姬松茸菌株的胞外酶活性及与产量的关系

姬松茸菌株的胞外酶活性及与产量的关系研究了姬松茸(Agaricus blazei Murrill ) 菌株（出发菌株AbM9, AbM9经离子束注入选育的菌株AbML2、AbML7和AbML11,及AbM9单孢分离所得菌株AbMD3）在菌丝生长期、菇蕾期、一潮菇期和二潮菇期培养料的胞外羧甲基纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶活性的动态变化及与产量的关系。

试验结果表明，姬松茸菌株AbML11产量最高，与AbML2、AbMD3、AbML7和AbM9的差异达极显著水平，但AbML11的产量与菌丝长速相关性不显著；5个供试菌株的淀粉酶活性在菌丝生长期均最高，与菌丝长速的相关性不显著；蛋白酶活性在菇蕾期最高，与产量的相关性不显著；羧甲基纤维素酶活性在一潮菇期最高，与产量呈正相关，相关系数为0.928，达显著水平。

本研究可为姬松茸高产菌株的筛选提供一定的理论依据。

姬松茸; 胞外酶; 纤维素酶; 生物学效率S646.110.1A姬松茸（Agaricus blazei Murrill）又名小松菇、柏氏蘑菇、巴西蘑菇，属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、蘑菇科(Agaricaceae)、蘑菇属(Agaricus)，原产于巴西，是一种珍稀食药两用菌［1］。

姬松茸栽培过程中，菌丝不断向胞外分泌各种酶来降解栽培料中的纤维素及其它有机大分子成分，因此，酶活性的大小直接影响生物降解的能力［2］。

基质中酶活性的变化和强弱通常能反映出菌丝生理生化的活跃程度和基质中化学组分的降解特性［3,4］。

本文研究了姬松茸菌株的胞外酶活性及与产量的关系，旨在为食用菌的营养生理、遗传育种和栽培技术等方面的研究提供参考。

1 材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株姬松茸菌株AbM9（出发菌株）为福建省农业科学院土壤肥料研究所保存菌株，AbMD3为AbM9单孢分离所得菌株，AbML2、AbML7和AbML11为AbM9孢子经离子束注入诱变所得菌株［5］。

1.1.2培养料稻草65%、牛粪25%、麸皮10%、过磷酸钙2%、石灰1.5%等混合均匀，建堆（长2.5 m、宽1.4 m、高1.2 m）发酵21 d，其间翻堆4次（第5 天、第10天、第15天和第18天），使培养料的含水量保持在65%左右，pH保持在7.5左右。

最后一次翻堆3 d后，将培养料装入塑料袋（宽80 cm、高30 cm），每袋装培养料（干重）5000 g，放入长宽高各为45×45×25 cm的铁框内，进房进行二次发酵（12 h），冷却后接种（撒播），接种量为培养料干重的5%，每一菌株设16个重复。

接种后置于通风、光线均匀、空气相对湿度为60%~75%的栽培室培养。

菌丝生长阶段温度保持在25~27 ℃。

出菇时温度降低至20~24 ℃。

菌丝走透时覆土，覆土厚度为1~2 cm。

取菜园土，用2%的石灰水浸泡消毒，滤干水，晾干，使其含水量控制在60%~65%，pH在6.5左右，用于覆土。

1.2方法1.2.1菌丝长速的测定沿着菌丝走势分别在菌丝萌发处和菌丝前端各划一条线作标记，在菌丝前端所在线上选取对称的四点，测量两线之间菌丝的垂直长度，求出每袋菌丝长度的平均值，再根据菌丝走料的总天数，计算每袋的菌丝日均长速。

用SPSS 14.0软件分别对每个菌株16个重复的日均长速数据进行分析，获得每个菌株的菌丝日均长速平均值。

1.2.2鲜菇总产量的计算子实体成熟时（菇体长大、未开伞、菌膜未破）采收，测定每袋的鲜菇总产量。

用SPSS 14.0软件分别对每个菌株16个重复的鲜菇总产量数据进行分析，获得每个菌株每箱的鲜菇总产量平均值，比较产量间的差异显著性，计算平均生物学效率。

平均生物学效率＝(鲜菇总产量平均值/培养料干重)×100%。

1.2.3胞外酶活性测定1.2.3.1 粗酶液的制备在姬松茸菌丝生长期（接种第20天）、菇蕾期（接种第40天）、一潮菇期（接种第50天）和二潮菇期（接种第65天），分别称取20 g充分混匀的培养料，加入蒸馏水100 mL，室温浸提4 h。

两层纱布过滤后，滤液于25 ℃、4800 g/min 离心5 min，上清液即为粗酶液［6］。

另取培养料20 g，70~80 ℃烘干至衡重，记录培养料干重，用于计算酶活大小。

1.2.3.2 羧甲基纤维素酶测定羧甲基纤维素酶活性的测定方法参照文献［7］。

用美国UV 2800AH型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司），在波长540 nm处测定吸光度值，由葡萄糖标准曲线求得含糖量。

纤维素酶活1 U=mg葡萄糖/30 min·g干培养物。

1.2.3.3 淀粉酶测定淀粉酶活性的测定方法参照文献［8］。

淀粉酶活1 U=mg葡萄糖/30 min·g干培养物。

1.2.3.4 蛋白酶测定参照张树政的Folin法［9］，略作修改。

取1 mL 1%酪蛋白，60 ℃预热5 min，分别加入2 mL酶液，60 ℃水浴10 min。

再加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸，终止反应。

溶液于25 ℃、4800 g/min离心10 min。

取上清1 mL，装入10 mL新管中，依次加入5 mL福林试剂A和1 mL福林试剂B，混匀，于40 ℃显色20 min 后，在680 nm处测定吸光度值，由酪氨酸标准曲线求得含糖量。

蛋白酶活1 U=1 μg酪氨酸/min·g干培养物。

1.2.3.5 分析采用SPSS 14.0（Statistical Product and Service Solutions）统计软件，计算姬松茸不同生长期的胞外酶活性与产量和菌丝长速的相关性。

2 结果与分析2.1不同菌株的菌丝长速与生物学效率在相同的栽培条件下，5个姬松茸菌株各收4潮菇，生物学效率方差分析结果表明（表1），AbML11产量最高，AbML7产量最低；AbML11与AbML2、AbMD3、AbML7和AbM9产量间的差异达极显著水平。

AbML11子实体大小均匀、菌盖厚、菌柄适中；AbML7子实体呈白色。

姬松茸子实体白色不但有益于生产加工与产品外观，且丰富了姬松茸的种质资源。

2.2不同菌株不同生长期的淀粉酶活性在整个栽培过程中，培养料的羧甲基纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶活性如图1所示。

菌丝生长期，淀粉酶出现酶活性峰值，随着栽培时间的延长，酶活性逐渐下降，二潮菇期达最低点。

由此可以推测，姬松茸菌丝首先利用培养料中的淀粉类物质作为碳源，以满足菌丝生长的需要。

AbML9和AbML2的淀粉酶活性均高于其它菌株。

菌丝生长期淀粉酶活性的相关性分析表明（表2），菌丝长速与淀粉酶的相关系数为0.608，即淀粉酶活性与菌丝生长速度之间有一定的相关，但是相关性不显著，说明淀粉酶活性对菌丝生长速度影响不大。

2.3不同菌株不同生长期的羧甲基纤维素酶活性测定姬松茸不同生长期羧甲基纤维素酶活性发现，羧甲基纤维素酶活性变化的总体趋势和特点与淀粉酶相反。

羧甲基纤维素酶活性在菌丝生长期最低，随后逐渐升高，至一潮菇期活性达最大值，然后逐渐呈递减趋势（图2）。

AbML11在各时期对应的羧甲基纤维素酶活性均高于其它菌株，AbM9的羧甲基纤维素酶活性其次。

羧甲基纤维素酶活性和生物学效率的相关性分析表明(表3)，一潮菇期的羧甲基纤维素酶活性与平均生物学效率呈正相关，相关系数为0.928，达显著水平，说明一潮菇期的羧甲基纤维素酶活性是生物学效率的影响因素。

由试验结果推测，在菇蕾期至一潮菇期，培养料中的主要成分淀粉在菌丝生长期已经消耗得差不多了，此时羧甲基纤维素酶开始降解培养料中的纤维素和半纤维素，将有机物转化为可利用的营养成分，提高碳素供应量，以利于菌丝的生长。

2.4不同菌株不同生长期的蛋白酶活性蛋白酶活性的峰值与CMC酶相似，先增大，后逐渐减小，但其峰值出现在菇蕾期，即子实体生长发育期，说明蛋白酶活性的变化与子实体的生长发育有关，该现象可以解释为：蛋白酶活性高，有利于培养料中蛋白质的降解，满足子实体生长发育对氮源的需要。

菇蕾期的蛋白酶活性与生物学效率的相关性分析表明(表4)，相关系数为0.335，相关性不显著。

3 讨论3.1 淀粉酶活性在菌丝生长期达到峰值，然后逐渐降低；羧甲基纤维素酶活性在菌丝生长期逐渐增大，至一潮菇期达最大值；蛋白酶活性峰值出现在菇蕾期，说明蛋白酶活性的变化与子实体的生长发育有关，但是该酶活性峰值与产量的相关性不显著。

上述现象与郭倩［10］和王玉万［11］等人对四孢蘑菇和滑菇等的研究结果相似。

3.2 一潮菇期的羧甲基纤维素酶活性与生物学效率呈正相关，相关系数为0.928，达显著水平，说明一潮菇期羧甲基纤维素酶活性对姬松茸的产量有较显著的影响，这与倪新江［12］和CLAYDON［13］对香菇和双孢蘑菇研究的结论相一致。

而菌丝长速与产量没有显著的相关性，故不能将菌丝长速作为筛选高产菌株的指标。

试验为选育食用菌高产菌株提供了科学依据。

3.3 姬松茸胞外酶系丰富，据研究发现至少有9种酶［3］。

本试验主要研究了姬松茸胞外3种酶活性与产量的关系，其它酶对产量是否也有影响？酶之间对产量的影响是否存在协同作用？尚需要作进一步的深入研究，以了解整个栽培过程酶学的动态变化。

［1］卯晓岚. 中国大型真菌. 郑州: 河南科学技术出版社, 2000.［2］杨庆尧. 食用菌生物学基础［M］. 上海:上海科技出版社, 1981:6 14.［3］倪新江, 冯志勇, 梁丽琨, 等. 鸡腿菇对棉籽壳的降解与转化［J］. 微生物学通报, 2002, 29(2):1 4.［4］牛福文, 印桂玲, 刘宝增. 黑木耳栽培两种培养基主要组分的降解和有关酶活的变化［J］. 微生物学通报, 1990, 17(4):201 204.［5］余增亮. 离子束生物技术引论［M］. 合肥:安徽科学技术出版社, 1998:176 194.［6］倪新江, 丁立孝, 潘迎捷, 等. 姬松茸在两种培养基上生长期间九种胞外酶活性变化［J］. 菌物系统, 2001, 20(2):222 227.［7］王玉万, 王云. 银耳耳友菌降解木质纤维素的研究［J］. 生态学杂志, 1988, 3(4):14 16.［8］王玉万, 徐文玉. 构菌栽培过程中对木质纤维素的降解和几种多糖分解酶活性的变化［J］. 微生物学通报, 1989, 3(137):137 140.［9］张树政. 酶制剂工业［M］. 科学出版社, 1998:446 448.［10］郭倩, 何庆邦. 四孢蘑菇生长过程中四种胞外酶活性和木质纤维素降解的变化规律［J］. 食用菌学报, 1998, 5(2):13 17.［11］王玉万, 王云. 滑菇营养生理研究［J］. 微生物学通报, 1990, l7(6):321323.［12］倪新江, 潘迎捷, 冯志勇, 等. 香菇生长过程中几种胞外酶的变化规律［J］. 食用菌学报, 1995, 2(4):22 27.［13］CLAYDON N, ALLAR M, WOOD DA. Fruitbody biomass regulated production of extracellular endocellulase during periodic fruiting by Agaricus bisporus［J］. Trans Brit Mycol Soc, 1988, 90(1):85-90.宋凤菊。