应用TaqMan探针技术检测MTHFR基因的C677T和A1298C多态性
MTHFR基因A1298C多态性与肠癌遗传易感相关性研究
ａ ａ ｃｅｓ ｄｒ ｋｏ ｅ ｅ ｐｎ ｏｏｅｔｌ ａ ｃ ｒ（ Ｒ ＝ ． ８ ９ ％ Ｃ ： ． １— ９ ６ ）ｃ ｍｐ ｒｄｗ ｔ Ａ ｅ ｏ ｔ ｎ ｉ ｒａｅ ｉ ｆ ｖ ｌ ｉｇｃｌ ｃａ ｃ ｎ ｅ Ｏ ｎ ｓ ｄ ｏ ｒ ８３ ， ５ Ｉ １ ０ ６ ． ４ ｏ ａｅ ｉ Ａ ｇｎ — ｈ
ｓｏ ｓ ｒａｏｔｓ Ｊ ．Ｃ ｅ ｉ ，０ ９ ２ ４ （ ９ ： ２ ８ — ｐ ｎｅｏ ｐ ｐｏｉ ］ ｈ ｍ Ｂｏ ２ ０ ， ８ １ ） １ ８６ ｓ［ ｌ
１ ８ ５ ２ ９ ．
［ ］ 赵春华 ， ８ 曲凡 ， 赵春光 ， Ａ ２ ３淋 巴瘤 Ｒ ｊ细胞 抑制效应 及 等． ｓ０ ａ ｉ 其 Ｉ 基 因表 达 的 影 响 ［ ］ 中华 肿 瘤 防 治杂 志 ， ００，７ Ｊ． ２ １ １
（ｓ８ １３ ）ｉ ｌ ｉ ｅｒ ｋｏ ｃｌ ｅｔｌ ａｃｒ（ Ｒ ）ｉ ｏ ｕａｏ ｒ１０ １ １ ｎｒ ａｏ ｔ ｔ ｉ ｆ ｏ ｒｃ ｎｅ Ｃ Ｃ ｎａｐｐ ｌ ｉ ｅ ｔｎ ｏ ｈ ｓ ｏ ａｃ ｔ ｎ—ｂｓｄｃｓ —ｃｎ ｏ ｓ ｄ ｏ ｔ ａｅ ａｅ ｏｔ ｌ ｔ ｙｉ Ｓｕｈ ｒ ｕ ｎ
MTHFR基因检测指导男性不育个体化用药-2014.8.30
MTHFR基因检测指导男性不育个体化用药全世界约有15%的育龄夫妇不育，其中约50%是由男方原因造成的。
男性不育病因呈多样性与复杂性，遗传因素对男性不育的影响一直是男性不育领域研究的热点，叶酸代谢是研究的重点点。
叶酸在体内合成及代谢所涉及到的酶主要1有亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR) 、蛋氨酸合成酶(MTR) 、蛋氨酸合成还原酶(MTRR) 、胱硫醚合酶(CBS)。
这些酶的编码基因上存在众多的单核苷酸多态性，基因调控区和编码区的单核苷酸多态性可能会通过改变酶活性而影响叶酸、同型半胱氨酸（Hcy）在体内的合成，影响DNA的合成和DNA的甲基化,从而影响精子密度与活力2。
中国汉族人群中CC型频率为25.9%，CT型频率为44.9%，TT型频率为29.2%3，对8 篇文献中M THFR 基因677位点C→T和1298位点A→C的Meta 分析结果表明,MTHFR 基因C677T与生精功能下降显著相关(OR = 1. 39, 95%C I: 1. 1522. 69, P = 0. 000 6) 。
通过对2001至2009年共24篇男性不育相关文献中2275 名不育症患者和1958名健康男性的MTHFR基因677位点多态性与健康状态的统计分析，发现：MTHFR基因是亚洲男性不育的易感基因，亚洲男性MTHFR基因TT/CT型不育的风险是CC型的1.42倍；MTHFR基因TT/CT基因型男性精子缺乏的风险是CC型的1.55倍4。
伊朗研究者对伊朗164名不育成年男性和328名健康男性MTHFR (C677T, A1298C, G1793A)基因多态性分布进行研究。
发现血清叶酸浓度与精子参数呈正相关，同型半胱氨酸水平与精子参数呈负相关。
患者组MTHFR 基因677位点T出现的频率高于对照组2.41倍，说明MTHFR C677T 基因多态性增加男性不育风险5。
Bingbing Wei在亚洲人群证明，MTHFR C677T 非A1298C起精子密度下降主要作用，其后多项meta分析证明了MTHFR基因C677T 多态性造成男性无精、精子密度下降678。
探讨基因多态性对甲氨蝶呤代谢及临床的影响及意义
目录引言 (1)研究对象与材料 (3)1研究对象 (3)2治疗方案 (3)3不良反应监测 (3)4仪器与材料 (5)4.1主要实验仪器 (5)4.2主要实验试剂 (6)方法 (7)1PCR法检测基因的分型 (7)1.1基因组的提取 (7)1.2引物设计与合成 (7)1.3PCR扩增 (8)2限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析和测序 (9)3高效液相色谱法测定MTX动态血药浓度 (10)4统计学处理 (9)结果 (11)1.MTHFR基因型与等位基因分布情况 (11)2.MTHFR基因型与HD-MTX化疗后动态MTX浓度的关系 (11)3.MTHFR基因多态性与MTX毒副作用之间的关联性 (12)讨论 (15)结论 (19)参考文献 (20)综述 (20)综述参考文献 (20)攻读学位期间的研究成果 (31)附录 (32)致谢 (34)学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明 (35)引言引言白血病是临床上常见的一类造血干细胞恶性克隆疾病，因细胞增殖失控、分化障碍和凋亡受阻等因素所致在骨髓和造血器官和组织内大量增殖，浸润其他组织和器官，影响正常造血功能。
其中急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）儿童和青少年中最常见的恶性肿瘤之一，占儿童白血病发病率的一半以上，且以每年1%的速度在增长[1-3]。
急性淋巴白血病的主要临床症状为发热、出血、关节疼痛或贫血为主[4]。
该病发生迅速，恶性程度较高，但对化学药物敏感，癌细胞易杀灭[5]。
临床治疗上以甲氨蝶呤鞘内或者静脉注射为主要化疗方式。
1岁以内白血病患儿的生存率40~50%，1岁以上患儿5年生存率超过90%。
因此，ALL的及时发现和诊断对疾病的治疗具有重要意义。
随着分子生物学水平的快速发展，人们不断地从分子水平探寻疾病的发病机理，多年的临床研究表明，ALL的易感性与ALL基因多态性密切相关[6-8]。
潍坊地区孕期女性叶酸利用能力调查_修霞
·临床研究·潍坊地区孕期女性叶酸利用能力调查修霞，牟莹莹，陶华娟，赵金华，连文静(潍坊市妇幼保健院，山东潍坊261011)摘要：目的调查潍坊地区孕期女性的叶酸利用能力，分析叶酸利用能力与不良孕产史的相关性，为围受孕期叶酸补充和风险监测提供指导。
方法对2934例潍坊地区孕期女性进行叶酸利用能力遗传检测，采用Taqman-MGB技术检测亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFＲ）基因C677T、A1298C和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTＲＲ）基因A66G 位点的单核苷酸多态性分型，对叶酸利用能力遗传风险进行分级。
结果潍坊地区孕期女性发现高度叶酸利用能力遗传风险的比例为40．05%，全国参考数据为19．70%，P＜0．01；未发现遗传风险的比例为26．48%，全国参考数据为33．04%%，P＜0．01。
正常孕产组和不良孕产组的叶酸利用能力总体构成不同，存在统计学差异（χ2=19．47，P＜0．01），正常孕产组未发现遗传风险人群的比例为28．29%，不良孕产组为14．40%，两组比较P＜0．05；正常孕产组高度遗传风险人群的比例为38．13%，不良孕产组为52．88%，两组比较P＜0．01。
结论潍坊地区孕期女性叶酸利用能力较全国人群偏低；叶酸代谢和利用障碍与不良孕产史有相关性。
关键词：妊娠初期；不良孕产史；叶酸利用能力doi：10．3969/j．issn．1002-266X．2013．09．011中图分类号：Ｒ715．5文献标志码：B文章编号：1002-266X（2013）09-0031-03据2001年WHO公布的数据显示，活产新生儿中有3%存在各种先天缺陷，而新生儿死亡约10%由先天畸形导致［1］。
此外，孕早期的自然流产和胚胎停育占全部妊娠的10% 15%［2］，给患儿家庭带来沉重的精神负担。
研究表明，体内叶酸缺乏与叶酸代谢和转运相关的基因多态性构成了不良孕产的危险因素，妇女在围受孕期补充叶酸可减少胎儿畸形的发生。
叶酸代谢通路常见基因多态位点及其检测方法
ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｂｉｒｔｈ ｄｅｆｅｃｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｏｓｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｗｉｌｌ ｂｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ
ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ５ １０⁃ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
关键词： ５，１０⁃亚甲基四氢叶酸还原酶； 甲硫氨酸合成酶还原酶； 单核苷酸多态性；基因分型
中图分类号： Ｑ７８ 文献标志码： Ａ 文章编号： ２０９６⁃３６５３（２０２０）０３⁃０４４０⁃０６
ＤＯＩ： １０．１６８０９ ／ ｊ．ｃｎｋｉ．２０９６－３６５３．２０２００２１５０１
Ｃｏｍｍｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｆｏｌａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｔｈｅ
ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｔｏ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅ ｆｏｌａｔｅ ｃａｎ ｇｕｉｄｅ ｔｈｅ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｏｆ
ｆｏｌａｔｅ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ
用体外 表 达 的 酶 进 行 研 究 表 明， 相 较 于 野 生 型 酶，
苷酸多态位点，它们对叶酸代谢关键酶的活性影响很大，可以导致叶酸代谢障碍，血液中同型半胱氨酸
水平升高，与新生儿出生缺陷、不孕不育、心脑血管疾病、癌症等多种疾病发病风险的提高密切相关。 检
叶酸代谢能力基因检测操作流程
MTHFR C677T , MTHFR A1298C, MTRR A66G基因检测操作流程实验流程一、操作步骤适用仪器：普通PCR仪样本要求：EDTA抗凝剂的静脉全血（100µl），室温保存不超过7天， 2～8℃保存不超过1个月，-20℃保存不超过3个月，反复冻融次数不超过5次；DNA的浓度应不低于5ng/μl， A260/ A 280应在1.6~2.0之间。
有血块的样本需经匀浆处理或用组织研磨仪研磨处理后再进行全血DNA的提取。
检验方法：（试剂盒中的检本测卡、阳性/阴性对照卡上标识解释如下：M表示突变型，WT表示野生型，C表示质控线，T表示检测线。
）A：样本DNA的制备试剂盒准备工作：1、清洗液BW-I：用50 ml量筒分别移取35 ml无水乙醇（分析纯）和35 ml异丙醇加入至清洗液BW-I试剂瓶中，颠倒混合均匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。
2、清洗液BW-II：用50 ml量筒移取49 ml无水乙醇加入至清洗液BW-II试剂瓶中，颠倒混合均匀，在试剂瓶上标明“已加入醇”和日期，备用。
3、蛋白酶K准备：取出蛋白酶K，室温解冻，涡旋混匀后备用。
4、磁性微粒准备：将磁性微粒涡旋混匀，保证均一。
实验操作步骤：1.将20 μl蛋白酶K溶液加入2 ml 离心管的管底。
依次加入100 μl全血、200 μl裂解液BL，用涡旋振荡器混合15 sec(以下简称涡旋混匀)，56 ℃水浴20 min。
2.向步骤1裂解处理的样品中依次加入300 μl结合液BI、25 μl的磁性微粒（移取前必须充分涡旋混匀），涡旋混匀，室温静置5 min。
磁性分离5 min，弃上清。
3.从磁性分离器上取出离心管，加入400 μl清洗液BW-I，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清（期间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁），弃上清；重复本步操作，以400μl清洗液BW-I重复清洗一次。
4.从磁性分离器上取出离心管，加入400 μl清洗液BW-II，涡旋混匀，磁性分离至上清澄清（期间上下颠倒数次，以清洗离心管管壁），弃上清（尽可能弃去所有的清洗液BW-II）。
重型抑郁症患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测
重型抑郁症患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测冯磊光;邵春青;刘英慧;陶永红;郝潇蕾【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2010(030)008【摘要】目的探讨北方汉族人群5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与重型抑郁症的关系.方法采用病例-对照研究.聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测MTHFR C677T及A1298C基因多态性.结果 (1)对照组677TT基因型频率及T等位基因频率分别为13.16%和39.80%;1298CC基因型和C等位基因频率分别为1.32%和12.83%;(2)抑郁症组MTHFR 677TT基因型频率(35.53%)明显高于正常对照组(13.16%)(P<0.001),677 T等位基因频率(57.24%)明显高于对照组(39.80%)(P<0.001).(3)Logistic回归分析,C677T基因型与疾病的发生有关(P<0.001).结论 MTHFR C677T基因变异与本组重症抑郁症发病有关,是其发病的危险因素;MTHFR A1298C基因变异与本组重症抑郁症发病无关联.【总页数】4页(P811-814)【作者】冯磊光;邵春青;刘英慧;陶永红;郝潇蕾【作者单位】哈尔滨医科大学,附属第一医院,检验科,黑龙江,哈尔滨,150001;北京市天坛医院,检验科,北京,100700;哈尔滨医科大学,附属第一医院,检验科,黑龙江,哈尔滨,150001;哈尔滨医科大学,附属第一医院精神科,黑龙江,哈尔滨,150001;哈尔滨医科大学,附属第一医院,检验科,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】R749.3【相关文献】1.青年脑梗死患者同型半胱氨酸、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测 [J], 高娟;孙亚菲;李永乐;苏立凯;郭力2.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性荧光PCR检测方法的建立与应用 [J], 刘秀卿; 李延武; 李卓成3.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测对先兆流产孕妇的临床价值 [J], 陈跃4.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测在育龄人群中的临床价值 [J], 杨康;朱巧玲;周少雄;庄锡伟;彭健桥;欧阳佩雯5.亚甲基四氢叶酸还原酶A1298C基因多态性检测在高同型半胱氨酸血症治疗中的价值 [J], 徐炳欣;赵艳;段淑娟;居春阳;于洋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
1338例孕前育龄妇女MTHFRC677T、A1298C、MTRRA66G基因突变结果分析
1338例孕前育龄妇女MTHFRC677T、A1298C、MTRRA66G基因突变结果分析作者：黄卫彤覃卫娟李筱瑜来源：《中国现代医生》2019年第13期[摘要] 目的探讨孕前育龄妇女亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T、A1298C基因和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）A66G基因检测在出生缺陷防控技术应用中的价值。
方法选择2015年1月～2016年12月在我院做孕前检查的1338例育龄妇女为研究对象，抽取靜脉血，提取全血中的DNA，使用荧光定量PCR法进行检测MTHFR C677T、A1298C基因突变位点和MTRR ;A66G基因突变位点，分析基因频率分布情况。
结果 1338例孕前育龄妇女的MTHFR C677T位点CC、CT、TT基因型频率分布分别为58.6%、35.0%、6.4%;MTHFR基因A1298C位点AA、AC、CC基因型频率分布分别为62.5%、30.0%、7.5%; MTRR基因A66G 位点AA、AG、GG基因型频率分布分别为53.1%、39.8%、7.1%。
MTHFR C677T位点基因型频率分布与佛山、郑州、长春、九江、江苏研究结果比较，有显著差异（χ2=189.81、663.24、791.40、99.09、712.34，P<0.05）;MTHFR A1298C位点基因型频率分布与佛山、珠海、郑州、长春、九江、江苏研究结果比较有显著差异（χ2=45.33、20.21、60.92、103.24、22.83、84.56，P<0.05）;MTRR A66G位点基因型频率分布与郑州、长春研究结果比较有显著差异（χ2=7.290、6.432，P<0.05），而与佛山、珠海、九江、江苏研究结果比较无显著差异（χ2=3.500、0.534、0.537/3.351，P>0.05）。
结论南宁市孕前育龄妇女MTHFRC677T TT、A1298C CC、MTRRA66G GG基因型频率分布大致一致，但与国内其他地区比较MTHFRC677T、A1298C和MTRR A66G位点基因型频率分布有地域性差异。
亚甲基四氢叶酸还原酶基因检测报告
亚甲基四氢叶酸还原酶基因检测报告
亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate Reductase，简称MTHFR）基因检测报告是对人体内MTHFR基因的特定位点进行分析后得出的结果。
MTHFR基因编码的酶在体内的一个重要功能是参与同型半胱氨酸代谢途径中的一步关键反应，将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，后者是DNA甲基化过程中重要的甲基供体。
MTHFR基因有两个常见的变异位点：C677T和A1298C。
这些突变可能导致该酶活性降低，影响叶酸代谢，进一步可能增加心血管疾病、神经管缺陷等风险，并可能与某些类型的癌症、抑郁、焦虑等疾病的发病风险有关。
一份MTHFR基因检测报告通常会包含以下信息：
1. 检测结果：包括检测者的MTHFR基因在C677T和A1298C位点的具体基因型，如CC、CT、TT或AA、AC、CC等。
2. 风险评估：根据检测结果，对受检者可能出现的健康风险进行评估，如叶酸代谢能力、同型半胱氨酸水平异常升高的风险，以及相关疾病的患病可能性。
3. 建议措施：针对检测结果提供个性化的健康管理建议，例如是否需要补充活性叶酸或其他营养素，或者调整饮食结构以改善叶酸代谢状态。
需要注意的是，基因检测结果并不能作为绝对的诊断依据，其预测的风险程度也存在个体差异性，还需要结合临床症状、家族史和其他实验室检查结果来综合判断。
如有必要，请在专业医生指导下解读和应用基因检测报告。
叶酸基因代谢
叶酸基因代谢叶酸是一种重要的维生素，它在人体内起着许多重要的生理作用，包括DNA合成、维持血红蛋白水平、维持神经系统健康等。
叶酸的代谢过程十分复杂，其中涉及到多个基因的调控作用。
本文将从基因的角度探讨叶酸代谢的相关问题。
叶酸的代谢途径叶酸是由食物中摄入的叶酸和多种食物中的叶酸前体物质（如甲酸、氨基酸、核苷酸等）合成的。
在肠道中，叶酸通过多个载体蛋白（如PCFT、RFC、OATP1A2等）进入肠上皮细胞，然后再通过多个转运蛋白（如ABCG2、ABCC2、MRP1等）进入血液循环系统。
在血液中，叶酸主要与蛋白质结合，形成叶酸结合蛋白（folate binding protein， FBP）。
叶酸在肝脏中被代谢为叶酸多聚体，然后再通过肾脏排泄出体外。
叶酸代谢与基因相关性叶酸代谢涉及到多个基因的调控作用，其中最具代表性的是MTHFR基因和MTRR基因。
MTHFR基因MTHFR（甲基四氢叶酸还原酶）基因编码的酶参与叶酸代谢中的一个重要步骤：将5，10-甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸。
这个过程是DNA合成和维持DNA甲基化所必需的。
MTHFR酶的活性受到MTHFR基因的多态性影响。
MTHFR基因突变可以导致MTHFR酶活性降低，从而影响叶酸代谢。
MTHFR基因C677T和A1298C两个常见的突变位点已被广泛研究。
C677T突变会导致MTHFR酶活性降低，从而影响叶酸代谢。
A1298C突变则会导致MTHFR酶的亚型转换，可能也会影响叶酸代谢。
MTRR基因MTRR（甲基四氢叶酸还原酶还原酶）基因编码的酶也参与叶酸代谢中的一个重要步骤：将5-甲基四氢叶酸还原为四氢叶酸。
MTRR 酶的活性受到MTRR基因的多态性影响。
MTRR基因的常见突变位点为A66G和I22M。
A66G突变可能会导致MTRR酶活性降低，从而影响叶酸代谢。
I22M突变则会影响MTRR酶的折叠，可能也会影响叶酸代谢。
叶酸代谢与疾病相关性叶酸代谢异常可能会导致多种疾病，包括神经管缺陷、癌症、心血管疾病、自闭症等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
应用TaqMan探针技术检测MTHFR基因的C677T和A1298C多态性
作者：潘欣等
来源：《医学信息》2014年第11期
摘要：目的探讨一种快速、准确运用于临床检测MTHFR基因多态性的方法。
方法提取43例胃癌患者的外周血基因组DNA，用TaqMan探针技术对MTHFR基因的C677T和
A1298C两个多态性位点进行分型，并采用直接测序法对TaqMan探针分型结果进行验证。
结果 43例样本的MTHFR C677T基因型分别为14例CC、23例CT和6例TT；A1298C基因型为24例AA、18例AC、1例CC，两种分型方法结果一致。
结论本研究选用的TaqMan探针分型方法结果准确可靠，能够用于MTHFR的C677T和A1298C两个多态性位点分析。
关键词：TaqMan探针；MTHFR；多态性；DNA测序；胃癌
胃癌（Gastric cancer）是世界范围内的高发肿瘤之一[1]。
近年研究表明，低叶酸水平可增加包括胃癌在内的许多肿瘤发生的危险性[2]。
亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢途径中的一关键酶，MTHFR参与的体内同型半胱氨酸（Hcy）和甲硫氨酸之间的循环反应，反应中生成的S腺苷甲硫氨酸（SAM）是体内代谢唯一的甲基供体，涉及DNA的修复与合成，影响DNA代谢，与许多肿瘤化疗药物的疗效相关。
MTHFR的活性很大程度上可能受基因多态性的影响，从而影响疾病的发生和药物的疗效。
MTHFR基因C677T和A1298C为两个常见的多态性位点，有研究表明该位点的基因多态性会导致MTHFR酶活性的改变[3]，可能导致患者之间出现较大的个体差异。
因此，测定MTHFR的基因型对疾病的预防和合理用药有重要的意义。
现已有的MTHFR基因多态性的研究，大多数采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术，该技术不仅费时，且易污染造成假阳性。
不适宜用于临床检测。
本研究旨在探讨一种可用于临床快速准确检测MTHFR基因型的方法，故选用TaqMan探针技术对MTHFR的C677T和A1298C两个多态性位点进行分型。
1资料与方法
1.1一般资料经CT、MRI或病理组织学活检确诊的胃癌患者43例，来源于昆明医科大学第一附属医院，收集样本人群的外周静脉血2 mL。
采用Genomic DNA Purification Kit （PROMEGA公司）对基因组DNA进行提取，使用Nanodrop 2000测定DNA的浓度和纯度。
1.2 TaqMan探针技术检测MTHFR基因C677T和A1298C位点的多态性 TaqMan探针试剂由ABI公司为MTHFR基因C677T（SNP ID：rs1801133），A1298C（SNP ID：rs1801131）多态性设计的TaqMan SNP分析试剂，每个位点的TaqMan SNP基因分型试剂中，含有两条MGB探针。
MTHFR C677T一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基A，对应样本基因突变位点T。
MTHFR A1298C一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基T，对应样本基因突变位点A。
探针序列，见表1。
MTHFR C677T及A1298C多态性 real-time PCR采用25 μL反应体系：40×SNP Genotyping Assay Mix：0.625μL；TaqMan 2×PCR Master Mix：12.5 μL；DNA模板：1 μL；dd H2O：10.875 μL。
探针检测在BIO-RAD IQ5实时荧光PCR仪上进行。
反应条件为：95℃预变性10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，共40个循环。
由于仪器的限制，本研究使用的BIO-RAD
IQ5实时荧光PCR仪中没有VIC荧光检测通道，我们选择了HEX荧光通道替代，两种荧光相差1nm波长。
1.3 DNA测序法验证TaqMan探针技术检测MTHFR基因多态性
1.3.1目的片段的扩增设计MTHFR C677T及A1298C两个多态性位点的测序引物（Invitrogen公司合成），引物序列，见表2。
2结果
2.1 Taqman探针基因型分析 MTHFR C677T和A1298C real-time PCR散点图基因分型结果分别，见图1、图2。
2.2 DNA测序验证采用Lansergene SeqMan软件分析测序结果。
2.3 MTHFR基因多态性分型结果 43例样本MTHFR C677T基因型分别为野生纯合型CC 14例（32.5%）、突变杂合型CT 23例（5
3.5%）及突变纯合型TT 6例（1
4.0%）。
A1298C基因型分别为AA 24例（5
5.8%）、AC 18例（41.9%）、CC 1例（2.3%）。
本研究中，TaqMan 探针技术检测及DNA测序验证，两种检测方法得到的基因分型结果一致。
3讨论
中国是个胃癌高发的国家，每年新发病例数占全球总数的40%。
胃癌化疗方案众多且无标准方案，目前临床应用最广泛的是基于氟尿嘧啶类药物的化疗方案，在实际的化疗过程中，氟尿嘧啶类药物的个体差异较大，氟尿嘧啶类药物在体内均需转化为5-FU，继而发挥抗肿瘤作用。
MTHFR是5-FU代谢中的一个关键酶，5-FU的活性代谢产物还原型叶酸（CH2FH4）在
MTHFR的作用下转变为5-甲基四氢叶酸，使CH2FH4与胸腺嘧啶核苷酸合成酶（TS）、三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷（FdUTP）组成的三元复合物减少，从而削弱5-FU的抗肿瘤作用。
C677T突变产生丙氨酸被缬氨酸取代的错义突变，其合成的蛋白质会出现热稳定性降低和酶活性的改变[4]。
有研究提出，MTHFR基因的C677T多态性通过影响DNA甲基化和核酸稳定性，参与了胃癌的发生。
A1298C突变使得编码后谷氨酰胺被丙氨酸替代，有报道称[5]纯合子突变型可使酶活性降低到正常值的60%左右。
因此，测定MTHFR的基因型对肿瘤患者的个体化用药具有至关重要的意义。
但是，常规实验室多应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法检测MTHFR的基因多态性，该方法需要用凝胶电泳对扩增产物进行分析，易造成样本间污染，影响结果判读。
TaqMan探针技术省时、简单、准确、安全、实时分析是它突出的优点[6]。
同时，TaqMan探针在闭合单管中进行检测，避免了由样本间污染造成假阳性的结果[7]。
在我们的研究中，为了进一步验证TaqMan方法的准确性，我们进行了DNA测序验证，与TaqMan探针基因分型结果相比较，发现结果完全一致。
本研究采用的TaqMan探针分型方法结果准确可靠，故我们认为使用TaqMan技术为MTHFR C677T及A1298C基因多态性分型可用于临床检测。
TaqMan探针基因检测法具有很好的临床实用性，是临床快速诊断MTHFR 基因型较有价值的方法。
参考文献：
[1]Meyer H J，Wilke H.Treatment strategies in gastric cancer[J].Dtsch Arztebl Int.2011，108（41）：698-705，706
[2]Choi S W，Mason J B.Folate status：effects on pathways of colorectal carcinogenesis[J].J Nutr.2002，132（8 Suppl）：2413S-2418S.
[3]Etienne M C，Formento J L，Chazal M，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms and response to fluorouracil-based treatment in advanced colorectal cancer
patients[J].Pharmacogenetics.2004，14（12）：785-792.
[4]Ulrich C M，Robien K，Mcleod H L.Cancer pharmacogenetics：polymorphisms，pathways and beyond[J].Nat Rev Cancer.2003，3（12）：912-920.
[5]Warren R B，Griffiths C E.The potential of pharmacogenetics in optimizing the use of methotrexate for psoriasis[J].Br J Dermatol.2005，153（5）：869-873.
[6] Osgood-Mcweeney D，Galluzzi J R，Ordovas J M.Allelic discrimination for single nucleotide polymorphisms in the human scavenger receptor class B type 1 gene locus using fluorescent probes[J].Clin Chem.2000，46（1）：118-119.
[7]王苏梅，王克华，魏斌，等.TaqMan探针实时PCR检测人MTHFR基因C677T多态性方法的建立[J].中国优生与遗传杂志，2012，20（9）：11-14.
编辑/肖慧。