分子生物学第七章DNA重组与转座
1、单链摄入和链交换 RecA蛋白作用于DNA分子，用单链去置换双链分子的同源
区段，这个反应称单链摄入。RecA蛋白的这种作用是通过与游 离的单链3`-端结合，并引导单链DNA侵入双链DNA中，这种作 用还需要RecBCD的协助。
E.coli中有一种Chi[Kai]结构： 5`-GCTGGTGG-3` 3`-CGACCACC-5`
分子生物学第七章DNA重组与转座
3、单链侵入（single-strand invasion）由链置换产生的单 链区段侵入到参与联会的另一条DNA分子因局部解链而产生 的单链泡中。
4、Loop切除：侵入的单链DNA与参与联会的另一条DNA分子中 的互补链形成碱基配对，同时把与侵入单链的同源链置换出 来，由此产生D-Loop，其单链区随后被切除降解。
第七章 DNA的重组与转座
分子生物学第七章DNA重组与转座
• 7.1 同源重组 • 7.2 位点特异性重组 • 7.3 转座作用 • 7.4 逆转录转座子
分子生物学第七章DNA重组与转座
• 广义上，任何造成基因型变化的基因交流过程都叫遗 传重组（genetic recombination）.
• 狭义上，指涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流， 有时又称交换（crossing over）.
分子生物学第七章DNA重组与转座
RecBCD沿双链滑行至Chi结构 附近时，将其附近的兔耳结构 的一端切开形成具有3`-端的 单链区，RecA再与此单链DNA 的3`-端结合并引入另一双链 结构中导致重组，RecBCD则沿 双链继续寻找下一个Chi结构。
兔耳结构：RecBCD结合 DNA，使解链速度大于恢复双 螺旋的速度，所以形成二个单 链环，称兔耳结构。
特指噬菌体DNA整合到细菌染色体DNA的过程。最早在 λphage的遗传学研究中发现的，λDNA通过重组整合到大肠杆菌 染色体的专一性位点上，转变为原噬菌体DNA的非活性状态 （溶源状态）。在溶菌状态时，λDNA以环状分子独立存在，两 种状态的转换都与位点专一性重组有关。位点专一性重组不是 由DNA序列的同源性所引起，仅涉及短的同源序列。 整合和切 除过程是在细菌DNA和噬菌体DNA专一的附着位点 （attachment site , att） 上进行的，
5、链同化（strand assimilation ）Loop切除中产生的3`OH断头和侵入的单链的5`-P由DNA Ligase联接，同时侵入 的单链沿5`-3`方向继续置换，Loop切除中产生的5`-P断头。
6、异构化：链同化过程中，DNA经过一定的扭曲旋转形成的异 构体。
7、分支迁移（branch migration）：两条DNA分子之间形成的 交叉点可以沿DNA移动，这一过程称为分支迁移。
图、分枝迁移
分子生物学第七章DNA重组与转座
Holliday结构的拆分
重组体连接两个DNA双链的
交换中间物含有4股DNA链，在
其连接处为转换配对所形成交
叉 链 的 连 接 点 称 为 Holliday 结
构。该结构中由二对连锁在一
起的DNA分子组成。
Holiday中间体的形成只完
成了重组的一半，由于连锁在
同源重组发生在DNA 的同源序列之间。在生物细胞 中很普遍，如真核生物非姊妹染色体之间的交换，姊 妹染色体的交换，细菌及其某些低等真核生物的转化、 转导、接合等都属于同源重、断裂复合：
减数分裂中，染 色体减数分裂和配对 时，在染色单体水平 上发生物理断裂，断 裂可通过交叉重接而 解除张力，从而产生 两个相互重组的染色 单体。
• 通过不同个体间的基因交换，可以保证遗传的多样性， 从而为选择奠定物质基础。
• 遗传重组包括同源重组，位点专一性重组，转座重组 和异常重组。
分子生物学第七章DNA重组与转座
7.1 同源重组(homologous recombination)
一、定义：同源重组也称交换，指减数分裂过程中染 色体间遗传物质的交换，即在两个双螺旋DNA分子中 任何一对同源序列作底物进行交换。
分子生物学第七章DNA重组与转座
细菌的附着位点称attB，由 序列BOB`组成，噬菌体的附 着位点称attP，由序列POP` 组成，其中O序列为attB和 attP所共有，称为核心序列。 重组就发生在这段序列上。 在重组过程中λDNA以线性形 式插入细菌染色体，此时原 噬菌体被重组产生的两个新 的att（attL，attR）位点所 固定，整合过程在attB和 attP之间识别，而切除过程 在attL和attP之间识别。
分子生物学第七章DNA重组与转座
同源重组的作用 1、维持种群的遗传多样性 2、在真核生物中同源重组使同源染色体的染色单体间发生
物理连接，这样使第一次减数分裂时同源染色体能平均分配至 子代细胞中。
3、有助于DNA损伤的修复，发生重组的位置常含有错配的 碱基。
分子生物学第七章DNA重组与转座
7.2 位点专一性重组
一起的两条DNA分子必须经过拆
分（resolution）回复到彼此
分开的双螺旋状态。拆分的方
式有两种，需要内切酶在交叉
点处形成一对切口，然后由连
接酶连接。
分子生物学第七章DNA重组与转座
细菌DNA的重组
1、细菌重组酶： 1）RecA蛋白：为E。coli RecA基因的产物，RecA蛋白
是催化重组基本反应的酶，能通过碱基配对使两个 DNA连接成杂交分子。 2）Rec BCD酶：亦称核酸外切酶V，它通过Chi序列识 别靶位点。该酶具有多种活性，可以在单链结合蛋白 的存在下松开DNA双链，同时还具有ATP酶活性，它 在重组中的作用是提供具有3`-末端的单链区域。 3）ruvABC：其中ruvA和B基因产物可促进异源双链结 构的形成。
分子生物学第七章DNA重组与转座
（ 二 ） 重 组 过 程 : 由 Holliday 提 出 ， 后 经 Messelson ， Radding 修 改 ， 可 以 分 为 以 下 几个步骤. 1、切断（nicking）：同源联 会 的 两 个 DNA 分 子 中 任 意 一 个 出 现 单 链 切 口 （ 由 某 些 DNA 内 切酶产生）。 2 、 链 转 换 （ strand displacement）：切口处形成 5`端局部解链，由细胞内类似 于大肠杆菌DNA Pol I的酶系 利 用 切 口 处 的 3`-OH 合 成 新 链 ， 而把原有链转换出来，使原有 链成为游离的5`-单链区段。
4-DNA的修复和转座分子生物学PPT课件
-
3
（1）DNA复制不准确性
DNA复制是严格而精确的事件，但也可能发生 错误。虽然有碱基互补配对和 pol的校正作用， 但错配率仍有10 -10 左右。
-
4
染色体上有些位点是热点，复制错误率高
These mutation-prone sequences are repeats of simple di-, tri- or tetranucleotide sequences, which are known as DNA microsatellites.
• But DNA also undergoes spontaneous damage depends on an aqueous environment
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6
① 电离辐射
Ionizing （x-and γ-rays）and nonionizing （UV）radiation produce a variety of DNA lesions. 受到紫外线照射时，DNA链上相邻的嘧啶以共价键连接形成二聚 体。
One well-known example involves repeats of the dinucleotide sequence CA. Stretches of CA repeats are found at many widely scattered sites in the chromosomes of humans and some other eukaryotes.
• Other kinds of damage create altered bases that have no immediate structural consequence on replication but cause mispairing; these can result in a permanent alteration to the DNA sequence after replication.
DNA重组和转座
第一节 DNA重组（recombination）一）、DNA重组1、概念：是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。
2、意义：重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术二）、DNA重组的类型1、同源重组（Homologous Recombination）2、位点特异性重组（Site-specific Recombination）3、DNA的转座（transposition）同源重组一、概述1、定义：两个DNA分子同源序列之间进行的重组2、条件：（1）两个DNA分子有同源序列（相关的酶可以用任何一对同源序列为底物）（2）两个DNA分子必须紧密接触3、发生：真核生物: 非姐妹染色单体交换相对应的区域。
原核生物: 依赖recA蛋白，并形成 Holliday 结构Holiday模型（1964年）二、大肠杆菌同源重组的分子基础（一）RecA1、作用：可促进单链同化或单链吸收RecA具有使DNA单链置换双链中同源链的能力2、单链同化发生的三个条件（1）其中一个DNA必须存在单链区（2）其中一个DNA必须有一个自由3’末端（3）此单链区和3’末端必须位于两分子之间互补的区域内（二）RecBCD复合体1、酶的活性：（1）核酸酶（2）解旋酶（3）ATPase2、作用：在CHi位点处产生含3`游离末端单链。
（三）CHi位点——RecBCD识别的靶位点5`GCTGGTGG3`3`CGACCACC5`是重组频率较高的部位E.coli每隔约5~10kb有一个拷贝，Holliday 结构的形成：1. 同源序列排列在一起；2. 酶切。
通过核酸酶和RecBCD蛋白复合体的作用在一对同源DNA上产生切口；3.入侵。
含有3’端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA细丝；RecA-ssDNA细丝寻找相对的DNA双螺旋上的相应序列。
分子生物学第7章 DNA的重组与转座
7.2.1 λ phage DNA的整合与切除 1、实现机制：
均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组
2、特定位点-----附着位点（attachment site att）
◘ 整合过程需要λ整合酶 （integrase Int）（λ编码）
和寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用
◘ 整合后的附着位点为 attL（BOP’） attR（POB’）
溶菌周期 （lysis）
溶源性细菌 原噬菌体 (lysogen)
4、整合分子机制
5’
5’
b
3’
酶切
(8)
A
B
两臂旋转
b a
(9)
A
B
(3) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(4) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(5) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(6) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(7)
A
B 3’
5’
b
5’
b
3’
游离端移动联会
B 3’
(10)
A
5’
B
5’
b 3’ 游离端交叉连接
一、位点特异性重组（ site-specific recombination） 1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间 的重组
噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组
2、特征：
在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接---产生精确的DNA 重排 都具有整合作用的两个基本特征
第七章 DNA重组与转座
转座作用的遗传学效应
① 转座引起插入突变 ② 转座产生新的基因 ③ 转座产生的染色体畸变 ④ 转座引起的生物进化.
转座子的转位特征 P204
7.4 逆转录病毒和逆转录转座子
以RNA介导的转座与逆转录病毒有关，被转移 的因子称为逆转录转座子。
逆转录转座子是真核生物转座子的重要类型。
逆转录病毒与逆转录转座子的区别：
来源于宿主dna普遍性转导generalizedtransduction局限性转导restrictedtransduction完全转导外源性dna片段与受体菌的染色体整合并随染色体而传代称完全转导流产转导外源性dna片段游离在胞质中既不能与受体菌染色体整合也不能自身复制称为流产转导局限性转导或特异性转导所转导的只限于供体菌染色体上特定的基因
局限性转导或特异性转导， 所转导的只限于供体
菌染色体上特定的基因。如λ 噬菌体进入大肠埃希
菌。
4.细菌的细胞学机制
P193
7.2 位点专一性重组：导致DNA序列发生重排，不依赖于DNA 顺序的同源性，而依赖于能与某些酶相结合的特异DNA序列， 这些酶能催化DNA链的断裂和重接，引发位点专一性重组。
融合在一起，转录后形成一条即含病毒序列又含
C-onc的RNA，后者如含包装信号可被包装进
病毒颗粒中，形成含有一条融合RNA和一条正
常病毒RNA的二倍体病毒颗粒。 二者分子之间发生重组将会产生转化逆转录 病毒基因组。病毒携带V-onc，即具有转化能力。
逆转录病毒是具有感染能力的病毒颗粒，可以 在细胞之间转移。 逆转录转座子是宿主DNA基因组的组分，可以 在基因组内转座，但不能在细胞之间转移。
a）DNA转座子 DNA DNA 细菌转座子及插入序 列
分子生物学—同源重组、位点专一性重组、转座
分⼦⽣物学—同源重组、位点专⼀性重组、转座同源重组遗传交换、染⾊体上基因重排、断裂DNA的修复（1）同源重组的形式常发⽣在同源染⾊体之间（分⼦间重组）也可发⽣在同⼀DNA分⼦内（分⼦内重组）（2）Holliday 模型解释同源重组的⼀个经典模型基于重组过程中有⼗字形的中间产物（3）RecBCD重组途径存于E. coli中，需要RecBCD蛋⽩（RecBCD protein，recB、recC、recD基因的产物）参与DNA损伤造成的双链断裂以及外源DNA线性分⼦的DNA断端。
RecBCD是⼀种具多功能的酶，依赖于DNA的ATPase(⽔解ATP, 为DNA的解螺旋提供能量)；DNA helicase; DNA nuclease,可作⽤于单链或双链DNA, 切割χ位点（GCTGGTGG）χ(chi): crossover hotspot instigator RecBCD的切点与底物的序列有关，可在χ位点3’端4 ~ 6 ntRecA ：38 kD 的蛋⽩质，具多种功能，在重组中促进同源DNA单链的交换（主要是⼀单链与⼀双链中的同源单链交换）；交换过程需ATP。
RuvA和RuvB ：RuvA和RuvB均具DNA helicase活性，RuvB还有ATPase活性；RuvA特异性识别并结合到Holliday junction，并促使RuvB蛋⽩结合到这⼀位点；RuvB⽔解ATP，提供能量，促使分⽀迁移RuvC ：解开Holliday junction的核酸内切酶，特异地与Holliday junction结合，在特异位点切开Holliday junction。
RuvC是⼆聚体，有2个活性位点，能切开Holliday junction的两条链，切割位点有特异的序列，必须等branch migration 到达特异序列后，RuvC才能起作⽤，以何种⽅式解开Holliday junction取决于RuvC切割位点在两对同源单链上的频率。
遗传重组与转座(第3节至第4节)
通常包含转座所需的结构基因和 调节基因，两端具有反向重复序 列。
转座机制探讨
复制型转座
通过复制自身并插入到新的位置。
剪切型转座
通过剪切并重新插入到新的位置。
转座与重组
转座过程中可能伴随DNA重组，导致基因重排或 突变。
PART 05
遗传重组与生物进化关系
遗传多样性产生途径
基因突变
基因在复制或修复过程中发生错误，导致碱基替换、插入或缺失， 从而产生新的等位基因。
链交换的终止
链交换的终止通常发生在遇到与侵 入链配对的同源序列时，此时新合 成的DNA链将与模板链分离，完成 链交换过程。
重组产物解析
重组产物的类型
同源重组可以产生多种类型的重组产物，包括基因转换、基因内重组和基因间重组等。
重组产物的鉴定
重组产物的鉴定通常涉及到DNA序列分析、基因型鉴定和表型分析等方法。这些分析方 法可以帮助确定重组事件是否发生以及重组产物的具体类型。
在同源重组过程中，DNA的末端需要被适 当处理以便进行同源配对。这通常涉及到 DNA末端的切割、修饰和连接等步骤。
链交换与DNA合成
链交换的引发
在同源重组中，链交换的引发通 常涉及到RecA蛋白介导的DNA末
端侵入同源双链DNA的过程。
DNA合成与延伸
一旦链交换被引发，DNA聚合酶 将利用侵入链作为模板，合成新的 DNA链。同时，原有的DNA链将 被逐渐置换出来。
未来发展趋势预测
高精度长读长测序技术
随着测序技术的不断发展，未来有望实现更高精度、更长读长的测序，为遗传重组和转座的研究 提供更加准确和全面的数据。
多组学整合分析
将遗传重组和转座的研究与基因组学、转录组学、蛋白质组学等多组学数据进行整合分析，以更 深入地揭示其分子机制和生物学意义。
分子生物学：DNA重组与转座
整合宿主因子
同源区域attP（）与attB（宿主）的重组
噬菌体从宿主基因组切除
Int、切除酶（Xis，的xis基因编码） IHF
整合的逆过程
附着（整合）位点（att sites）
attP与attB只在它们的中间区域有一小段同源序列（15 bp，称为O）
attP的必需序列为235 bp（从–152到+82,以O的中点为0），而attB 必需序列约为25 bp（从–12到+12 ）
A
G
B
A
A
B
a
C
b
a
T
b
A
G
b
A
A
b
a
C
B
a
T
B
Holliday 模型中，由于重组而产生的异源双链区存在 不配对碱基，可被细胞内的修复系统能够识别并以一条链 为模板进行切除修复：
(1). 两个杂种分子均未得到校正，有丝分裂后分离形成4:4 或 3:1:1:3的异常孢子分离比，属于半染色单体转变；
TNA家族
具有如下特征： （1）长度较长，2.5-20 kb； （2）两侧含有较长的反向重复序列；目标区域产生正向重复 （3）内部含有一个或几个结构基因。常见的结构基因有：转座 酶基因—tnpA，解离酶基因—tnpR和抗生素抗性基因。 （4）转座完成以后可导致约5 bp长的靶位点序列加倍，从而在 转座子两侧产生直接重复序列。
5 • 基因转换(conversion)发生的机率,随突变位点离DNA 交叉
点的距离增大，而表现逐渐变小的极性梯度的效应
酵母Arg4（ 1989年，JackSzostak ） 7 multip—alleles (非全同等位基因)
Nsph I,Acc-I, R-V, Bel-I, Dra-III,Aha-II, Bgl-II 在杂合二倍体中，基因转换频率从5’ 3’极性递减
DNA的重组与转座
DNA的重组与转座第六章DNA的重组与转座1.简述DNA重组的概念与意义。
DNA重组：DNA分⼦内或分⼦间发⽣遗传信息的重新组合，称为遗传重组或基因重组。
重组产物称为重组体DNA。
DNA重组的意义：能迅速增加群体的遗传多样性2.细菌基因转移的机制有哪些？细菌的基因转移主要有四种机制：接合、转化、转导和细胞融合。
3.简述转座⼦的概念，转座⼦如何分类？什么是插⼊序列？转座⼦：是基因组中可以移动的⼀段DNA序列。
⼀个转座⼦由基因组的⼀个位置转移到另⼀个位置的过程称为转座或移位。
转座⼦的分类：①插⼊序列：只含有与转座有关的酶基因，不含有任何宿主基因（包括抗药性基因）②复合型转座⼦：是⼀类除了转座酶基因之外，还带有抗药性基因(或其他宿主基因)的标志，结构较⼤⽽且复杂。
插⼊序列：是最简单的转座⼦，只含有与转座有关的酶基因，不含有任何宿主基因（包括抗药性基因）。
4.复合转座⼦与IS因⼦有什么异同点？同：都含有有转座有关的酶基因异：IS因⼦结构简单，不含任何宿主基因；复合转座⼦结构较⼤⽽且复杂，含有抗药性基因或其他宿主基因的标志。
5.简述复制型转座与⾮复制型转座的机制。
复制型转座：在转座过程中，当形成靶位点与转座⼦连接的中间体后，转座⼦进⾏了复制，使原转座⼦位置与新的靶位点各存在⼀个转座⼦，因此转座过程伴随着转座⼦拷贝数的增加。
其过程涉及两种酶，⼀是转座酶，作⽤于原转座⼦的末端；另⼀中是解离酶，在转座过程中促使转座的中间产物接⼒，使转座⼦复制。
⾮复制型转座：①转座酶先识别转座⼦的IR，在两翼末端反向重复序列外沿切断；②宿主靶位点的双链交错切开，每侧9bp，交错形成单链；③转座⼦移动，靶位点的5’端与转座⼦的3’端连接，留下两个9bp的缺⼝；④缺⼝修复补齐。
6.转座⼦转座的特征有哪些？①转座不依赖RecA蛋⽩②转座后靶序列重复③转座⼦有插⼊选择性④区域性优先⑤转座具有排他性⑥转座有极性效应⑦活化邻近的沉默基因7.DNA转座引起了什么遗传学效应？①转座引起插⼊突变②转座产⽣新的基因③影响插⼊位置邻近基因的表达，使宿主表型改变④转座产⽣的染⾊体畸变⑤转座引起⽣物进化8.什么是逆转座⼦？逆转座⼦对基因组功能有哪些重要的影响？逆转座⼦：指通过RNA为中介，逆转录成DNA后进⾏转座的可移动元件。
分子生物学第七章DNA的重组与转座
IS插入缺口后
形成同向重复
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2、复合转座子：较大，由两个重复序列夹着中心区的编码其 他蛋白如抗药性基因组成，通常以Tn命名。复合转座子的重复 序列就是IS，可从一个位点转座到另一个位点，或从一个复制 子转座到另一个复制子。
（二）转座子的转座机制 转座子都是具有编码与转座作用有关的酶———转座酶，
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1、单链摄入和链交换 RecA蛋白作用于DNA分子，用单链去置换双链分子的同源
区段，这个反应称单链摄入。RecA蛋白的这种作用是通过与游 离的单链3`-端结合，并引导单链DNA侵入双链DNA中，这种作 用还需要RecBCD的协助。
E.coli中有一种Chi[Kai]结构： 5`-GCTGGTGG-3` 3`-CGACCACC-5`
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细菌的附着位点称attB，由 序列BOB`组成，噬菌体的附 着位点称attP，由序列POP` 组成，其中O序列为attB和 attP所共有，称为核心序列。 重组就发生在这段序列上。 在重组过程中λDNA以线性形 式插入细菌染色体，此时原 噬菌体被重组产生的两个新 的att（attL，attR）位点所 固定，整合过程在attB和 attP之间识别，而切除过程 在attL和attP之间识别。
切酶产生）。 2 、 链 转 换 （ strand displacement）：切口处形成 5`端局部解链，由细胞内类似 于大肠杆菌DNA Pol I的酶系 利 用 切 口 处 的 3`-OH 合 成 新 链 ， 而把原有链转换出来，使原有 链成为游离的5`-单链区段。
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3、单链侵入（single-strand invasion）由链置换产生的单 链区段侵入到参与联会的另一条DNA分子因局部解链而产生 的单链泡中。
DNA的重组与转座培训
DNA的重组与转座培训DNA的重组与转座培训DNA的重组与转座是生物学中一项重要的技术，用于改变生物体的基因组，以实现特定的目的。
在这篇文章中，我们将详细介绍DNA的重组与转座技术，并提供相关实验操作的培训。
1. DNA的重组DNA的重组是指将来自不同来源的DNA片段进行重新组合，形成新的DNA序列。
这种技术的应用非常广泛，可以用于产生具有特定功能的蛋白质、疫苗的研发以及疾病的基因治疗等领域。
实验操作：步骤1：准备工作- 准备试管、酶切体系、反应缓冲液和DNA片段等。
- 温度、时间和酶切酶的浓度都是影响DNA重组效率的重要因素，所以需要根据具体实验来确定。
步骤2：酶切反应- 将待重组的DNA片段用限制性内切酶切剪，产生可粘性末端。
- 确保酶切反应的温度和时间符合要求。
步骤3：连接反应- 将两个经酶切的DNA片段混合，在酶切缓冲液中加入连接酶。
- 反应温度和时间的选择与步骤2类似。
步骤4：DNA重组产物的分离与提取- 通过琼脂糖凝胶电泳分离连接反应产物，并使用Gel Extraction Kit提取感兴趣的目标DNA。
2. 转座转座是指某些特殊的DNA序列（转座子）具有自主移动性，可以在基因组内发生位置的改变。
这种现象在进化中起到重要作用，并且可以被利用于基因突变的研究和修饰。
实验操作：步骤1：获得转座子DNA- 转座子可以在细菌、真核生物或植物中找到。
根据实验需要，可以使用PCR扩增或基因组DNA提取方法获得转座子DNA。
步骤2：构建转座载体- 选择合适的载体，将转座子DNA连接到载体上，并转化到适当的宿主细胞中，以扩增转座子。
步骤3：转座实验操作- 将转座载体引入到目标细胞中。
- 通过选择合适的培养基和筛选条件，筛选出带有转座子的目标细胞。
3. 实验操作的注意事项- 实验室操作要根据具体的实验方案和操作手册进行，严格按照操作流程进行。
- 培养容器、试剂和仪器要经过严格消毒，在实验操作时保持无菌环境。