生物样品分析方法的基本要求
应用本法时要考虑所选有机溶剂的 特性、有机溶剂相和水相的体积及水相 的pH值等。 对所选用的有机溶剂，要求对被测 组分的溶解度大：沸点低，易于浓集、 挥散；与水不相混溶以及无毒、化学稳 定、不易乳化等。最常用的溶剂是乙醚 和氯仿等。 提取时所用的有机溶剂要适量。一 般有机相与水相（体液样品）容积比为1： 1或2:1。
缺点： 唾液是各腺体分泌的的混合液体，其 组成发生经时变动；因此，唾液中的药物 浓度与血浆中的游离型药物浓度相比就容 易变动； 唾液中药物浓度与血浆中药物浓度的 比值(S/P)只有少数药物是恒定值； 有些与蛋白结合率较高的药物，药物 在唾液中的浓度比血浆浓度低得多，需要 高灵敏度的分析方法才能检测； 对有些患者（如癫痛二昏迷）不能采 集唾液样品。
常用于填充柱的担体大致分为 两类： 1.亲水性的硅藻土，有机溶 剂冲洗药物 2.疏水活性炭、聚苯乙烯或 C18化学键合硅胶，吸附亲酯性 药物，然后用有机溶剂分离药 物。
3.被测组分的浓集的方法： 末次提取时加入的提取液尽量 少，然后直接测定。
氮气流吹干
减压法挥去溶剂
（四）化学衍生化 分离前将药物进行化学衍生化 的目的是：①使药物变成具有能被 分离的性质②提高检测的灵敏度③ 增强药物的稳定性；④提高对光学 异构体分离的能力等。 药物分子中含有活泼H者均可被 化学衍生化，如含一COOH、-OH、NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都 可被衍生化。
的尿液时，需用量筒准确地测量储
尿量，并做好记录。
缺点：尿液中药物浓度与血药浓度 相关性差；受试者的肾功能正常与否直 接影响药物排泄，因而肾功能不良者不 宜采集尿样；婴儿的排尿时间难于掌握； 尿液不易采集完全并不易保存。 采集的尿样应立即侧定。若收集24h 的尿液不能立即测定时，应加入防腐剂 置冰箱中保存。常用防腐剂有：甲苯等， 短时冷藏；长时冷冻。
常用的烷基化试剂：碘庚烷、 叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺 （TMAH）等； 常用的酰化试剂：乙酸酐、丙 酸酐等； 硅烷化试剂：三甲基氯硅烷 （咖CS）、双-三甲基硅烷乙酰胺 （BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰 胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑 （IMTS）等。
具有光学异构体药物的分离 也可采用不对称试剂，使其生成 非对映异构体衍生物，然后用GC 法或HPLC法进行分析测定。常用 的不对称试剂有：（S）-N-三氟 乙酰脯氨酰氯、（S）-N-五氟乙 酰脯氨酰氯等。
（二）缀合物的水解 尿中药物多数呈缀合状态。 含羟基、羧基、氨基和巯基的 药物。可与内源性物质葡萄糖醛酸 形成葡萄糖醛酸苷缀合物； 含酚羟基、芳胺及醇类药物与 内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。 由于缀合物较原型药物具有较 大的极性，不易被有机溶剂提取， 常用酸水解或酶水解的方法。
酸水解时，可加入适量的盐酸 液。
2. HPLC中化学衍生化法 衍生化的目的是为了提高药 物检测灵敏度。 化学衍生化包括柱前衍生化 和柱后衍生化两种方法。
柱前衍生化分析前尽可能将药物
进行精制后再衍生化。
柱后衍生化是药物经色谱柱分离
之后进行的，所以可形成对检测器具
有高灵敏度的衍生物，从而提高了选
择性。HPLC法常用的衍生化试剂有邻
（三）尿液 尿药测定主要用于药物剂量回收研 究、尿清除率、生物利用度的研究。 体内药物清除主要是通过尿液排出， 药物可以原型（母体药物）或代谢物及 其缀合物（conjugates）等形式排出。 尿液主要成分是水、含氮化合物 （其中大部分是尿素）及盐类。
尿液中药物浓度较高，收集量
可以很大，也方便，但尿液浓度通
全血也应加入抗凝剂混匀， 防止凝血。对大多数药物来说血 浆浓度与红细胞中的浓度成正比， 所以测定全血也不能提供更多的 数据。由于全血的净化较血浆和 血清麻烦，特别是溶血后，血色 素等可能会给测定带来影响。
3.特点： 血样的采取量受到限制、间隔时 间，采集方法：一般取1ml—2m1。用 注射器、毛细管或微量采血管采取。 血样的采血时间间隔应随测定目的的 不同而异。 采取血样后，应及时分离血浆或 血清，并立即进行分析。如不能立即 测定时，应完全密塞后保存，短期冷 藏（4℃），长期冷冻（-20℃）保存。
苯二醛、丹酰氯、荧胺等。
三、生物样品定量分析方法验证
（一）特异性 证明所测定的物质是原形药物或 特定的活性代谢物 （二）标准曲线与线性范围 回归方程相关系数r≥0.9900。在线 性范围内浓度测定结果应达到试验要求 的精密度和准确度。
（三）精密度与准确度
药典附录《药物制剂人体生物利
用度和生物等效性试验指导原则》规
2.液-固提取法（liquid-solid extraction，LSE）也为一种柱色谱法。 将具有吸附、分配及离子交换性质的、 表面积大的担体作为萃取剂填入小柱， 以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使 其药物或杂质保留在担体上，用适当 溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药物 洗脱下来。
LSE具有优点：LSE较少引入杂 质；消除了LLE的主要缺陷—乳化 现象；提取效率高，可用少量生物 样品进行分析；柱为可弃型，废弃 物易从实验室移走；在最后洗脱中 多数采用以水为主的溶剂系统，大 大增加了安全性；最大的优点为处 理样品速度快，并在室温下操作， 尤其适于处理挥发性及对热不稳定 的药物。
常变化较大，应测定一定时间内排 入尿中药物的总量，这就需要测定 在规定时间内的尿液体积及尿药浓 度，时间尿以外的尿不可能推断全
尿中药物的排泄浓度和药物总量。
测定尿中药物的总量时，将一
定时间内（如8h;12h或24h等）排
泄的尿液全部储存起来，并记录其
体积，取其一部分测定药物浓度， 然后乘以尿量求得排泄总量。采集
1.GC中化学衍生化法 药物的化学衍生化前处理对GC 十分必要，衍生化可使药物分子中 的极性基团，如羟基、氨基、羧基 等变成无极性的、易于挥发的药物， 从而使GC温度不必很高即可适合GC 分析要求，主要的衍生化反应有烷 基化（alkylations）、酰化 （acylations）、硅烷化 （silylations）等。其中以硅烷化 用得最广泛。
4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时，金属 阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的 羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的 沉淀剂有：CUS04-Na2W04 ,ZnS04NaOH等。含药物血清与沉淀剂的比 例为1:2混合，高速离心、分离后 得上清液。
5.酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结 合牢的药物时，常需用酶解法。最 常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌 溶素。
质及药理性质、存在形式、浓度范围
等，采取相应的前处理方法。 87页图4-4大致反映了检测方法与
样品前处理要求的相互关系。
（一）去除蛋白质 目的： 可使结合型的药物释放出来， 以便测定药物的总浓度； 去除蛋白质也可预防提取过程 中蛋白质发泡，减少乳化的形成， 以及可以保护仪器性能，延长使用 期限。
去除蛋白质方法：
1.取样： 供测定的血样应能代表整个血药 浓度，因而应待药物在血液中分布 均匀后取样。 动物实验时，可直接从动脉或 心脏取血。 对于病人，通常采取静脉血， 有时根据血药浓度和分析方法灵敏
度。也可用毛细管采血。
2.制备： 血浆的制备 将采取的血液置 含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等） 的试管中，混合后，离心，分离血 细胞，上清液即为血浆。
生物样品一般多在碱性下提取，
多数药物是亲脂性的碱性物质，生
物样品中的内源性物质多是酸性的。
当碱性药物在碱性pH不稳定时，
则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提
取。
提取时于水相（体液样品）中加入 有机溶剂后，一般只提取一次。如有必 要还须将第一次提取分离出的含药物有 机相再用一定pH的水溶液反提取（back extraction），然后再从水相将药物提 取到有机相。 液-液提取法的优点在于它的选择性， 这是依赖于有机溶剂的选择。极性大的 药物使用离子对试剂（ion pair reagent）的离子对提取法（ion pair extraction method）。
二
生物样品分析其前处理技术 主要应考虑生物样品的种类，被测 定药物的性质和测定方法三个方面的问 题。 样品的分离、纯化技术应该依据生 物样品的类型。例如，血浆或血清需除 蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾 液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白； 尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀 合物中释出。
根据被测定药物的结构、理化性
1.加入与水相混溶的有机溶剂 加 入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分 子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白 质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出 来。常用的水溶性有机溶剂有：乙睛、 甲醇等。含药物的血浆或血清与水溶性 有机溶剂的体积比为1:（1-3)时，就可 以将90%以上的蛋白质除去，采用超速离 心机（10000r/min )离心便可将析出的 蛋白质完全沉淀。
2.加入中性盐
使溶液的离子
强度发生变化。中性盐能将与蛋白
质水合的水置换出来，从而使蛋白
质脱水而沉淀。
常用的中性盐：饱和硫酸胺等。
盐析的方法与有机溶剂提取法常并
用，药物的回收率高。
3.加入强酸 当pH低于蛋白质 的等电点时，蛋白质以阳离子形式 存在，加入强酸，可与蛋白质阳离 子形成不溶性盐而沉淀。常用的强 酸有：10%三氯醋酸等。含药物血 清与强酸的比例为1:0.6混合，高 速离心,就可除去蛋白质，取上清 液作为样品。在酸性下分解的药物 不宜用本法除蛋白。
Байду номын сангаас
对于遇酸及受热不稳定的药物，
可以用酶水解法。常用葡萄糖醛酸
苷酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸苷酶
一硫酸酯酶的混合酶。
（三）分离、纯化与浓集 1.液～液提取法（liquidliquid extraction; LLE)多数药物 是亲脂性的，在适当的有机溶剂中 的溶解度大于在水相中的溶解度， 而血样或尿样中含有的大多数内源 性杂质是强极性的水溶性物质。因 而用有机溶剂提取一次即可除去大 部分杂质。
生物样品验证指标和分析方法学考核
第四节生物样品测定方法的验证指标和分析方法的考核任何一种分析测定方法，根据其使用的对象和要求，都应有相应的效能指标。
一般而言，常用的分析效能评价指标包括：精密度、准确度、检测限、定量限、选择性、线性范围、重现性、耐用性等。
生物样品中药物分析方法评价的标准与上述评价指标之间，既有共同点也有其独特之处，测定方法的效能指标可以作为对分析测定方法的评价尺度，也可以作为建立新的测定方法的实验研究依据。
与其他分析方法相比，体内药物分析方法的可行性和可靠性，需要应用若干标准来进行方法学的考察与评价。
在实际工作中评价一个体内药物分析方法的优劣，一般常用精密度、准确度、灵敏度、专属性或选择性及可测浓度范围等指标进行考察。
一、生物样品测定方法的验证指标(一)准确度准确度(accuracy)是指测得结果与真实值接近的程度，表示分析方法测量的正确性，是考察和评价分析方法的最基本要点之一。
由于不可能绝对地确知样品的“真值”，因而常用回收率数值反映测定的准确程度。
也可通过与其他已建立的分析方法进行比较等手段来反映准确度。
回收率是指将已知量的药物纯品加到空白生物基质(如空白血浆、血清)中，经过一系列的前处理、测定，计算所测得的药物量与加入量的比值，以百分率表示。
一般回收率数值越接近100％，准确程度越好。
生物药物分析中，常用标准添加法来计算回收率，即取已准确测定药物含量P(present)的真实样品(如人血浆样品等)，再加入药物标准晶已知量A．(added)，将该混合物作为测定液，其测定值为M(measured)。
测定液要配制成高、中、低三种浓度，每个浓度测定3-5次，求出每种浓度的平均测定值M，且RSD应符合要求。
由于预先要准确测定样品中原含有的药物量P，因此也应测定3-5次，求其平均值P，且RSD也应符合要求。
按上式计算出的回收率，其结果越接近100％表明分析方法准确度越高。
生物样品分析时，一般应将回收率范围控制在85％-115％(样品药浓≥2m心L)及80％-120％(样品药浓<200t~,／L)o但因生物样品组分复杂，药物含量低，前处理步骤多很难达到较高的回收率。
9012生物样品定量分析方法验证指导原则
中国药典2015年版9012生物样品定置分析方法验证指导原则一、范围准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。
这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。
因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。
本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法。
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。
应该在相应的生物样品分析中遵守G L P原则或GC P原则。
二、生物分析方法验证(一）分析方法的完整验证分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。
此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。
一般应对每个新分析方法和新分析物进行完整验证。
当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。
一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。
有时可能需要测定多个分析物。
这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。
在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。
对照标准物质在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加人到空白生物基质中。
此外，色谱方法通常使用适当的内标。
应该从可追溯的来源获得对照标准物质。
应该科学论证对照标准物质的适用性。
分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。
对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质不产生干扰。
当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标。
土壤微生物群落在生态系统中的样品分析与测定
土壤微生物群落在生态系统中的样品分析与测定土壤是生态系统中非常重要的组成部分，同时也是最为丰富复杂的环境之一。
土壤环境中存在着大量的微生物，这些微生物与土壤之间相互作用，对土壤的物质转化、有机质分解和植物生长等方面具有重要的作用。
如何准确地了解土壤微生物群落的数量和多样性，对于揭示土壤生物学的功能和作用，以及发展生态农业，提高土壤质量和农产品产量等都具有重要意义。
一、土壤微生物群落的样品分析方法为了测定土壤微生物群落，必须进行样品的分析和测定。
在对土壤进行样品分析时，需要注意：1.土壤样品的收集在进行样品分析之前，必须进行土壤样品的收集。
土壤样品应该收集大约20-30厘米深度的土壤。
由于土壤菌群、真菌群和放线菌群在不同土层中的数量和种类也不相同，因此，收集的土壤深度需要根据研究的目的而定。
2.土壤样品的处理一般来说，土壤样品要进行粗碎，去杂质、去石头等处理。
此外，还需去除土壤中的植物残渣、动物排泄物等有机物。
在进行处理时，应该注意不破坏土壤结构和微生物活性。
3.土壤样品的储存土壤样品储存的温度和湿度等条件应根据微生物的生长需求而定。
如果储存时间长，应该对样品进行冷冻或低温干燥处理，以防止微生物的生长。
二、土壤微生物群落测定的方法以下是常用的样品测定方法：1.培养计数法该方法是通过使用培养基和适宜环境条件来促进微生物产生可见的生长。
然后通过计数方法确定细菌的数量。
虽然该方法能够对所有培养细菌进行计数，但是只适用于对可培养细菌群的测定，并且样品测定时间较长。
2.生物分子测定法该方法使用了PCR（多聚酶链式反应）等方法，通过分析土壤中微生物的核酸以及基因来测定微生物数量和多样性。
该方法可以对所有微生物进行分析，但精确度受到PCR扩增的准确度和反应的复杂性影响。
3.牢固偏最小二乘回归分析法（PLS-DA）该方法是通过采集土壤样品，并进行数据处理、筛选，最终运用牢固偏最小二乘回归分析法（PLS-DA）来测定微生物数量和多样性。
定量分析样品的前处理
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注意事项
①充氧气要充分 使样品燃烧完全,一般急速通氧气1~2分钟,燃烧
完全时没有黑色炭化物。 ②吸收完全 一般振摇30’,燃烧瓶看不到烟雾。
Cl－、F－白色烟雾 Br－棕色 I－紫色 ③防爆 样品燃烧时,温度很高,燃烧瓶内压力很大,有爆 炸的可能性,必须采取防护措施。
②百. 分吸收系数（ E11%cm ）：指在一定波长下,溶 液浓度为1%（W/V），厚度为1㎝的吸收度。
③ε与E关系
ε=
M
10
× E11%cm
强吸收度：ε=104~105
弱吸收度：ε<102
中强吸收：ε=102~104
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3.仪器的校正和检定 波长的校正：汞灯中的几根较强的谱线或用仪器自身
所带的氘灯的特定谱线为参照进行校正 吸收度准确性的检定：重铬酸钾的硫酸溶液，规定波
烧瓶中进行燃烧,并将燃烧所产生的欲测物质（气态） 吸收于适当吸收液中,然后根据欲测物质的性质,采 用适当分析方法进行鉴别、检查或含量测定。
含 X 、 S 、 P 、 S 有 e 机 O 2 、 燃 无 药 烧 机 物 吸 收 吸 离 液 测 收 子
15
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吸收液的选择 ①氟化物、氯化物
R X O 2 /P X t C 2 O H 2 O
氟或氯以离子状态存在,吸收后可直接测定.
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②溴化物
R B r O 2 /P tB 2 rB rC2O H 2 O
量大 量少
③碘化物
R I O 2 /P tI2I I3 O C2 O H 2 O
微生物样品的取样方法及取样要求
微生物样品的取样方法及取样要求样品取样的要求1）在取样之前应确认货、证是否相符。
2）取样过程中应避免与水等环境的不良因素影响，防止样品被污染。
3）取样用具（如注射器、采血管、试管、探子、铲子、匙、取样器、剪子、样品袋等）必须是经过灭菌的。
4）对采集的样品一般要求随机取样。
若怀疑最有可能受病原体污染或者带有病原体的样品，可以进行选择取样。
5）根据样品种类（如盒装、袋装、瓶装和罐装），应取完整密封的样品。
如果样品很大，则需用无菌取样器取样；若样品是粉末，应边取边混合；若样品是液体的，通过振摇即可混匀；若样品是冷冻的，应保持冷冻状态（可放在冰内、冰箱的冷盒内或低温冰箱内保存），而非冷冻动物产品须保持在0℃~5℃中保存。
6）取样前或取样后应在盛装样品的容器或样品袋上立即贴上标签，每件样品必须标记清除（包括品名、来源、数量、取样地点、取样人及取样日期）。
7）获取有关取样产品的信息：如样品名称、批量大小、包装类型、包装容器体积、生产线、产品编号或控制号、批量号、标签内容、包装破损状况、产品存放地点或建筑物的基本情况等。
8）当客户对所规定的取样程序有偏离、添加或删节的要求时，应详细记录这些要求和相关的取样资料，并记入包含检测结果的所有文件中，同时告知相关人员。
9）当取样作为检测一部分时，实验室应有程序记录与取样有关的资料和操作。
这些纪录应包括所用的取样程序、取样人的识别、环境条件（如果相关）、必要时有抽样地点的图示或其他等效方法，如果合适，还应包括取样程序所依据的统计方法。
食品微生物学的取样点食品微生物的取样计划中常包括以下取样点：原料、生产线（半成品、环境）、成品、库存样品、零售商店、或批发市场、进口或出口口岸。
原料的取样包括食品生产所用的原始材料、添加剂、辅助材料及生产用水等。
生产线样品是指食品生产过程中不同加工环节所取的样品，包括半成品、加工台面、与被加工食品接触的仪器面以及操作器具等。
对生产线样品的采集能够确定细菌污染的来源，可用于食品加工企业对产品加工过程卫生状况的了解和控制，同时能够用于特定产品生产环节关键控制点的确定和HACCP的验证工作。
生物样品分析方法
生物样品分析方法生物样品分析是一项重要的实验技术，用于研究生物体内的成分、结构和功能。
为了获得准确的结果，需要采取适当的样品处理方法和分析技术。
以下将介绍几种常见的生物样品分析方法。
首先是DNA/RNA提取与分析。
DNA/RNA是生物体内遗传信息的载体，其提取与分析可用于研究基因的表达、变异和调控等。
DNA/RNA提取方法一般包括细胞溶解、裂解、蛋白酶处理、有机溶剂萃取和纯化等步骤。
分析方法主要包括凝胶电泳、PCR、RT-PCR和测序等。
其次是蛋白质提取与分析。
蛋白质是生物体内执行生物学功能的重要分子，其提取与分析可用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用。
常用的蛋白质提取方法包括细胞裂解、亲和层析、电泳分离和质谱分析等。
分析方法包括SDS-PAGE、Western blot、质谱分析和免疫共沉淀等。
另外是细胞及其器官提取与分析。
细胞是生物体的基本功能单位，其提取与分析可用于研究细胞结构、代谢和信号转导等。
细胞提取方法包括胰酶消化、细胞裂解和亚细胞分离等。
常用的细胞分析方法有细胞计数、流式细胞术、显微镜观察和细胞共培养等。
器官提取方法则与具体器官的特性相关，例如心脏、肝脏和肾脏等。
此外，还有组织提取与分析。
组织是生物体内多个细胞的集合体，其提取与分析可用于研究组织的结构、功能和病理过程等。
组织提取方法包括机械破碎、体外培养和酶消化等。
常用的组织分析方法有组织切片、组织染色、免疫组织化学和组织内分子分析等。
最后是体液样品提取与分析。
体液样品如血液、尿液和脑脊液等含有丰富的生物分子，其提取与分析可用于研究疾病的发病机制和诊断标志物等。
体液样品提取方法一般包括离心、沉淀和过滤等步骤。
常用的体液分析方法有生化分析、免疫分析、代谢分析和分子诊断等。
总之，生物样品分析方法在生命科学研究和临床诊断中起着重要作用。
通过采用适当的提取与分析技术，可以获得关于DNA、RNA、蛋白质、细胞、组织和体液样品的详细信息，从而推动生物医学研究和疾病治疗的进展。
生物样品的处理方法
生 物 样 品 的 处 理 方 法
（3）分离纯化与富集
①液-液萃取法
水相pH值是萃取成功的关键 水相最佳pH值
碱性药物：高于pKa值12个pH单位
酸性药物：低于pKa值12个pH单位
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
但生物样品宜在碱性或近中性提取 ——生物基质中内源性物质多为酸性， 在碱性下不易萃取
②液-固提取法（固相萃取法）
原理： 将不同填料作为固定相装入微型小柱， 当含有药物的生物样品溶液通过时，由 于受到吸附、分配、离子交换或其它亲 和力作用，药物或杂质被保留在固定相 上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶 剂洗脱药物。
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
(4)化学衍生化
化学衍生化目的 ①使药物变成具有能被分离的特性 ②提高对样品的检则灵敏度 ③增加药物的稳定性 ④提高对光学异构体的分离能力
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
生 物 样 品 的 处 理 方 法
（5）有机破坏
方法：湿法破坏
干法破坏
氧瓶燃烧法
第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理
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第五章 药物定量分析与分析方法验证
1. 测定法
取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法 操作，用标准曲线计算 在标准曲线范围内制备质控(quality control，QC)样品 ——高(接近上限)、中、低(接近LOQ) 3个浓度
——每一浓度至少5个样本
——与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析 测定1次
实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.5～2ml)
生物样本分析方法的建立和确证
四川大学华西第二医院国家药品临床试验机构Ⅰ期临床研究室实验室四川大学华西药学院临床药学教研室生物样本分析方法的建立和确证、未知样品测定及其质量控制技术指导原则第一版（仅供内部参考）制定： 复核： 签发：二○○五年十二月目 录1. 常用分析方法(Common Technique) (3)2. 方法建立前的准备(Pre-methods Preparation) (3)2.1. 文献资料的查阅与接收(Literature Preparation) (3)2.2. 试验用参比纯品的准备(Reference Standard Preparation) (4)2.3. 仪器、试剂的准备(Apparatus and Regents Preparation) (4)2.4. 工作量及试验人员的准备(Workload and Personnel Preparation) (4)2.5. 课题经费预算(Outlay budget) (5)3. 方法确证的分类(Classification of Validation) (5)3.1. 完整确证(Full Validation) (5)3.2. 部分确证(Partial Validation) (5)3.3. 交叉确证(Cross Validation) (6)4. 分析方法的建立与确证（Method Development and Validation） (6)4.1. 特异性(Specificity) (6)4.2. 准确度、精密度与回收率(Accuracy, Precision and Recovery) (7)4.3. 标准曲线（Calibration / Standard Curve） (7)4.3.1. 最低定量限(Lower Limit of Quantification (LLOQ)) (8)4.3.2. 标准曲线样品浓度与响应值之间的关系(Calibration Curve/StandardCurve/Concentration-Response) (8)4.4. 稳定性(Stability) (8)4.4.1. 冻融稳定性(Freeze and Thaw Stability) (9)4.4.2. 室温条件下稳定性(Short-Term Temperature Stability) (9)4.4.3. 长期稳定性(Long-Term Stability) (9)4.4.4. 储备液稳定性(Stock Solution Stability) (9)4.4.5. 处理后样品的稳定性(Post-Preparative Stability) (9)4.5. 相关注意事项(Specific Recommendations) (10)5. 生物样品分析测定质量控制(Quality Control) (11)5.1. 分析批(Analytical Batch/Run) (11)5.2. 随行标准曲线(Calibration Curve/Standard Curve) (11)5.3. 质控样品(Quality Control Sample) (11)5.4. 异常值、溢出值的判定与样品重测(Verdiction of Abnormity/Overflow andRepeat Analysis) (12)5.5. 相关注意事项(Specific Recommendations) (12)6. 记录与报告(Documentation) (13)6.1. 总结报告(Summary Infomation) (13)6.2. 方法的建立与确证记录(Method Development and Validation) (14)6.3. 未知样品的分析与质控记录(Application to Routine Drug Analysis) (14)6.4. 其它内容(Other Infomation) (15)7. 参考文献(Reference) (15)生物样品一般来自全血、血清、血浆、尿液或其他组织，具有取样量少、药物浓度低、干扰物质多以及个体的差异大等特点，因此必须根据待测物的结构、生物介质的特点和预期的浓度范围，建立适宜的生物样品定量分析方法，并对方法进行确证，并在测定过程中加强质量管理，方可保证研究工作的质量。
生物制药技术中的生物样品处理与分析方法
生物制药技术中的生物样品处理与分析方法生物制药技术在医药领域的应用日益广泛，其关键环节之一是生物样品的处理与分析。
生物样品处理与分析方法的选择和优化对于保证生物制药产品的质量和效力至关重要。
本文将介绍生物制药技术中常用的生物样品处理与分析方法，包括样品采集、样品前处理、样品分析等，以及其所涉及的原理和应用。
一、样品采集在生物制药技术中，样品采集是第一步，直接影响后续的样品处理与分析结果。
常见的生物样品包括血液、尿液、组织等。
对于血液样品，最常用的采集方法是采用针头抽血，然后将血液转移到适当的采样管中。
对于尿液样品，通常采用尿杯收集新鲜尿液，然后进行必要的保存和处理。
对于组织样品，常用的方法是通过手术或穿刺获取组织样本，并将其保存在适当的容器中。
二、样品前处理生物样品经过采集后，需要进行前处理来去除干扰物和提取目标分析物。
常见的前处理方法包括离心、过滤、沉淀等。
离心是通过旋转离心机使样品分离成上清液和沉淀物，用于去除离心后产生的沉淀物。
过滤是通过使用合适孔径的过滤器去除样品中的固体颗粒和杂质，例如细胞碎块和蛋白质等。
沉淀是通过加入特定试剂使样品中的目标分析物凝聚成沉淀物，然后通过离心或过滤的方式将其分离出来。
这些前处理方法能够有效地去除样品中的干扰物，提高后续分析的准确性和灵敏度。
三、样品分析生物制药技术中的样品分析是通过对样品中的目标分析物进行定量或定性分析，来评估生物制药产品的质量和效力。
常见的样品分析方法包括免疫学分析、核酸分析、代谢物分析等。
1. 免疫学分析免疫学分析是通过检测样品中的特定抗原或抗体来定量或定性样品中的分析物。
免疫学分析常见的方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光分析、免疫电泳等。
通过这些方法，可以检测生物制药产品中的特定蛋白质、抗体等成分，评估产品的纯度和含量。
2. 核酸分析核酸分析是通过检测样品中的DNA或RNA来定量或定性样品中的分析物。
常见的核酸分析方法包括聚合酶链反应（PCR）、核酸杂交、基因测序等。
【精品】生物样品分析前处理技术
生物样品分析前处理技术生物样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题.样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。
例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出,当原型药物排泄在尿中时，可简单地用水稀释一定倍数后进行测定.根据被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围等,采取相应的前处理方法。
例如，药物的酸碱性（pka)、溶解性质涉及到药物的提取手段；是否具有挥发性涉及到能否采用气相色谱法测定；药物的光谱特性及官能团性质涉及到分析仪器的选择、能否制成衍生物及应用特殊检测器的可能性。
药物在样品中的浓度相差很大，浓度大的样品，对前处理要求可稍低；浓度越低则样品前处理要求越高。
此外，药物在体内常产生许多代谢产物，其中一些代谢物仍具有药理活性，需要与原型药分别测定,因而也要了解药物的药理学性质和药物动力学特性.样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同。
即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关.一般说来,放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性，因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品；而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法,分离要求就要相应高一些；至于常用的高效液相色谱法，为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上,上柱前需对生物样品进行去蛋白,有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理。
下图大致反映了检测方法与样品前处理要求的相三关系。
样品处理步骤与分析方法的选择—（一）去除蛋白质在测定血样时，首先应去除蛋白质.去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成,以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污)，延长使用期限.去除蛋白法有以下几种.1.加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂;可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。