琥珀酸对原代心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用

琥珀酸对原代心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用本研究采用SD大鼠乳鼠心肌细胞原代培养，复制心肌细胞缺氧复氧损伤模型，考察琥珀酸对心肌细胞缺氧复氧损伤的LDH漏出率的影响，并进一步采用流式细胞术及Western blot考察琥珀酸对心肌细胞凋亡，cleaved caspase-3及p-Akt的影响，探讨琥珀酸对新生大鼠原代心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用。

研究结果发现：①琥珀酸31、25～500 mg·L-1对原代心肌细胞活力无明显影响，琥珀酸400，200，100，50 mg·L-1均可显著降低心肌细胞缺氧复氧损伤LDH漏出率（P＜0、01或P＜0、05）；②琥珀酸400，200 mg·L-1可显著降低缺氧复氧损伤所致的心肌细胞凋亡百分数（P＜0、05），抑制心肌细胞缺氧复氧所致的cleaved caspase-3 蛋白表达增加（P＜0、05）；③琥珀酸400 mg·L-1可显著增加心肌细胞的p-Akt蛋白表达（P＜0、05），而琥珀酸200 mg·L-1对p-Akt蛋白表达无明显影响。

因此，本研究认为琥珀酸可通过激活Akt的磷酸化而抑制心肌细胞缺氧复氧所致的坏死和凋亡。

标签：琥珀酸；心肌细胞；缺氧复氧；坏死；凋亡1 材料1、1 动物SD大鼠乳鼠，SPF级，出生1～2 d，雌、雄不限，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2012-0001。

1、2 药物琥珀酸购自中国食品药品检定研究院（批号110896-200001）。

盐酸地尔硫卓购自Sigma公司（批号D2521）。

1、3 试剂DMEM高糖培养基（12100-046，GIBCO）；优级胎牛血清（TBD21HY，天津市瀚洋生物制品科技有限责任公司）；II型胶原酶（17101-015，GIBCO）；胰酶（0458，GIBCO）；5-溴-2′-脱氧鸟苷（B-5002，Sigma）；LDH 试剂盒（110391，中生北控生物科技股份有限公司）；MTT（298-93-1，Amresco）；DMSO（D-5879，Sigma）；FITC-annexin V/propidium iodide凋亡检测试剂盒（556547，BD Biosciences）；cleaved-caspase 3 抗体（C8487，Sigma）；p-Akt （Ser473，4060，Cell Signaling ），Akt （9272，Cell Signaling）；彩色预染蛋白质分子量标准（P0068，碧云天生物技术研究所）；RIPA裂解缓冲液（P0013C，碧云天生物技术研究所）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（P0012，碧云天生物技术研究所）。

1、4 仪器CO2培养箱（Sanyo MCO175）；倒置显微镜（Olympus Sh1）；酶标仪（BioTek SYNERGYTM 4）；半自动生化仪（Screen Master 3000+）；流式细胞仪（Epics Elite，Beckman Coulter）；垂直电泳仪（Bio-Rad）；Chem Doc XRS+凝胶成像仪（Bio-Rad）。

2 方法2、1 新生大鼠原代心肌细胞培养方法参考文献进行心肌细胞原代培养[5-7]。

无菌条件下取乳鼠心脏，PBS洗心脏，剪碎心室组织，采用含0、062 5 g·L-1胰酶和0、05 g·L-1II型胶原酶的混合消化液进行消化，细胞悬液过200目筛，2 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，用含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬细胞，37 ℃，5% CO2差速贴壁1 h。

收集未贴壁细胞，以6×105 个/mL分别接种于96孔板（100 μL/孔，用于细胞活力检测）和直径35 mm培养皿（2 mL/皿，用于LDH释放，流式及蛋白表达）。

24 h换液，取培养72 h同步搏动的细胞进行实验。

2、2 琥珀酸对原代心肌细胞活力的影响琥珀酸采用DMSO溶解，实验分为正常组，0、5% DMSO组，琥珀酸500，250，125，62、5，31、25 mg·L-1组。

药物作用24 h后，弃上清液，PBS洗细胞3次，96孔板每孔加入PBS配制的1 g·L-1 MTT溶液（100 μL/孔）。

培养箱内孵育4 h后，弃去MTT液，加入DMSO（100 μL/孔），酶标仪570 nm检测吸光度A。

按照公式计算细胞增殖抑制率（IC）。

IC=（A0、5% DMSO组-A加药组）/A0、5% DMSO组×100%2、3 心肌细胞缺氧复氧损伤模型及体外加药参考文献复制心肌细胞缺氧复氧损伤模型[5-7]，具体如下：①缺氧：取出35 mm培养皿，弃去培养液，无糖台氏液洗细胞3次，每孔加入预先以95%N2-5%CO2混合气饱和15 min的无糖台氏液2 mL。

将培养皿敞盖放入自制缺氧盒中，通入95%N2-5%CO2混合气（流速1 L·min-1），通气15 min后，夹闭进气管和出气管并将缺氧盒置于细胞培养箱内3 h进行缺氧。

②复氧：打开缺氧盒，取出培养皿，吸出缺氧液，每皿加入2 mL含2、5%胎牛血清的DMEM液，置培养箱内继续培养2 h（用于LDH检测）或6 h（用于流式，cleaved caspase-3，Akt及p-Akt蛋白表达）。

药物以DMSO溶解，按照1∶1 000的比例加入培养上清液，分别在缺氧开始和复氧开始时各加药1次。

正常组细胞给予含相应DMSO及糖的台氏液，培养3 h后，更换含2、5%胎牛血清的DMEM培养液继续培养2 h或6 h。

2、4 LDH释放实验分成正常组、模型组、阳性药地尔硫卓45 mg·L-1组、琥珀酸400，200，100，50 mg·L-1组。

复氧结束后，取出各组细胞复氧液，每皿加入2 mL超纯水，-70 ℃低温冰箱冻融1次裂解细胞，取各组细胞裂解液。

采用酶反应动力监测法测定各组缺氧液、复氧液、裂解液的LDH含量，按下列公式计算LDH漏出率。

LDH漏出率=（缺氧末上清LDH含量+复氧末上清LDH含量）/（缺氧末上清LDH含量+复氧末上清LDH含量+裂解液中LDH含量）×100%2、5 流式检测实验分成正常组、模型组、琥珀酸400，200 mg·L-1组。

细胞复氧结束后，PBS洗细胞2遍，加入0、25%胰酶（500 μL/皿）消化8 min，加入500 μL心肌细胞培养液终止消化，收集细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入1×binding buffer 400 μL重悬细胞至1×106 个/mL，取200 μL细胞溶液（约1×105个细胞）至5 mL EP管，并分别加入5 μL FITC-Annexin V及5 μL PI，混匀，常温避光15 min，上机分析。

2、6 cleaved caspase-3，Akt，p-Akt蛋白表达实验分成正常组、模型组、琥珀酸400，200 mg·L-1组。

细胞复氧6 h后，弃培养液，PBS洗2遍，加入RIPA （临用前加入PMSF及磷酸酶抑制剂）裂解液60 μL，冰上裂解30 min，收集细胞，12 000×g，4 ℃离心5 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，95 ℃沸水进行蛋白变性，样品-80 ℃保存。

20 μg蛋白上样，采用5%浓缩胶和12%分离胶进行恒压电泳（浓缩胶：50 V；分离胶：100 V），100 V 恒压转移75 min（cleaved caspase-3）或95 min（Akt和p-Akt），5% BSA封闭1 h，rabbit anti-cleaved caspase-3（1∶500），rabbit anti-Akt （1∶1 000）and rabbit anti-p-Akt（1∶2 000），mouse anti-α-actin（1∶2 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜9 min×6次，5% BSA封闭30 min，抗兔二抗（1∶4万，针对目的蛋白）或抗小鼠二抗（1∶4万，针对α-actin）室温孵育30 min，TBST洗膜9 min×6次，进行化学发光显影及Image Lab软件分析。

2、7 统计方法采用SPSS 18、0统计软件单因素方差分析（ANOV A）进行统计，数据以±s表示，组间差异采用Student-Newman-Keuls （SNK）进行比较，P＜0、05为有统计学意义。

3 结果3、1 琥珀酸对心肌细胞活力的影响与正常组相比较，0、5%DMSO对原代心肌细胞活力没有影响。

与0、5%DMSO对照组相比，琥珀酸31、25～500 mg·L-1对原代心肌细胞活力不产生影响，见表1。

3、2 琥珀酸抑制原代心肌细胞缺氧复氧损伤LDH漏出与正常组相比，心肌细胞缺氧复氧损伤后LDH漏出率显著增加（P＜0、01）。

与模型组相比，阳性药地尔硫卓45 mg·L-1可以显著降低心肌细胞缺氧复氧损伤后LDH漏出率（P ＜0、01），琥珀酸400，200，100，50 mg·L-1均可以显著降低心肌细胞缺氧复氧损伤所致的LDH漏出（P＜0、01或P＜0、05），见表2。

3、3 琥珀酸降低缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡与正常组相比较，缺氧3 h 复氧6 h后心肌细胞凋亡百分数显著增加（P＜0、01）。

与模型组相比较，琥珀酸400，200 mg·L-1均可显著降低心肌细胞凋亡百分数（P＜0、05或P＜0、01），见表3。

表3 琥珀酸对心肌细胞缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响（±s，n=3）Table 3 Effect of succinic acid on hypoxia/reoxygenation-induced cardiomyocytes apoptosis （±s，n=3）组别剂量/mg·L-1凋亡百分数正常-10、57±3、44模型-19、60±1、951）琥珀酸40014、67±2、352）20013、37±3、163）3、4 琥珀酸抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞cleaved caspase-3蛋白表达与正常组相比较，心肌细胞缺氧复氧损伤后cleaved caspase-3 蛋白表达显著增加（P＜0、05）。

琥珀酸400，200 mg·L-1均可显著抑制心肌细胞缺氧复氧所致的cleaved caspase-3蛋白表达增加，与模型组比较，有显著性差异（P＜0、05），见图1。