基因工程基本过程

基因工程基本过程

基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。

常用的工具酶

限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割

DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化

核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接

核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成

核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割

核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰

其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。

主要过程有为四步：

一．获得目的基因

有多种方法可获得目得基因

1.构建cDNA文库分离目的基因

过程：

（1）从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA

的第一条链。

（2）以第一条链为模板，以反转录酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。

（3）在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。

（4）接头或衔接子连接。

（5）凝胶过滤分离cDNA。

（6）通过核酸探针法或免疫反应法从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。

2.人工化学合成法

适于已知的核苷酸序列且校小的ＤＮＡ片断合成，常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。

过程：先用以上方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡核苷短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的ＤＮＡ片段，再用连接酶连接成完整的基因。

3.利用PCR技术直接扩增目的基因

PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程，用ＰＣＲ法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。

二．载体的选择与制备

1.载体的选择（以质粒为例）

⑴载体必须是复制子。

⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。

⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。

⑷自身分子量较小，拷贝数高。

⑸在宿主细胞内稳定性高。

(6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别

(7)应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。

(8)应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNA较为稳定。

(9)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。

2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。

目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。

在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA 却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。

三．构建基因表达载体

1.用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出粘性末端。

2.用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。

3.将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。

四．目的基因导入受体细胞

1.将目的基因导入植物细胞－农杆菌转化法

2.将目的基因导入动物细胞－显微注射法

3.将目的基因导入微生物细胞（以大肠杆菌为例）

（1）用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.

（2）将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.

（3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。

五．目的基因的检测与鉴定

1.要检测目的基因是否插入转基因生物染色体的DNA上

检测方法：采用DNA分子杂交技术

2.检测目的基因是否转录了mRNA

检测方法：同样用分子杂交技术DNA与RNA杂交

3.检测目的基因是否翻译成蛋白质

检测方法：提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。

基因工程制药实例及意义

抗生素类

传统的抗生素生产，主要利用化学合成或微生物发酵来获得，其生产过程中菌种的表达水平比较低，生产成本比较高，而且在使用过程中容易产生耐药菌群。而利用基因工程技术可以对生产菌种进行基因改造，得到表达水平高、产品目的性强的菌株，如大肠杆菌生产青霉素酞胺酶。德国一个科研小组对生产半合成青霉素的材料6APA．用基因工程来增强大肠杆菌的青霉素酰胺酶活性。将大肠杆菌的基因PBR322的质粒克隆化所形成的菌株，其酶活力比原株提高50倍．从而提高6APA生产能力。我国王以光利用基因重组技术对螺旋霉素产生菌进行改造，增强了丙酰基转移酶的基因在螺旋霉素产生菌中的表达，并提高了丙酰螺旋霉素的产量。