糖尿病KKAy小鼠的肝损害

DOC格式论文，方便您的复制修改删减 糖尿病KKAy小鼠的肝损害 （作者： ________ 单位： ___________ 邮编： ____________ ）

作者：娄金丽，王谦，杨硕，张锦，郑宏，黄启福 【摘要】 目的：探讨2型糖尿病肝损害的发生及可能的发病机制。 方法：KKAy糖尿病小鼠高脂饮食喂养，28周后处死小鼠，分别取血 清和肝组织，全自动生化法检测血糖（GLU、甘油三酯（TG）、总胆 固醇（TC）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）等生化指标；HE

Masson染色观察肝组织病理形态学改变；TUNNEL法检测肝细胞凋亡 变化；放免法检测肝组织中IL： .1B、TNF a含量的变化等。结果： 与正常小鼠相比，KKAy糖尿病小鼠血清中 GLU TG、TC均增高 （P0.01）,血清中ALT AST增高（P0.01）,肝组织病理形态学检 测可见肝细胞呈脂肪变性，肝组织纤维化，并可见肝细胞凋亡；肝组 织中IL 行、TNF a含量明显增高（P0.01）。结论：糖尿病KKAy 小鼠存在肝损害;IL 1 B、TNF a可能是其损伤机制之一。 【关键词】2型糖尿病；肝损害；细胞凋亡；细胞因子

2 型糖尿病是一种以胰岛素抵抗为主的慢性代谢综合征。糖尿 病患者由于糖和脂质代谢紊乱，肝内总脂量增多，导致糖尿病与肝 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 病并存。在美国，普通人群中非酒精性脂肪肝病 （nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD） 发生率约为5%,而2型肥胖糖尿病者

NAFLD发生率为25%- 75% [ 1] , NAFLD病变进展可由肝细胞脂肪变 性发展为肝纤维化、 肝硬化、甚至发展为肝功能衰竭或肝癌，故对 糖尿病非酒精性脂肪肝的研究日益受到重视]2]。本研究选用KKAy 糖尿病小鼠模型，观察了肝损害情况。 1材料和方法

1.1材料11周龄雄性SPF级KKAy糖尿病小鼠7只（许可证编号： SCXK京2005-0013）,高脂饲料（100 g/L脂肪,100 g/L 蔗糖，基 础饲料），11周龄的雄性清洁级C57BL小鼠7只（许可证编号：SCXK 京2002-0003） , C57BL小鼠作为正常组、KKAy小鼠作为模型组。 上述小鼠均购自中国医学科学院动物研究所维通利华实验动物中心。 125I TNF a、IL 1 B放射免疫分析试剂盒为北京普尔伟业生物科 技有限公司产品；原位细胞凋亡检测试剂盒（In situ cell death detection kit, POD ）为 Roche公司产品。 1.2方法

1.2.1标本采集 正常组小鼠喂正常饮食，模型组小鼠喂高脂饮食。 饲养期间定期测小鼠的血糖浓度，28周后小鼠禁食12〜14 h,称重， 眼球采血，分离血清，-70 C保存待测。处死动物，取肝组织称重、 匀浆、离心、取上清，-70 C保存待测。另取肝组织固定、 石蜡包 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 埋、切片。 1.2.2 血清生化指标的测定 采用全自动生化法，检测谷丙转氨酶

（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）及总胆固醇（TC）。 123 肝组织病理形态学检测 HE, Masson染色，光镜下观察。 124 肝细胞凋亡检测 TUNNEL法，用蛋白酶 K （20 mg/L溶于 Tris/HCl中，pH7.5 ）室温孵育30 min,滴加50卩L的TUNEL反应 混和溶液（内含酶浓缩液和标记溶液），37C孵育60 min,滴加50卩 L转化剂：POD（peroxidase）, 37C孵育30 min,滴加DAB显色齐,室 温下孵育5 min,常规脱水、 透明、 封片，在显微镜观察。在标记 时只加入50 L的标记溶液作阴性对照，阳性细胞核呈棕黄色。每 张切片随机选取3个高倍视野，采用Image Pro Plus 5.0 软件进 行结果分析，用积分光密度（Integrated optical density, IOD ）值 来表示细胞凋亡的变化。 1.2.5 放免法测定肝组织中IL「1B、TNF a含量 新鲜350 mg 肝组织迅速加入1 mL生理盐水匀浆、 离心、制备上清后，先做预 实验确定样品稀释浓度]3],然后按照试剂盒说明书中的操作程序 进行检测。 1.2.6 统计学分析 所有数据均以x 士 s表示，用SPSS12.0统计软件 进行数据处理。组间比较采用方差分析（ One way ANOVA。P0.01 为差异有统计学意义。 2结果 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 2.1血清各项生化指标的变化模型组与正常组比较空腹血糖含量 明显升高（P0.01 ）。ALT AST、TG、TC均高于正常组（P0.01,表 1）。表1血清各项生化指标变化bP0.01 vs正常组. 2.2 肝脏肉眼观察 正常组小鼠肝脏外观呈红褐色，质地 软而富有弹性，边缘锐利。模型小鼠肝脏体积明显增大，外观呈灰黄 色，边缘圆钝，质地较软，切面油腻感，呈典型肝脂肪变现象。 2.3肝组织病理形态学变化 HE染色可见正常组小鼠肝组织结构完 整,肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列 ，肝细胞分 界清，大小较均一，核圆而清晰，位于细胞中央，胞质丰富，肝窦 排列规则，汇管区清晰（图1A）。模型组小鼠肝细胞呈弥漫性脂肪变 性，胞质内充满大量大小不等的圆形脂滴。 脂滴绕于胞核周围或胞质 一侧，将核挤向一边，有的融合成大脂滴，将细胞核挤压于细胞边 缘，呈印戒形。脂肪变以汇管区最为明显，肝小叶边界不清，肝索排 列紊乱（图1B）。Masson染色可见，模型组小鼠脂肪变性的肝细胞周 围间质纤维结缔组织增多，呈蓝色（图1D）。 2.4肝细胞凋亡的变化正常组肝细胞形态正常，凋亡细胞少见，而 模型组呈脂肪性变的肝细胞核被挤压于细胞边缘，大量肝细胞核被 染色呈棕黄色（图2）, IOD检测发现模型组与正常组相比数值明显增 大（1276.18 士

214.07 vs 87.54 士 11.23, P0.01 ）。 2.5肝组织中IL； 1B、TNF a含量变化 与正常组相比，模型组 肝组织中IL 行、TNF a含量均明显升高（分别为0.41 士 0.08 vs 0.24 士 0.05, DOC格式论文，方便您的复制修改删减 2.53 士 0.22 vs 1.33 士 0.14, P0.01 ）。 3讨论

过去国内对2型糖尿病的研究曾选用“药物性模型”，通过给大鼠 注射化学药物如链脲佐菌素或四氧嘧啶,破坏胰岛B细胞，导致胰 岛素缺乏，引起实验性糖尿病或实验性高血糖。但这种模型有它的局 限性，不适用胰岛素抵抗机制研究。KKAy糖尿病小鼠是近年来繁殖 的具有先天性胰岛素抵抗特性的较为理想动物模型，与人类2型糖 尿病发病机制非常接近］1］。我们选用此小鼠作为研究模型。结果表 明,KKAy糖尿病小鼠在高脂饮食喂养28周血糖持续、明显升高，证 明它是较为稳定的糖尿病模型；ALT、AST、TG、TC均高于正常组， 比较符合2型糖尿病合并脂肪肝血清指标的变化；肝脏体积明显增 大，外观呈灰黄色；肝组织切片病理形态学观察肝细胞呈弥漫性脂 肪变性；TUNNEL法染色可见肝细胞凋亡等，提示2型糖尿病可出现 脂肪肝肝损害。那么2型糖尿病肝损害机制如何？ 近年研究支持“二次打击”学说］2］。糖尿病胰岛素抵抗、 游离脂 肪酸增多，以及肝脏内三酰甘油的增加，促使了脂肪肝的形成，肝 脏脂肪储积被视为“第一次打击”。大量脂肪酸堆积使肝脏线粒体内 脂肪酸B氧化增强，以及细胞色素P 450家族（特别是CYP2E1和 CYP4A1高表达,产生过量的反应氧物质（ROS。ROS及脂肪细胞或 枯否氏细胞产生的白细胞介素 1、6 （IL拟1、IL拟6）、肿瘤坏死 因子（TNF a）等可引起肝的脂质过氧化应激反应，产生大量氧自由 基，形成恶性循环。氧应DOC格式论文，方便您的复制修改删减 激和脂质过氧化应激反应造成对肝脏的“第 二次打击”，使线粒体结构和功能破坏，最终导致肝细胞凋亡、肝 脏坏死性炎症和纤维化的形成等］4, 5 ］。 我们的实验结果与上述结论相符合，即模型组肝组织中IL 1B、 TNF a的含量升高，此炎性因子可能启动细胞的氧化应激反应 ，导 致肝细胞的凋亡、肝纤维化等损害。同时提示KKAy小鼠可作为研究 2型糖尿病肝损害机制模型。进一步机制研究正在探讨中。 【参考文献】 :1］陈丽萌，李学旺，黄利伟，等.2型糖尿病小鼠(KKAy 动物模型的鉴定和早期肾脏病理病变］J］.中国医学科学院学报， 2002, 24(1): 71-75.

[2] Alba no E, Mottara n E, Vidali M, et al. Immun eresp onse towards lipid eroxidatio n products as a predictor of progression of non alcoholic fatty liver disease to advaneed fibrosis [J] . Gut, 2005, 54(7): 987-993.

:3 ]李旭光，郭宏林，李世梅.H型糖尿病肾病患者血清 IL「6、NO与ET水平的检测]J].细胞与分子免疫学杂志，2007, 23(1): 63.

[4 ] Videla LA, Rodrigo R, Araya J, et al. Insulin resista nee and oxidative stress in terdepe ndency in