测序引物设计指南
引物设计和NCBI使用指导
NCBI收录了诸多物种的基因组DNA、编码序列mRNA以及其他相关核酸序列的数据。使用Primer-Blast进行比 对，首先要输入一对引物序列，并选择序列所属数据库。此时系统将在该数据库中对序列进行查找和对比，并将 引物可能结合的位置进行记录，一旦结合位置处于两条链并且产物大小符合要求，系统就会将这种情况列举到结 果中。需要注意的是，结合模板的引物不仅是一条正向一条反向，也有可能是两条正向或者两条反向引物。
Primer-BLAST-01
Primer-BLAST-02
Primer-BLAST-03
引物设计
Primer-BLAST-引物特异性及比对原理
引物的特异性 引物是一段短的单链寡核苷酸，在PCR过程的退火阶段，引物与单链模板结合，DNA聚合酶沿着引物的3末端
向后进行DNA的合成。引物与模板的结合遵循碱基互补配对的原则，因此，当退火温度不合适或引物设计不合理 时，引物会结合到模板的非目标区域，从而导致其他片段的ห้องสมุดไป่ตู้增。
idt设计引物步骤
idt设计引物步骤1. 确定目标序列：首先，我们需要明确实验的目标，即我们想要扩增、克隆或测序的DNA序列。
可以是一个基因、一个特定的DNA 片段或者是整个基因组。
2. 引物长度：接下来，我们需要确定引物的长度。
引物是一小段DNA序列，通常由20-30个核苷酸组成。
引物的长度应该足够短，以便在PCR扩增或测序过程中能够特异性地结合到目标序列上。
3. 引物设计原则：在设计引物时，有一些原则需要遵循。
首先，引物的GC含量应在40-60%之间，这可以增加引物与目标序列的特异性结合。
其次，引物的3'末端应以C或G为主，这有助于避免引物的5'末端的退火。
此外，引物的Tm（退火温度）应在50-65℃之间，以确保引物能够稳定地结合到目标序列上。
4. 引物序列分析：在设计引物之前，我们需要对目标序列进行一些分析。
可以使用一些生物信息学工具，如BLAST，来搜索类似的序列并进行比对。
这可以帮助我们确定引物与目标序列的特异性。
5. 引物设计工具：现在有很多在线工具可以帮助我们设计引物。
这些工具可以根据我们提供的目标序列自动生成合适的引物。
其中一些工具还可以根据特定的实验要求，如PCR扩增、测序或突变分析，进行引物设计。
6. 引物合成：设计好引物后，我们需要将其发送给DNA合成公司进行合成。
在合成引物时，我们需要提供引物的序列、长度和纯度要求。
DNA合成公司将根据我们的要求合成引物，并将其以干燥的形式提供给我们。
7. 引物验证：在使用引物进行实验之前，我们需要对其进行验证。
可以使用一些实验方法，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、比色法或测序等，来验证引物的纯度和特异性。
总结起来，设计引物是进行各种生物学实验的重要步骤之一。
通过确定目标序列、确定引物长度、遵循引物设计原则、进行引物序列分析、使用引物设计工具、合成引物和验证引物等步骤，我们可以设计出高质量的引物，从而保证实验的成功。
希望本文对你对IDT 设计引物有所了解。
如何设计引物 (2)
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其T m值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6.碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
引物设计知识点总结大全
引物设计知识点总结大全引物设计是分子生物学和遗传学研究中的重要环节，它在PCR扩增、基因测序、基因突变检测等实验中起着至关重要的作用。
引物设计的好坏会直接影响实验结果的准确性和可靠性。
下面是引物设计的相关知识点总结：一、引物设计的基本原则1. 引物长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，过短的引物容易产生非特异性扩增，过长的引物则会降低扩增效率。
2. 碱基组成：引物的碱基组成应尽量避免多聚腺嘌呤或多聚胸腺嘧啶的情况，以免引起扩增效率降低或引物间的二聚体形成。
3. Tm值匹配：引物的熔解温度（Tm值）应尽量匹配，以确保二聚体形成和特异性扩增。
4. 特异性：引物的特异性是引物设计的关键，必须确保引物只会与待扩增的目标DNA序列特异结合，而不与其他非目标DNA序列结合。
5. 避免互补二聚体：引物之间的互补二聚体会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增，因此需要避免引物之间的互补结构。
二、引物设计的工具和方法1. 序列分析工具：常用的序列分析工具包括NCBI的BLAST、Primer-BLAST、OligoAnalyzer等，通过这些工具可以评估引物的特异性和二聚体形成潜力。
2. 引物设计软件：引物设计软件可以根据目标序列自动生成合适的引物序列，在设计引物过程中考虑多个因素如Tm值、长度、特异性等。
常用的软件有Primer3、Primer Premier等。
3. 引物设计策略：根据实验需求选择合适的引物设计策略，常用的策略包括温度梯度扩增引物设计、Asymmetrical PCR引物设计、引物修饰等。
三、引物设计中的注意事项1. 引物位置选择：引物应该选择在目标序列中的稳定区域，避免选择在重复序列、变异位点和剪切酶位点等容易引起问题的区域。
2. 引物长度控制：引物长度的选择需要平衡扩增效率和特异性，过短的引物可能导致扩增效率降低，过长的引物则可能增加非特异性扩增的风险。
3. 引物设计的平衡性：在设计引物时，需要平衡Tm值的匹配、特异性和二聚体形成的可能性，以达到最佳的扩增效果。
测序引物的要求
• 测序模板的要求
• PCR产物直接测序 • PCR已纯化产物：
提供切胶回收纯化后的PCR产物20ul (浓度大于50 ng/μl), 并请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl（具体体积视客户反应数相应增加）。 • 未纯化PCR产物： • 提供至少40ulPCR扩增原液，送样前取2ul经琼脂糖胶鉴定目的片断为明亮的一条带, 同时请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl （具体体积视 客户反应数相应增加）。
6 Invitrogen Proprietary & Confidential
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——DNA的四级结构： DNA与蛋白质形成的复合物。如 染色体（质）。
7 Invitrogen Proprietary & Conf本概念
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——单核苷酸及DNA的二级结构——4种脱氧核苷酸分子 通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。
5 Invitrogen Proprietary & Confidential
。
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——DNA的三级结构：双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形 成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。
除了RNA(核糖核酸)和噬菌体外，DNA是所有生物的遗传物质基础。生 物体亲子之间的相似性和继承性即所谓遗传信息，都贮存在DNA分子中。
引物设计原则
我最近合成了几十对引物，，在实战中多多少少有些心得，拿出来给大家分享。
我感觉想把引物合成的比较好，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我们还要重点考虑以下因素：一、GC% GC含量对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。
产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。
二、Degeneracy 多义性当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。
三、3’ End Stability 3 末端稳定性引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端。
如果引物3 稳定性强，有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带（secondary bands）。
而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。
四、GC Clamp GC钳引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端。
这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。
它保证引物与模板的稳定结合。
选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。
五、Secondary Structures 二级结构二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。
二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率，形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。
六、Hairpin 发卡结构发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。
发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。
自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应。
引物设计的标准操作规程
引物设计的标准操作规程（编号：004）1、软件使用1.1 推荐软件：Primer Premier 5.01.2 优点：操作简单、显示各种参数改变和二聚体、异二聚体、发夹结构等。
1.3 本地同类软件：DNAClub；Oligo 6.22；Vector NTI Suit；Dnasis；Omiga；Dnastar；DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)。
1.4 网上同类软件：Primer3、JaMBW（European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg 开发）。
http://210.72.11.60网站已引进并调试好这两种软件。
2、推荐操作引物搜索：Primer Premier 5.0、引物评价：Oligo 6.223、引物设计的原则首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。
围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。
以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：3.1 引物的长度一般为18-25bp，引物长度过长会导致延伸温度过高，从而影响DNA聚合酶的效率，上下游引物长度差别最好不要大于3bp。
3.2 引物最好在模板DNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
PCR引物设计技巧
PCR引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，用于扩增目标DNA序列。
PCR的成功与否，很大程度上依赖于引物的设计质量。
一个好的PCR引物设计可以确保反应的特异性、有效性和稳定性。
以下是一些PCR引物设计的技巧。
1.引物长度和GC含量：一般而言，引物长度应在18-24个碱基之间。
引物的GC含量应在40-60%左右。
过低的GC含量可能导致反应特异性不足，而过高的GC含量可能导致引物相互结合和非特异性扩增。
2.引物序列选择：引物序列应选择在目标序列上具有一定变异性的区域。
引物的序列不应包含重复序列、自身互补序列或多聚性序列，以免导致引物间的相互结合或非特异性扩增。
3.引物特异性检测：在设计引物时，应进行引物特异性的检测。
可以使用生物信息学工具，如BLAST，检查引物序列是否与其他非目标序列有任何匹配。
特别是在设计引物用于复杂的基因组中时，应特别关注引物的特异性。
4. 引物互补性检测：在进行引物设计时，应检查引物之间的互补性。
引物之间的互补性可能导致引物相互结合，影响扩增效率和特异性。
可以使用生物信息学工具，如OligoAnalyzer，检查引物之间的互补性。
5.引物长度和跨越剪切位点：在设计用于检测RNA的引物时，应特别注意引物的长度和是否跨越了剪切位点。
过长的引物可能跨越剪切位点导致扩增产物的长度不一致，降低扩增特异性。
6.引物末端修饰：PCR引物的末端可以根据需要进行一些修饰，如磷酸化、生物素化、荧光标记等。
这些修饰可以用于后续的检测和分离。
7.引物浓度和混合物：在PCR反应中，引物的浓度对反应的成功与否至关重要。
一般而言，两个引物的浓度应保持一致。
此外，在进行多重PCR反应时，不同引物的混合物也需要进行优化，以确保特异性和扩增效率。
8.引物的核酸相互作用力：引物的核酸相互作用力是指引物与模板DNA之间的结合力。
引物的核酸相互作用力可以通过计算引物的熔解温度（Tm）来评估。
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测序引物设计指南
♦PCR引物设计方法：
1。
引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对(Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2。
引物长度一般在15～30碱基之间。
引物长度(primerlength）常用的是18—27bp，但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA 聚合酶进行反应.
3。
引物GC含量在40%~60％之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量(composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm 值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下，50％寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度,一般高于Tm值5～10℃。
若按公式Tm=4（G+C)+2（A+T）估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55～80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。
5。
引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G和C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6。
碱基要随机分布.
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发（Falsepriming).降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
引物自身不能有连续4个碱基的互补.
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer)的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4。
5kcal/mol）。
否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8。
引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。
应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9)的引物.引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）
9。
引物的5′ 端可以修饰,而3′ 端不可修饰。
引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大.因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性.引物5′ 端修饰包括：加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。
3′端也不能有形成任何二级结构可能.
10。
扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关软件(比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明,待扩区域自由能（△G°）小于58。
6lkJ/mol时，扩增往往不能成功.若不能避开这一区域时，用7-deaza—2′—脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11。
引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。
如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。
有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低.在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。
做RealTime时，用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。
♦总结：
1)避免重复碱基，尤其是G。
2）Tm=58-60度.
3）GC=30—80%。
4)3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
6)PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大，一般在80—250bp之间都可;80～150bp最为合适（可以延长至300bp）.
7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在.而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都应该可以的。
做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。
对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备-—-寻找合适的引物非常不容易。
关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中,除了和你的目标基因之外,还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列,如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物,那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。