病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)
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病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。? 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、-80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1和E3缺失)的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA的腺病毒载体 2）采用PacI消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较 慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较 病毒表达系统 慢病毒表达系统（Lentivirus） 腺病毒表达系统（Adenovirus） 病毒基因组 RNA病毒 双链DNA病毒 复制 自主复制 自主复制 是否整合 病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因 病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因 感染细胞类型 感染分裂和不分裂细胞，适用于难转染的原代细胞（如神经细胞）及体内实验 感染分裂和不分裂细胞
表达风度 中水平表达 高水平表达 表达时间 慢（1-3天） 快（1-2天） 滴度 滴度最高可达10*8pfU/ml 滴度最高可达10*11pfU/ml 克隆容量 可插入不超过8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低 可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低 免疫原性 低免疫原性 高免疫原性 2、构建目的基因到载体 2.1构建手段 一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。 1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定 2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定 2.2质粒载体 2.2.1概念 能够进行自主复制的环状DNA双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子 2.2.2特征 质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制。通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。3、质粒DNA在大肠杆菌里转化 连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。 3.1大肠杆菌感受态细胞的制备 1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。 2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h 3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min 4）4℃离心10min（4000r/min） 5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽 6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min 7）4℃离心10min（4000r/min） 8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置） 9）分装细胞，200ul一份，4℃保存 3.2质粒DNA的转化 1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min 2）离心管放到42℃保温90s 3）冰浴2min 4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min） 5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min 6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落 3.3质粒提取步骤 1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清 2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。 3）加入250ul溶液Ⅱ（细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。 4）加入350ul溶液Ⅲ（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀。 5）12000室温离心10min，收集上清。 6）将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。 7）12000转离心1min，弃滤液。 8）加入500ul溶液PB（洗涤液）12000转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。 9）加入500ul溶液W（去盐液），12000转离心1min，弃滤液，重复一次。 10）12000转离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。 11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液Eluent（为无菌的双蒸水，PH为8.0-8.5），室温放置2min。 12）12000转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒DNA，质粒于-20℃保存。 质粒提取步骤：吸取液体培养基于1.5ml离心管中12000转离心1min，弃上清，吸取培养基重复离心弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于-20℃——加250ulBufferS1悬浮细菌，悬浮均匀——加250ulBufferS2温和充分的上下翻转4-6次混合均匀，使菌体裂解——加350ulBufferS3温和上下翻转12000离心10min——取上清液转移到专用的制备管（2ml）12000转离心1min，弃滤液——加500ulBufferW112000转离心1min，弃滤液——加500ulBufferW212000转离心1min，弃滤液，重复一遍——将制备管置回2ml离心管12000转离心1min——将制备管移入新的1.5ml离心管中，加60~80ulEluent或离子水，室温1min12000转离心1min——移去制备管，将有质粒的离心管于4℃或是-20℃保存4、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装） 4.1名词解释 4.1.1293T细胞是由293细胞派生,表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系,被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白,或是用以包装病毒。 4.1.2脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。 4.2共转染的操作步骤 第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度 第二天： 1.500ul无血清培养基稀释2ug表达质粒+1.5ugpsPAX2+1.5ugpMD2.G 2.500ul无血清培养基稀释15ul脂质体2000 3.5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min 4.从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。 5.6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB（从此刻开始算时间）。 第三天： 1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上 第四天： 1.转染后48和72h分别收获含病毒的上清。 2.3000rpm离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。 3.12000转离心浓缩细胞、分装-80°C贮存。 4.滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 4.3病毒包装的原理 质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜，pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。 在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞
慢病毒包装实验技术方法
慢病毒包装实验技术方法慢病毒一般为HIV等为基础改造的接近无毒，感染后不进行复制的稳转株构建运载体。
可以将目的基因携带并整合到细胞的基因组中，持续表达（普通转染一般只表达数天，随着分裂质粒会渐渐被稀释掉），进行长期试验。
慢病毒包装的过程和转染相似，主要区别在于慢病毒包装一般为多质粒混合转染（不同质粒含有病毒的不同元件），多个质粒的总质量和PEI的质量以及转染过程都与普通转染无异。
不同的是一般在转染后48h后，也就是换液后的30小时，收集细胞上清作为病毒的粗制品，来感染目的细胞。
以研发为目的的小规模生产是采用生长在培养皿、培养瓶、多盘系统（Cell Factories, Cell Stacks）或HYPERFlask的贴壁细胞。
采用传统的磷酸钙转染或者最近发展起来的PEI转染来转染最佳密度的细胞(<50%),后者的优点是不依赖培养条件、转然后不需要换液及可用于悬浮细胞转染。
原则上，小规模生产也可以采用阳离子转染试剂如lipofectamine、fugene及293fectin,它们转染也都获得了高水平表达。
通过比较不同的细胞培养系统，Aububel等并没有发现所评估的培养系统(培养瓶，一层或十层细胞工厂)所产生的慢病毒滴度有任何差异。
利用HYPERFask，Kutner等发现采用HYPERFask培养可以比用传统培养装置培养所产生的慢病毒每个表面单位高10倍，原因可能是前者有更高的氧气利用率。
此外，HYSPERFask生产的慢病毒比传统培养皿生产的慢病毒所含细胞蛋白、核酸污染更低。
HEK293T细胞贴壁不牢，所以采用转瓶培养生产慢病毒时更困难，同时为了要保证细胞贴壁，转染条件的优化要更加小心。
在这种背景下，Patel等证实在HEK293中过表达alpha-v和beta-3整合素可以提高细胞贴壁能力，进而提高转瓶中慢病毒的产率。
然而，这种方法需要采用过表达整合素的重组HEK293。
293系列的细胞都是非常好转染的。
慢病毒包装步骤及经验总结
慢病毒包装步骤及经验总结慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的⼀种，它能够将靶基因导⼊到⼀些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从⽽⼤⼤增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若⼲代，可以进⾏稳转细胞株的筛选。
因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从⽽保证其⾼效表达并且对细胞不产⽣随机整合可能产⽣的伤害。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋⽩。
为产⽣⾼滴度的病毒颗粒，需要利⽤表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进⾏病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离⼼取得上清液后，可以直接⽤于宿主细胞的感染。
慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进⼊细胞后，在细胞浆中被其⾃⾝携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进⼊细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达⽬的蛋⽩或产⽣RNAi⼲扰。
慢病毒包装系统由⼀个包装质粒混合物（Mix）和⼀个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，如下图（图⽚来⾃MIT）：载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件等。
不同系统包装质粒混合物也不⼀样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，⽐例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋⽩的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调节因⼦rev基因，VSVG含有提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因。
以下介绍⽤293T细胞在六孔板（35mm）中包装病毒，其他孔板相应增加或减少体积。
准备试剂篇? 核⼼质粒；? 指数⽣长的293T细胞；? 病毒包装质粒Mix:1 µg/µl（Mix=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2），不同载体系统所⽤的包装病毒质粒也不⼀样，此系统可⽤于包装PBOBi，PLKO， Plv等载体质粒。
慢病毒包装操作方案
慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂PEG6000溶液50%Wako3 耗材●50 mL离心管●15 mL离心管●10 cm细胞培养皿●0.45μm过滤器● 2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
在显微镜下观察，可看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。
慢病毒包装原理介绍
慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒 Lentivirus 载体是以 HIV-1 人类免疫缺陷 I 型病毒为基础发展起来的基因治疗载体;区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力;慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入;该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达;在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景;目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中;由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的 siRNA 半衰期短,体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制;采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体,然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用;在所构建的 siRNA 表达载体中,是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的,这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列,而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾;当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时,它指导的转录就会停止,在转录产物 3' 端形成 1~4 个U ; U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构 stem loop ;在 siRNA 表达载体中,构成 siRNA 的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNAsmall hairpin RNA, shRNA,载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可折叠成具有 1~4 个U 3 ' 突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成 siRNA ;构建载体前通常要通过合成 siRNA 的方法,寻找高效的 siRNA ,然后从中挑选符合载体要求的序列,将其引入 siRNA 表达载体;慢病毒载体 Lentiviral vector 较逆转录病毒载体有更广的宿主范围,慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞;慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA ,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能,以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性;慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息;慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白;为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子;二、这一系统的目的,主要是为了解决以下问题：1. 对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,这就为 RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径;2. 进行稳转细胞株的筛选；3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；在细胞相关的实验操作中,对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞,通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率,以达到目的基因的高效瞬时表达;三、慢病毒载体介绍慢病毒载体 Lentiviral vector, LVs 是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它能高效的将目的基因或 RNAi 导入动物和人的原代细胞或细胞系;慢病毒载体基因组是正链 RNA ,其基因组进入细胞后,在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为 DNA ,形成 DNA 整合前复合体,进入细胞核后, DNA 整合到细胞基因组中;整合后的 DNA 转录 mRNA ,回到细胞浆中,表达目的蛋白；或产生 RNAi 干扰;慢病毒载体介导的基因表达或 RNAi 干扰作用持续且稳定,原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中,并随细胞基因组的分裂而分裂;另外,慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中;以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比,比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体,有鲜明的特色;大量文献研究表明,慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等;慢病毒载体不表达任何 HIV-1 蛋白,免疫原性低,在注射部位无细胞免疫反应,体液免疫反应也较低,不影响病毒载体的第 2 次注射;四、慢病毒载体的构建1. 构建原理慢病毒属于逆转录病毒科,但其基因组结构复杂,除 gag、pol 和 env 这 3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外,还包括 4 个辅助基因,vif、vpr、nef、vpu 和 2 个调节基因 tat 和 rev ; HIV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒,第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的;慢病毒载体的构建原理就是将 HIV 21 基因组中的顺式作用元件如包装信号、长末端重复序列和编码反式作用蛋白的序列进行分离;载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由 HIV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补,含有包装、逆转录和整合所需的 HIV 21顺式作用序列;同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因;为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒 RCV 的可能性,将包装成分的 5 ′ LTR 换成巨细胞病毒 CMV 立即早期启动子,3 ′ LTR 换成 SV 40 polyA 位点等;将包装成分分别构建在两个质粒上,即一个表达 gag 和 pol、另一个表达 env ;根据这个原理,Naldini 和 Kafri 等构建了三质粒表达系统;2. 三质粒表达系统三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒;其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下,表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白,但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白 vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白 V SV 2G,应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围,而且增加了载体的稳定性,允许通过高速离心对载体进行浓缩,提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列,还保留 350 bp 的 gag 和 RRE,并在其中插入目的基因或标志基因绿色荧光蛋白 GFP ;将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少,减少载体重组过程中产生 RCV 的可能性;通过三质粒共转染 293T 细胞,超速离心后病毒滴度可达 109IU /m l ;3. 四质粒表达系统为了减少 HIV 21 包装结构的序列同源性,进一步减少重组成 RCV 的可能性,Dull 等人将辅助基因去除;但由于 gag2pol 的转运需要 rev,因此,在上述的三质粒系统的基础上,构建成四质粒表达系统,该系统加上含 rev 的质粒减少了产生 RCV 的可能性,而且对非分裂期细胞转导效率无影响;五、慢病毒载体应用1. 将目的基因 /RNAi 基因转入难以转染的细胞,比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞；2. 将目的基因 /RNAi 基因转入动物组织,以期获得长期表达；3. 构建稳定表达目的蛋白 /RNAi 的细胞系,再用exvivo的方法导入动物体内；4. 基因治疗；5. 转基因动物；6. 基因敲除；7. 药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系,研究药物的作用；8. 快速建立生产目的蛋白的细胞系,非常有前途的真核细胞表达方法;。
腺病毒包装的原理和具体步骤及方法
腺病毒包装的原理和具体步骤及方法
腺病毒包装
1 特点：
1.1 几乎可以感染所有类型的细胞。
1.2 可以获得复制缺陷型（E1和E3缺失）的腺病毒。
1.3 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效地进行增殖。
1.4 腺病毒载体感染宿主的范围比较广。
1.5 感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。
2原理：
腺病毒（Adenovirus，Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
3 腺病毒包装简要流程
3.1 含有目的基因的腺病毒穿梭载体的构建和质粒纯化提取。
注：客户也可以提供构建好的重组腺病毒穿梭载体。
3.2 穿梭载体与腺病毒骨架质粒重组及鉴定。
3.3 重组腺病毒质粒的酶切线性化。
3.3 线性化的重组腺病毒质粒转染包装细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
3.4 腺病毒扩增并纯化。
3.5 分装，- 80 oC保存。
3.6 滴度测定及无菌检测。
慢病毒包装与感染细胞流程
慢病毒包装与感染细胞流程在慢病毒感染细胞实验原理与实用流程(一)中，我们学习了利用目的基因包装成慢病毒感染细胞的原理，今天就和医学方小编学习具体如何操作。
质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（病毒包装）293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。
小编将以293T细胞包装慢病毒，感染10cm SW480结肠癌细胞为例：DAY1转染前一天，用1ml胰酶消化293T细胞1-2分钟，用含10% FBS的 DMEM培养基重悬293T细胞，铺2-3*106个细胞至 10cm dish中(70-80% 融合度)；(注：慢病毒包装时要多种一点儿293T细胞，慢病毒对细胞的毒性较大！)DAY2（转染时准备无双抗完全培养基，抗生素对转染中细胞损伤大）1、转染293T细胞(10cm dish)：A：用470ul optimem稀释30ul Fugene 9（其他转染试剂比例详见其说明书）, 并充分轻轻地混匀，室温下静置5 minB：准备 target plasmid 和包装载体plasmid：pCMV8.9/ psPAX2：3.33ug （注：10cm dish 的量）PMD.G / pMD2.G：1.67ug （注：10cm dish 的量）Target plasmid ：5ug（注：这3个质粒都加在同一个EP管中）六孔板的量是：pCMV8.9/ psPAX2： 1ugPMD.G / pMD2.G： 0.5ugTarget plasmid ： 1ugC：将上述准备的质粒混合液滴加到optimem与Fugene 9的混合液中，RT ,静置20min；2、6-8h后对293T细胞换液，注意加液时，不要吹起细胞（沿着皿壁，轻轻地加新培液）；置37°细胞培养箱中继续培养48h；-----随后同时做SW480细胞的铺板（见后）。
慢病毒包装原理-介绍PDF.pdf
慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。
当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。
U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。
在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。
慢病毒包装步骤及注意事项
慢病毒包装步骤及注意事项现今常用的制备慢病毒载体的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。
此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。
瞬时转染制备慢病毒：细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编码基因，转染效率极高。
但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。
多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。
转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。
DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug 不含内毒素的质粒进行转染。
质粒的纯度对慢病毒载体的包装效率非常关键。
不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。
转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。
其它方法有脂质体法和PEI法。
转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。
如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012IU/ml的慢病毒载体。
之后可以将病毒载体溶解在PBS，HBSS或者DMEM中，并置于-800C储存。
储存溶液添加血清会帮助提高病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。
病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107IU/ml，浓缩之后可以达到109-107IU/ml 。
含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的elisa 试剂盒。
一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24gag。
然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储存方式，都会导致p24gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。
病毒感染细胞实验整体流程和原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒慢病毒原理慢病毒(Lentivirus )是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Len tivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
特点1)直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
2)3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) 无需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
慢病毒包装简要流程:1) 含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5) 分装、-80 C保存。
6)滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
、腺病毒 原理腺病毒(Ade no virus , Ad)是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖 于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad 载体都是基于血清型2和5, 通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在 高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
特点消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
慢病毒包装实验步骤
缓病毒包拆真验的重心：之阳早格格创做1：良佳的293FT细胞状态是转染乐成的主要果素，细胞代数没有宜超出30代；2：细胞铺板需匀称，预防细胞成团，做用转染效用；尽管多的细胞转进量粒，爆收的病毒便越多；3：细胞换液战同转染时，动做要沉柔预防细胞漂浮.尽管少的细胞牺牲，爆收的病毒便越多；真验前要准备的试剂、耗材战仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血浑+90%DMEM配佳的真足培植基 ,0.25%胰酶，PBS,TRL转染试剂，包拆量粒，手段量粒，无血浑培植基.耗材准备：10cm细胞培植皿，6孔细胞培植板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜战10ml无菌注射器，试管架.仪器准备：倒置荧光隐微镜，一般光教倒置隐微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级死物仄安柜，二氧化碳细胞培植箱.第一天：上午（病毒包拆量粒同转染前，293FT细胞复苏后起码让其传代二次以上，293FT细胞能成倍的删少，决定细胞状态佳）；真验前准备：仄安柜启紫中灯照30分钟；把培植基战试剂搁置常温；消化细胞：从37 5%的co2细胞培植箱拿出细胞状态良佳的293FT细胞，吸出本培植基，加进PBS 1ml略洗之后吸出，加进1ml 胰酶消化1-2min，沉沉拍挨培植皿，再加进3ml新陈培植基末行消化，将培植皿中的细胞变化至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上浑液，加进10ml PBS吹挨混匀后，离心1000r /5min, 吸出上浑液.细胞铺板：正在10cm细胞培植皿上标记表记标帜细胞称呼、细胞代数、时间战支配人，将计数佳约莫2.5×106个293FT细胞吸进15ml离心管，再加进真足培植基至10ml充分混匀，而后把混匀的293FT细胞移进10cm培植皿）.搁置培植箱中培植48h.拔出铺板后图片刚刚铺板后铺板1天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板48h后，从培植箱与出293FT细胞，倒置隐微镜瞅察，细胞稀度达90%安排；吸出本有培植基，沿皿壁缓缓加进8ml真足培植基，搁置于培植箱中，待转染. 与出2个1.5ml的离心管，一份加进142ul的无血浑培植基战58ulTRL转染试剂，吹挨混匀.另一份加进包拆量粒18ul、手段量粒10ul战无血浑培植基总体积200ul充分混匀.将2个离心管液体吹挨混匀，室温静置20分钟20分钟后，与出培植箱中的293FT细胞，将混同液用200ul的小枪头沉沉滴进培植皿中,预防细胞正在转染历程中漂起去，而后沉沉十字混匀，搁置于培植箱中培植8h.细胞培植8h后，吸出本培植基，沿皿壁缓缓加进10ml 真足培植基，搁进培植箱中继承培植.第四天转染24h后与出293FT细胞，倒置荧光隐微镜瞅察转染效验第五天转染48h后;准备佳1.5ml离心管，10ml无菌注射器战0.22umPVDF滤膜；支集48h后的病毒上浑；第六天转染72h后，支集72h后病毒上浑.缓病毒包拆完毕后怎么样用缓病毒熏染手段细胞步调一:熏染前一天用6孔板铺板，每孔铺5×10^5个293FT 细胞，搁置于培植箱中培植24h.步调二：准备3个离心管分别加进1ml、500ul、200ul的病毒液，再依次加进1ml的真足培植基战Polybrene吹挨混匀（ Polybrene末浓度为8ug/ml）.步调三：从培植箱中与出6孔板培植的293FT细胞，吸出本有培植基，再依次加进3个离心管中的混同液，混匀后搁进培植箱中培植24h.步调四：24h后吸出含病毒的培植基，加进1ml真足培植基，培植箱中培植48h.步调五：48h后，戴有绿色荧光蛋黑标签的病毒，通过倒置荧光隐微镜瞅察熏染效用.步调六：戴Puromycin基果筛选标记表记标帜的病毒，换上末浓度为1ug/ml的Puromycin的培植基,筛选宁静转导的细胞株(二至三天换一次液).72h瞅察96h瞅察。