组化和免疫组化染色结果的定量测定
免疫组化 巨噬细胞浸润 评分
免疫组化巨噬细胞浸润评分【免疫组化：探索巨噬细胞浸润评分】引言：免疫组化是一种在组织切片中检测特定蛋白质表达的方法，通过使用抗体来特异性地标记目标蛋白质，从而揭示细胞类型、状态以及相互作用的信息。
巨噬细胞是免疫系统中非常重要的免疫细胞，其浸润程度与肿瘤的预后密切相关。
本文将深入探讨免疫组化中的巨噬细胞浸润评分，在理论和实践中为读者提供全面的了解。
一、免疫组化简介：免疫组化是通过利用抗原-抗体反应来检测组织切片中目标分子的存在和分布。
它可以精确地检测细胞内和细胞外的蛋白质表达情况，并通过染色的强弱来定量目标蛋白的表达水平。
免疫组化广泛应用于医学研究中，特别是癌症领域，它可以揭示肿瘤微环境中不同细胞类型的分布和相互作用。
二、巨噬细胞的重要性：巨噬细胞是免疫系统中的关键成员，具有吞噬、抗原递呈和分泌炎症因子等功能。
研究发现，巨噬细胞在肿瘤的发生、发展和治疗中起着重要作用。
巨噬细胞的浸润程度被认为是肿瘤预后的一个重要指标，高浸润程度通常与较好的预后相关。
三、巨噬细胞浸润评分的建立：巨噬细胞浸润评分是通过对免疫组化染色结果进行定量分析，来反映巨噬细胞在肿瘤组织中的分布和数量。
它通常从以下方面进行评估：1. 巨噬细胞的定位：巨噬细胞主要分布在肿瘤组织的边缘区域，特别是炎症灶附近。
通过标记CD68等巨噬细胞特异性表面抗原，可以明确巨噬细胞的位置。
2. 巨噬细胞的密度：通过计算巨噬细胞的数量和肿瘤组织的面积，可以得到巨噬细胞的密度。
高密度的巨噬细胞浸润通常与较好的预后相关。
3. 巨噬细胞的活性：巨噬细胞的活性可以通过免疫组化标记M2型巨噬细胞的特异性标记物来评估。
M2型巨噬细胞通常与肿瘤的恶性程度和预后相关。
四、巨噬细胞浸润评分的应用：巨噬细胞浸润评分可以在临床研究和诊断中提供宝贵的信息。
通过对肿瘤组织标本进行免疫组化染色，并根据巨噬细胞定位、密度和活性进行评分，可以预测患者的预后和对治疗的反应。
巨噬细胞浸润评分还可以用于评估新药的疗效和机制研究。
免疫组织化学染色结果的判定
（三）免疫组织化学染色结果的判定1、对照的设立设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。
主要是针对第一抗体对照，常用的对照有阳性对照、阴性对照。
（1）阳性对照是用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果。
证明整个染色程序符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照就更加重要。
（2）阴性对照是用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，另外空白、替代、吸收和抑制试验均为阴性对照。
当阴性对照成立时，才能判定检测结果，主要用于排除假阳性。
对免疫组织化学染色结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性结果，除有对照试验结果之外，应进行多次重复试验，最好用几种其它方法进行验证，如用 SP 法阳性，可再用ABC法、PCR等验证。
必须学会判断特异性染色和非特异性染色，这对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。
特异性染色与非特异性染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位，如细胞质、细胞核和细胞表面，即具有结构性。
特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果，非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色，非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。
在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色，有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。
2、阳性细胞的染色特征免疫组织化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。
（1）阳性细胞染色分布有三种类型：①细胞质；②细胞核；③细胞膜表面。
大部分抗原见于细胞质，可见于整个胞质或部分胞质。
（2）阳性细胞分布可分为散在、灶性和弥漫性。
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结1 、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。
2 、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
3 、分类1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。
与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。
3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP 法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。
4 、目前几种常用免疫组化方法简单介绍1）免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。
免疫组化结果判断及常见问题的分析
非特异性染色
总结词
非特异性染色是由于抗体与非目标组织成分的交叉反应导致的。
详细描述
非特异性染色是免疫组化实验中常见的问题，通常是由于抗体与组织中非目标成分的交叉反应。为了减少非特异 性染色，可以尝试降低抗体浓度、增加洗涤步骤或使用阻断剂等方法。
背景染色
总结词
背景染色是由于组织中其他成分的非特异性染色或由于抗体与组织中其他成分的交叉反应导致的。
免疫组化结果判断及常见问题 的分析
目
CONTENCT
录
• 免疫组化基本概念 • 免疫组化结果解读 • 常见问题及解决方法 • 免疫组化在临床上的应用 • 免疫组化技术新进展
01
免疫组化基本概念
定义与原理
定义
免疫组化是一种利用抗原-抗体反应原理，通过标记的抗体在组织 或细胞中检测特定抗原的方法。
免疫组化可以与其他技术如原位杂交、原位PCR等联合应用，以同时检测抗原和 相关基因的表达，提供更全面的分子信息，有助于深入了解疾病的发生发展机制 。
联合应用多种技术可以相互补充，提高检测的敏感性和特异性，为临床诊断和治 疗提供更可靠的依据。
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数字免疫组化技术
数字免疫组化技术是一种基于数字图像分析的免疫组化技术 ，通过高分辨率数字成像系统获取组织切片图像，利用计算 机软件进行图像分析和处理。
数字免疫组化技术能够实现自动化、高通量的组织切片分析 ，提高检测效率，减少人为误差，特别适合大规模临床筛查 和流行病学研究。
免疫组化与其他技术的联合应用
04
免疫组化在临床上的应用
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
免疫组化技术可以检测肿瘤组织中特定抗原 的表达，从而确定肿瘤的性质和来源。通过 对不同肿瘤标志物的检测，有助于医生对肿 瘤进行准确的诊断。
实验结果免疫组化结果解读
实验结果免疫组化结果解读
免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织中特定蛋白质表达的技术。
通过对组织切片进行染色，可以观察到特定蛋白在组织中的分布和表达水平。
在解读免疫组化结果时，需要考虑以下几个方面：
1. 样本准备，首先需要确认样本的质量和处理是否符合实验要求。
样本的保存和处理对免疫组化结果至关重要，因为不恰当的处理可能会导致蛋白质的降解或者失活，影响最终的结果。
2. 阳性对照，在解读免疫组化结果时，需要对照阳性对照组织切片，确保实验条件和试剂的有效性。
阳性对照通常是已知含有目标蛋白的组织切片，用于验证实验条件和试剂的有效性。
3. 组织结构，观察组织切片的整体结构和形态，确保实验过程中组织的完整性和准确性。
免疫组化结果需要在正确的组织结构基础上进行解读，以排除可能的伪阳性或伪阴性结果。
4. 染色结果，观察组织切片的染色结果，包括颜色强度、分布和细胞定位。
根据染色结果的强弱和分布情况，可以初步判断目标
蛋白在组织中的表达水平和分布情况。
5. 数据分析，将染色结果进行定量分析，通常使用图像分析系统或者手动计数的方式进行。
通过定量分析可以得到目标蛋白的表达水平，进一步验证免疫组化结果的可靠性和准确性。
6. 结果解读，根据样本准备、阳性对照、组织结构、染色结果和数据分析，对免疫组化结果进行综合解读。
需要考虑目标蛋白在组织中的表达水平和分布情况，结合实验条件和其他实验结果进行综合分析。
综上所述，解读免疫组化结果需要综合考虑多个因素，包括样本准备、阳性对照、组织结构、染色结果、数据分析和综合解读，以确保结果的准确性和可靠性。
免疫组化染色评分方法
免疫组化染色评分方法摘要：一、免疫组化染色评分方法简介二、评分方法的具体步骤1.切片处理2.抗原修复3.抗体孵育4.染色5.洗涤6.复染7.评分三、评分标准及注意事项四、免疫组化染色评分在临床实践中的应用五、总结与展望正文：免疫组化染色评分方法是一种通过检测抗原与抗体反应来评估蛋白质表达水平的实验技术。
该方法广泛应用于生物学、病理学和临床检验等领域，为疾病诊断、疗效监测和疾病研究提供了重要依据。
本文将对免疫组化染色评分方法的具体步骤、评分标准及注意事项进行详细介绍，并探讨其在临床实践中的应用。
一、免疫组化染色评分方法简介免疫组化染色评分方法是一种通过检测抗原与抗体反应来评估蛋白质表达水平的实验技术。
它利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应将蛋白质抗原暴露出来，再与特异性抗体结合，最后通过显色剂显色，从而判断抗原的表达情况。
二、评分方法的具体步骤1.切片处理：将组织样本固定在载玻片上，并进行脱水、透明、浸蜡等处理。
2.抗原修复：采用热或酶消化法对切片进行抗原修复，以恢复抗原活性。
3.抗体孵育：将切片与第一抗体共同孵育，特异性结合抗原与抗体。
4.染色：加入显色剂，使结合的抗体显色。
5.洗涤：去除未结合的抗体和多余的显色剂，以便进行下一步操作。
6.复染：用苏木精或其他染料对细胞核进行复染，使细胞结构清晰。
7.评分：根据染色强度、阳性细胞比例和染色均匀性对免疫组化染色结果进行评分。
三、评分标准及注意事项1.评分标准：通常采用4级评分法，即0分为无染色，1分为弱染色，2分为中等染色，3分为强染色。
2.注意事项：a.抗原修复过程中，要根据组织类型和实验目的选择合适的修复方法。
b.抗体孵育时，应确保抗体浓度、孵育时间和温度等条件适宜。
c.染色过程中，要控制显色时间，避免过度染色或染色不均。
d.评分时应充分考虑染色强度、阳性细胞比例和染色均匀性三个方面的因素。
四、免疫组化染色评分在临床实践中的应用免疫组化染色评分方法在临床实践中具有重要意义，如评估肿瘤患者的病情、监测治疗效果和预测疾病预后等。
免疫组化评分标准
免疫组化评分标准免疫组化评分标准是指在免疫组化染色结果分析中，根据染色强度和阳性细胞的比例来进行评分的一种标准。
免疫组化评分标准的制定对于准确评价免疫组化染色结果，指导临床诊断和治疗具有重要意义。
本文将介绍免疫组化评分标准的相关内容，希望能对相关人员有所帮助。
一、免疫组化评分标准的基本原则。
1. 染色强度评分，根据染色结果的强度分为0、1+、2+、3+四个等级，分别代表无染色、弱染色、中等强度染色和强烈染色。
2. 阳性细胞比例评分，根据阳性细胞的比例分为0、1、2、3四个等级，分别代表阳性细胞比例小于5%、5-25%、26-50%和大于50%。
3. 总评分，染色强度评分和阳性细胞比例评分相乘得到总评分，一般为0-12分。
总评分越高，表示染色结果越强烈。
二、免疫组化评分标准的应用。
1. 临床诊断，免疫组化评分标准可用于辅助临床诊断，帮助医生判断肿瘤类型、分期和预后。
2. 药物治疗，某些药物的疗效与免疫组化染色结果有关，评分标准可用于指导药物治疗方案的选择。
3. 临床研究，在临床研究中，免疫组化评分标准可用于评价药物疗效、预测患者预后等。
三、免疫组化评分标准的注意事项。
1. 标准化操作，在进行免疫组化染色时，需要严格按照标准操作规程进行，以确保结果的准确性和可比性。
2. 质量控制，对于染色试剂、仪器设备等需要进行质量控制，确保实验结果的准确性。
3. 专业解读，免疫组化评分需要由具有丰富经验和专业知识的临床病理医师进行解读，以避免主观因素对结果的影响。
四、免疫组化评分标准的发展趋势。
随着科学技术的不断发展，免疫组化评分标准也在不断完善和更新。
未来，免疫组化评分标准将更加精细化，可以针对不同疾病、不同组织类型进行个性化评分，以更好地指导临床诊断和治疗。
总之，免疫组化评分标准在临床诊断和治疗中具有重要意义，正确理解和应用评分标准对于提高诊断准确性、指导治疗方案选择具有重要意义。
希望本文能对相关人员有所帮助，促进免疫组化评分标准的正确应用和发展。
免疫组化、elisa 、western blot 、PT-PCR
免疫组化是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。
样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。
elisa（酶联免疫吸附试验）用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。
免疫组化和elisa所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。
Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。
western bolt 先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。
免疫学三大工具，免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
以下western 和Elisa的区别不是原创，是找的资料。
western blotting 可以看到特异性的条带，但是定量比较烦elisa可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信。
WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响WB所检测的一般是抗原，而Elisa抗原抗体都可以检测。
WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB 可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而Elisa无能为力，一锅端了。
WB所适用的一抗一般是线性位点的，ELISA线性或构象型抗体都可以使用。
从另一个意义上讲，WB可以做抗体是线性位点还是构象型位点的补充判定，而Elisa不行。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。
免疫组化实验结果的判定和分析
免疫组化实验结果的判定和分析免疫组化实验结果的判定和分析就实验结果而言,免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析、图片的确定与选取、相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容.只有严格的实验设计、标准的实验操作、专业化的结果分析才能满足客户的要求，更好地为客户提供最优质的服务.免疫组化结果的判定原则：⒈必须同时设对照染色。
没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。
⒉抗原表达必须在特定部位。
如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA 及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应定位在细胞膜上等等。
不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。
⒊阴性结果不能视为抗原不表达。
由于检测方法灵敏度有高低之分,有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应,判断时应注意.⒋尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。
因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。
⒌对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。
对照染色设计：(一）对照染色的目的设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。
假阴性的原因主要有三种:①组织处理不当,抗原丢失过多或被遮蔽;②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液pH和离子强度不当等。
假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：①自发荧光或内源酶等干扰；②抗体试剂不纯（特别是一抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；④Fc受体的干扰,等等。
(二）对照的种类及其选用目的对照染色大致可分为四类：即阳性组织对照、阴性组织和阴性试剂对照及自身对照。
⒈阳性组织对照指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。
正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性,排除假阴性的可能。
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ELV大鼠睾丸和附睾SPAG11E免疫组化灰度值测定结果: 睾丸: ELV 2周和4周组SPAG11E蛋白的平均灰度值与其相应的对照组 比较未见明显改变(P>0. 05); 附睾: ELV2周和 4周组SPAG11E蛋白的表达均较同期对照组显著减弱 (P<0. 05或P<0. 01), ELV4周组附睾SPAG11E蛋白的表达较ELV2周组显著 减弱(P<0. 01).
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D. 应用举例: 1. 肿瘤学(Oncology): 绝大多数肿瘤从空间与时间上都显示 出稳定的多倍体DNA含量, 而且常常是非整倍体数. FCM能 诊断异常的DNA干系, 可作为指导肿瘤的治疗, 了解病情 发展, 判断预后和肿瘤治疗药物筛选等的有力证据. 2. 细胞凋亡(Apoptosis): 细胞凋亡是细胞程序性死亡, 其特 征是染色体断裂和DNA片段化, 凝胶电泳呈现梯状条带; 细胞皱缩, 致密并迅速破碎形成凋亡小体, 而被邻近细胞 所吞噬. 细胞凋亡时需要继续合成DNA, 蛋白质和ATP. FCM 检测分析可见DNA G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰(又称亚 G1峰), 代表细胞凋亡, 该峰下的面积即是凋亡细胞的相对 数量, 可由FCM自动给出.
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B. 特点: 1. 分辨率高: LSCM以激光为光源, 观察标本的反差明显, 最 小可观察厚度为0.5m. 2. 灵敏度高: 采用光电倍增管来检测荧光, 并利用不同的滤 片可将不同的光分开. 3. 扫描速度快: 可达微秒级. 因此可动态观察细胞内化学成 分如Ca2+, Mg2+和pH值的变化, 也可对膜电位, 膜的流动性等 进行测定. 4. 光学切片与细胞CT : 将样品各深度的切片叠加在一起进 行三维重组, 观察不同断面中细胞成分的变化, 即“细胞 CT”. 5. 图像存取方便: 计算机可快速及时保存图像, 其数据存取 方便, 可随时调用.
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3. 信号检测系统: 测定细胞发出荧光的角度, 波长和大小, 可知细胞的体积和细胞内某种物质的含量. 4. 控制系统: 校准调节上述系统.
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C. 样品染色: 绝大多数用荧光染料进行标记. 1. DNA 双螺旋; 神光霉素与G-C有特异性; Hoechst33258与A-T有 特异性; 吖啶橙(Acridine orange, AO)可以同时染色DNA 和RNA. 2. 细胞核: DAPI (4', 6-二脒基-2-苯基吲哚 )是专与细胞核 结合的荧光素. 3. 蛋白质含量: 一般用异硫氰酸荧光素(FITC). 4. 外周T, B和单核细胞以及T细胞的亚群分选: 结合特 异性单克隆抗体.
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III. 流式细胞术 A. 简介: 可对单个细胞逐个地进行高速准确的定量分析和 分类, 每秒测定达数千万个细胞, 且有高度的重复性. 在单 个细胞中, 可同时测得DNA, RNA及细胞体积3个参数, 也可 测定核与细胞的比例, 蛋白质和免疫标记的其它参量. B. 主要结构和工作原理: 1. 液流系统: 先制备荧光等染色的单细胞悬液, 放入样品管 中, 使其在气体压力下进入流动室; 流动室内充满鞘液, 在 鞘液的约束下, 细胞排列成单行, 由流动室的喷嘴喷出, 成 为细胞柱液, 依次恒速通过测量区. 2. 激发光器件: 在测量区内发射波长可调的激光柱, 垂直照 射细胞液柱, 细胞受激光照射后发生散射光和荧光.
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2. 应用: 定量给出组织细 胞形态的几何参数和组织 结构(包括宏观和微观)的 特征性参数, 从平面测量 推算到空间参数和组织结 构的三维图像重建. 3. 注意事项: a. 照片高质量高倍. 对照 组照片的放大倍数应相同. b. 复染会影响灰度值的准 确性. c. 必要时要进行图像的加工处理, 如阳性区选择和图像切割 等.
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II. 显微分光光度术 A. 简介: 细胞分光光度计(cytospectrophotometer), 是一种 以物质分子对光波的选择性吸收为基础, 对生物样品中 的化学物质进行定量测定的精密仪器. 通过测定核酸, 蛋 白质, 脂类, 酶类或其它化学成分的光吸收和微区面积而 计算它们的相对含量. B. 主要结构和工作原理: 1. 光源: 有白炽灯和汞灯, 疝灯. 白炽灯可作为标准光源, 辐射光谱在400~700nm间, 用于一般测量. 汞灯为激发荧 光的理想光源, 疝灯的辐射光谱在250~1100nm间. 2. 单色器和滤光片: 保证进入显微镜的光波亮度充足, 波 长单一且可调. 3. 光电组合件: 将测量区内的光学信号转变为电子信号, 产生测量数据.
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5. 荧光光漂白恢复(Fluorescence recovery after photobleach, FRAP): 用来测定活细胞的动力学参数. FRAP借助高强度脉冲 激光来照射细胞某一区域, 造成该区域荧光分子的光粹灭, 该 区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩 散, 这个扩散速率可通过LSCM探测, 得到分子运动和胞间通 讯等动力学参数. 6. 激光光陷阱技术: 即光摄技术, 广泛应用于染色体移动, 细 胞器移动, 细胞骨架弹性测量, 细胞周期和调控研究及分子动 力原研究等. 利用光学梯度力形成的光陷阱, 产生具有传统机 械挟持和操纵微小物体的功能. 当微米级颗粒落入一个非均 匀光场中, 它将趋于特定的平衡位置, 物体不会偏离光学中心, 造成一个势能较低的陷阱区域, 这种固定是光子动量的结果, 与照明强度和波长有关.
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3. 生物活性物质笼锁(Caged)和解笼锁(Uncaged)的测定: 笼 锁化合物与生物活性物质(如第二信使, 核苷酸, 神经递 质, Ca2+等)结合可抑制后者的活性, 使其处于笼锁状态. 当用LSCM强度和时间可人为控制的特异性波长的光瞬间 照射后, 光活化解笼锁, 使该活性物质释放, 其直接在光 解部位发挥的作用为LSCM所检测. 4. 贴壁细胞的分选: 用高能量激光杀灭不需要的细胞(荧 光标记), 留下需要的活细胞继续培养.
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左侧睾丸和附睾体部精子结合抗原蛋白异构体 11 (SPAG11E)免疫组化染色. 西安交通大学医学院解剖与组胚专业博士生田宏. 2010. 左侧睾丸: A. 左侧假手术对照组; B. 精索静脉曲张(ELV) 2周组周; C. ELV4周. 附睾体部: D. 左侧假手术对照组; E. ELV2周; F. ELV4周.
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V. 显微照相与白平衡 A. 绝对黑体: 物体对电磁波具有吸收, 透过, 反射三种 作用, 分别以吸收率, 透过率, 反射率衡量, 此三者相 加等于1. 吸收率为1而其它两项为0的物体称绝对黑 体. 透过率为1的叫绝对透明体. 反射率为1, 表面光滑 的叫镜体, 不光滑的叫白体. 这几种物质在现实中是 不存在的, 是理想的情况. B. 色温: 1. 概念: 是表示光源光谱质量最通用的指标, 按绝对 黑体来定义, 单位为K. 光源的辐射在可见区和绝对黑 体的辐射完全相同时, 黑体的温度就称此光源的色温. 光线的色温是相当于黑体散发出同样颜色时所受到 的“温度”.
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Overlapping distributions of corticothalamic (皮质丘脑) and (丘脑 皮层) thalamocortical pathways. Early
postnatal mouse.
GABA-containing terminals (red) in close apposition to oxytocin neurons (green). Rat hypothalamus.
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C. 基本步骤: 1. 标本制备: 凡是显示细胞内化学物质的各种组化和免疫组 化染色标本均可用显微分光光度计对单个细胞进行定量测 定, 但标本内不能有双重染色且染色要保持均匀一致.
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2. 测量方法: a. 单波长法: 用一种波长的光测量, 所测物质分布如果是均 匀的, 因此测量法所得数值, 其误差就小. b. 扫描测量法: 能够消除由于吸光物质分布不均匀而造成的 分布误差, 和由于面积不规则造成的面积测量误差. 扫描法 的原理是通过积分的方法, 虽然被测物质分布不均匀, 但可 以将被测物质的面积分成许多小区, 将各个小区的数值相加. c. 荧光光度法: 凡被测物质能产生荧光(原发荧光, 诱发荧光, 荧光或免疫荧光标记)的都可以应用荧光光度法测定. 广泛用 于测定细胞内的核酸(DNA和RNA), 氨基酸, 蛋白质, 糖原, 生 物胺, 抗体和酶的相对含量. D. 应用范围: 对细胞的DNA, RNA, 蛋白质, 酶, 糖, 脂等大分 子物质以及免疫活性物质等都能定性, 定位和定量测定.
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2. 动态观察: a. 细胞内各种离子浓度的测定: 用于动态观察一段时间内 细胞内Ca2+, Mg2+, pH值的变化并可进行定量测定. 其点扫 描, 线扫描和图像扫描可分别观察微秒级和毫秒级的快速 变化. b. 细胞膜流动性测定: 细胞膜荧光探针受到极化光线激发 后, 其发射光的极性依赖于荧光分子的旋转, 而这种有序 的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性.
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C. 功能: 1. 静态观察: a. 单染色样品的观察和分析: 可对一种荧光标记的样品进 行观察和分析, 获得细胞平均荧光强度, 积分荧光强度, 细胞的周长, 截面积和形态因子等参数. b. 双染色样品的观察和分析: 可将同一部位的不同扫描图 像叠加起来, 用于双染, 三染甚至四染样品, 但需注意各 种荧光染料的激发和发射波长互不干扰. c. 自动图像扫描观察分析: 用于一个平皿中多个散在并可 能同时发生变化的细胞的同时观察. d. 荧光强度的定量测定: 用于高灵敏度快速的免疫荧光测 定, 以准确地监测抗原表达, 细胞结合和杀伤及定量的形 态学特性.
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I. 图像分析术 A. 目测半定量: 依据反应产物的面积和颜色深浅, 主观性大. B. 图像分析仪(Image analyzer): 又称图像分析系统. 1. 主要结构和工作原理: a. 显微镜: 获取染色结果的光学信息. b. 图像输入装置: 摄像机或扫描器, 将光学信息输入电脑. c. 电脑: 将光学信息转换成电子信息. 将光学信号的灰度分为 256级可发现染色深浅的微小差别. 彩色有两种: 真彩色(Real color) 是指标本染色的真实颜色, 而假彩色(Pseudo color)是指 将不同灰度转换成不同的颜色以增强对比度. d. 输出装置: 显示器或打印机等给出图象表面几何形状测量 (体积/面积/表面积/长度等)和图象密度测量(数目)等客观数据.