐照灭菌30 min。

将上述均质完成的检测样品放于预先设置36 ℃±1 ℃的恒温恒湿培养箱中培养8 h～18 h。

2、增菌：

将前增菌培养物通过传递窗入BSL-2实验室，在生物安全柜内轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于10 mL TTB增菌液内，同时，另取 1 mL，转种于10 mL SC增菌液内。选择性增菌的目的是最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种选择性增菌液，一种是抑制除沙门氏菌以外其肠道菌的生长，一种是在不影响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌的生长。注意区分两种增菌培养温度不同。SC增菌液经过培养后，肉汤没有变红，仍然需要转接分离平板；接种完成的物品通过传递窗出BSL-2实验室，清理BSL-2实验室与生物安全柜，分别打开紫外灯，辐照灭菌60 min。

将接种后的TTB增菌液和SC增菌液分别置于42 ℃和36 ℃培养18 h～24 h。

注意：下述步骤均在BSL-2实验室里的生物安全柜内进行，相应的准备和工作要求同前所示。

3、平板分离

分别用接种环取培养后的TTB增菌液和SC增菌液各1 环，分别划线接种于一个BS 琼脂平板、XLD 琼脂平板、HE 琼脂平板和沙门氏菌属显色培养基平板。置于36 ℃培养箱中培养，除BS 琼脂平板需培养40 h～48 h外，另三种分离平板培养时间均为18 h～24 h。

沙门氏菌检测用到的分离平板主要有BS 琼脂平板、XLD 琼脂平板、HE 琼脂平板和沙门氏菌属显色培养基平板，为了最大可能的检出沙门氏菌，必须使用两种或以上选择性分离培养基。本片将分别演示这四种平板的分离现象。由于沙门氏菌属种类比较多，所以不同菌在平板上的现象不同，本实验中各分离平板上的菌落特征如下：BS 琼脂平板上菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基呈黑色或棕色；

XLD 琼脂平板上菌落呈粉红色，不带黑色中心；

HE 琼脂平板上菌落为蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；

沙门氏菌属显色培养基平板上菌落特征需按照显色培养基的说明进行判定。本实验采用法国科玛嘉显色培养基，沙门氏菌在该培养基上菌落为紫色。

沙门氏菌种类复杂，在分离培养基上的菌落形态不唯一，凡是符合标准中描述的典型菌落及可疑菌落均需进行后期生化鉴定。

甲型副伤寒、伤寒等不产或弱产H2S的沙门氏菌在传统培养基上易漏检；奇异变形杆菌等产H2S的非沙门氏菌在传统培养基上假阳性率很高，会增加后期生化鉴定的工作量。在显色培养基上沙门氏菌和伤寒沙门氏菌均为紫色，大肠杆菌为蓝色，变形杆菌为无色，很容易辨认。因此，有条件的话建议使用显色培养基。若平板上无菌落生长，则可判定为阴性。

实际工作中如需开展染色镜检，可挑取分离平板上的典型菌落，涂片，进行革兰氏染色。沙门氏菌为革兰氏阴性，两端钝圆的短杆菌，无芽孢。

4、生化鉴定

生化鉴定这里指的是传统生化鉴定。

沙门氏菌检验传统生化鉴定所用的试剂有：三糖铁琼脂斜面、赖氨酸脱羧酶试剂及对照、靛基质试剂及其添加剂、尿素酶试剂和氰化钾试剂及对照；有时还需要用到甘露醇、山梨醇和ONPG试剂。

1）三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验：

从选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种营养琼脂平板和赖氨酸脱羧酶试验管及其对照管，接种后，需在赖氨酸脱羧酶试验管及其对照管中滴加矿物油，形成厌氧环境，一株待检菌需同时接种赖氨酸脱羧酶试验管和氨基酸脱羧酶对照管各一支，且两管均需滴加矿物油或液体石蜡覆盖液面。

将以上接种物于36 ℃培养18 h～24 h，必要时可延长至48 h。

本实验在三糖铁琼脂上的反应结果为：三糖铁斜面产碱，颜色加深，底层产酸变为黄色，产硫化氢，产气。三糖铁培养基含有葡萄糖、蔗糖和乳糖等三种可发酵的碳源，这些碳源被菌体利用产酸，可使酚红指示剂变色。某些菌能还原Na2S2O3产生H2S，与硫酸亚铁铵反应生成黑色的FeS，而使培养基变黑。

本实验赖氨酸脱羧酶的反应结果为：赖氨酸脱羧酶对照管黄色、试验管紫色，反应为阳性。

结合三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验的结果，可筛掉大部分非沙门氏菌。

本次实验中根据以上反应结果初步判断为可疑沙门氏菌。需进一步做生化鉴定。

2）靛基质、尿素和氰化钾试验：

从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种至供做靛基质实验的色氨酸肉汤、尿素酶、氰化钾试验管及其对照管。靛基质、尿素和氰化钾实验挑取的菌落应为上一步做三糖铁和赖氨酸脱羧酶实验时纯化的营养琼脂平板上的菌落，也可在接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试剂的同时，直接接种。接种后置于36 ℃培养18 h～24 h，必要时可延长至48 h。注意：一株待检菌需同时接种氰化钾试验管和氰化钾对照管各一支。两管均需滴加矿物油或无菌液体石蜡覆盖液面，因为氰化钾易分解，产生氢氰酸易挥发，影响试剂浓度。氰化钾剧毒，实验时应做好个人防护，避免接触、入口或吸入。按照产品说明书，观察结果时，需在色氨酸肉汤实验管中滴加1滴靛基质试剂。

本实验靛基质反应不变色为阴性、尿素酶变黄为阴性、氰化钾对照管生长，试验管不生长，为阴性。对照标准中的表3，符合标准中的反应序号A1，为典型反应，判定为沙门氏菌属。

为防止漏检应从选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落进行以上生化实验，并将已挑菌落的平板和纯化的营养琼脂平板储存于 2 ℃～5 ℃或室温至少保留24 h，以备必要时复查。

本实验反应序号A1后三项全符合，直接判定沙门氏菌阳性；如果后三项有两项以上不符合，则沙门氏菌阴性；如果后三项有1项不符合，补做血清学试验按表4判定是否为沙门氏菌。即当赖氨酸脱羧酶阴性时，可能为甲型副伤寒沙门氏菌，需结合血清学鉴定结果进行判定；当氰化钾阳性时，可能为沙门氏菌IV型或V型，需结合沙门氏菌属生化群鉴定结果进行判定；当尿素反应阳性时，可能为沙门氏菌的个别变体，需结合血清学鉴定结果进行判定。

如果生化反应结果符合反应序号A2：即靛基质反应阳性时，需要补做甘露醇和山梨醇试验，两项试验结果均为阳性，为可疑沙门氏菌，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

如果生化反应结果符合反应序号A3：补做ONPG。ONPG 阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门氏菌，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

必要时按标准中表5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。这就需要使用系统生化鉴定的方法，来减少生化鉴定的工作量，保证生化鉴定的准确性.

5、血清学鉴定

生化鉴定结果符合沙门氏菌属特征的继续做血清学鉴定。血清学鉴定需使用沙门氏菌的多价菌体（O）抗原和多价鞭毛（H）抗原诊断血清。血清学实验必须基于生化实验的结果，不能单纯以血清学实验结果来报告最终结果。血清学分型为选作项目，可不做。

本片仅展示常用的O抗原的鉴定和H抗原的鉴定，检验步骤及注意事项有：

（1）在玻片上划出两个区域，分别标记对照和O抗原，从营养琼脂上挑取 1 环待测菌，各放1/2 环于玻片上的每一区域上部，

（2）在标记为O抗原的区域下部加 1 滴O抗血清（或H抗血清），在标记为对照区域的下部加入1 滴生理盐水，作为对照。

（3）再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液

（4）将玻片倾斜摇动混合1min ，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。注意：O抗血清和对照的生理盐水都不凝集时，应考虑待检菌是否存在荚膜抗原。可将浓菌液在100℃条件下加热处理15-60min，破坏荚膜抗原，然后再做O抗原鉴定。

本实验的对照均匀浑浊，O抗血清凝集成块，为阳性

H抗血清实验步骤与O抗血清相同。

本实验的对照均匀浑浊，H抗原为絮状或绒毛状凝集，为阳性。

注意：实验结束后，阳性平板和试管以及感染材料，使用的阳性对照菌株均需高压灭活，再处置；氰化钾反应管灭菌后每管加入数粒硫酸亚铁和0.5mL 20%氢氧化钾溶液，然后才可清洗。

拓展阅读

《GB4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》

食品微生物检验论坛：https://www.360docs.net/doc/8f19147561.html,/forum-1-1.html