米曲霉的培养及蛋白质的分析
米曲霉的研究及应用进展
⽶曲霉的研究及应⽤进展⽶曲霉的研究及应⽤进展摘要：介绍了⽶曲霉的⽣物学特性，并综述了⼯业上的相关应在基础相关领域、发酵产物领域、宏观诱变及微观诱变领域的研究与应⽤并提出展望。
关键词：⽶曲霉⽣物学特性⼯业应⽤1 ⽶曲霉的⽣物学特征⽶曲霉(Aspergillus oryzae)是⼀种好⽓性真菌，分类学归属于半知菌亚门、曲霉属。
菌落⽣长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，菌丝⼀般呈黄绿⾊，酸度较⼤的培养基上呈绿⾊，酸度较⼩的培养基上呈黄⾊，⽼化后逐渐为褐⾊。
分⽣孢⼦梗⽣长在厚壁的⾜细胞上，分⽣孢⼦头呈放射形，顶囊球形或瓶形。
培养适温37℃。
⽶曲霉主要存在于粮⾷、发酵⾷品、腐败有机物、⼟壤等处，是我国传统酿造⾷品酱、酱油和酒类的⽣产菌种，也可⽤于⽣产各种酶制剂、有机酸、糖化饲料、益⽣素等。
在众多曲霉属家族中，⽶曲霉占有着重要的地位。
随着应⽤领域的蓬勃发展，⼈们对⽶曲霉的关注⽇渐增长。
2.⽶曲霉基础领域的研究2．1 ⽶曲霉基因组的破译⽇本研究⼈员历经四年零四个⽉时间成功的破译了⽶曲霉基因组，并于2005年12⽉在《⾃然》杂志上发表了分析结果：⽶曲霉基因组⼤约有3800万个碱基对，共有8条染⾊体，包含约1．2万个基因。
这⼀成果为从微观领域研究⽶曲霉打下了⼀个良好的基础。
2．2⽶曲霉原⽣质体制备、再⽣和融合为了更进⼀步研究⽶曲霉，制备原⽣质体就变得尤为重要。
原⽣质体(Protoplast)即在⾼渗压溶液中，⽤酶法将细胞壁分解除掉，剩下由原⽣质膜包住的球状胞体。
它保持了原细胞的⼀切活性。
原⽣质体因去掉细胞壁屏障⽽对诱变剂的敏感性增强、变异率提⾼，⽽且表⾯易形成电极性，使不同种原⽣质之间相互易于吸引、脱⽔粘合⽽形成聚集物，因⽽原⽣质体诱变、融合是菌种选育的⼀种⾏之有效的⽅法。
王燕等⼈利⽤纤维素酶、溶壁酶、蜗⽜酶三种酶混合，并按5:3:1的配⽐，结果达到了最优的破除细胞壁的效果。
章运等⼈考虑了茵龄、酶解温度、酶解时间、再⽣培养基的稳渗剂等多种因素，对沪酿3．042的原⽣质体制备与再⽣做了相关研究。
米曲霉胞链接与发酵液中蛋白动态变化的研究
米曲霉发酵液中蛋白动态变化的研究冯广莉，刘洪伟，许喜林，李晓凤（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）摘要：本文利用葡萄糖和吐温80作为额外碳源培养米曲霉，对其生物量积累，胞链接蛋白以及发酵液蛋白随培养时间的变化情况进行了研究。
以葡萄糖作为额外碳源时，米曲霉生物量积累速度较快，在培养24 h已达最大值，为31.97 g/L；当米曲霉以吐温80基金项目：国家自然科学基金资助项目（20906031、31270636）；广东省教育厅科技创新项目(2012KJCX0006)；新世纪优秀人才支持项目(NCET-12-0192)作者简介：冯广莉（1988-），女，硕士研究生，现从事全细胞催化方面的研究通讯作者：李晓凤（1977-），女，博士，副研究员，现研究方向为全细胞催化及食品安全检测篇。
胞链结脂肪酶比纯酶在有机相催化体系中具有稳定好、催化效率高、廉价和易于操作的优点。
研究表明米曲霉细胞具有催化核苷类物质合成的作用[12]，在以tween80作为额外碳源时大量产生胞连接和细胞质脂肪酶，分子量分别为27 kDa与36 kDa[13]，本文主要利用葡萄糖和吐温80作为额外碳源对米曲霉生物量积累，胞链接蛋白以及发酵液蛋白随培养时间的变1832化情况进行研究，并且分析胞连接蛋白、发酵液蛋白与生物量累积之间的关系。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1化学试剂丙酮，广东化学试剂工程技术研究开发中心，分析纯；正己烷，江苏强盛化工有限公司，分析纯；Tricine，翔博生物公司；Tris-HCl，上海缘聚生物技术有限公司。
酚试剂、盐酸、氯化镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、乙酸、吐温80、三氯乙酸、溴酚蓝、β-巯基乙醇、丙烯酰胺、TEMED均为市售分析纯。
1.1.2 主要仪器设备电泳仪，DYY-6C，北京六一仪器厂；全温摇瓶柜：HYG-A太仓市实验设备厂；手提式压力蒸汽消毒器YX-280 B：广州永程实验仪器有限公司；光学显微镜：上海，xsp-3 CA 1；低温水浴培养箱：LSHZ-300太仓市试验设备厂；紫外分光光度计：Spectumlab 752 s紫外可见光分光光度计。
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究作者：宗玉梅,林巧,赵树东,杨柳炜,邓远均,侯云境来源：《现代食品》 2019年第5期◎ 宗玉梅1,林?巧1,赵树东1,杨柳炜1,邓远均2,侯云境2(1.西昌学院,四川?西昌?615000;2.四川省生生酱园食品有限公司,四川?西昌?615000)Zong Yumei1, Lin?Qiao1, Zhao Shudong1, Yang Liuwei1, Deng Yuanjun2, HouYunjing2(1.Xichang University, Xichang?615000, China;2.Sichuan Shengshengjiangyuan Food Co., Ltd., Xichang?615000, China)摘?要:本文利用单因素实验对米曲霉3.042培养基组成成分和培养条件进行优化,分别研究了培养基碳源含量、氮源含量、营养因子、加水量、培养温度、培养时间、初始pH对米曲霉生长情况的影响。
结果表明:蔗糖27 g·L-1,硝酸钠2.5 g·L-1,硫酸镁(Mg SO4?7H2O)0.6 g·L-1,初始pH 6.5,在30 ℃的环境下培养72 h后,米曲霉生长得最好。
关键词:米曲霉3.042;单因素实验;培养基优化Abstract:The composition and culture conditions of Aspergillus 3.042 medium were optimized by single factor experiment, and the effects of carbon source content, nitrogen source content, nutrition factor, water addition, culture temperature, culture time and initial pH on the growth of Aspergillus are studied respectively. The results showed that Aspergillus 27 g·L-1 grew best when sucrose, sodium nitrate 2.5 g·L-1, ma gnesium sulfate 0.6 g·L-1, initial pH 6.5 and 72 h were cultured in 30 ℃ environment.Key words:Aspergillus 3.042; Single factor experiment; Medium optimization 中图分类号:TS201米曲霉(Aspergillus oryzae)是中国传统发酵调味食品酱油酿造过程中使用的关键菌种之一,其产酶活力的高低会影响原料的利用率及产品的品质。
高产蛋白酶米曲霉培养条件的研究8...
摘要蛋白酶是活细胞产生的生物催化剂，应用十分广泛；米曲霉具有丰富的蛋白酶系，是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会公布的安全微生物菌株之一，也是国内酱油等发酵食品生产的主要菌株。
因此，提高米曲霉的蛋白酶活力对于发展轻工业、提高产品质量有重要意义。
本论文利用米曲霉沪酿3.042为出发菌株，通过紫外诱变筛选出一株中性蛋白酶活力较高的菌株，命名为米曲霉UV-16。
该菌株的遗传稳定性较好，并将出发菌株的中性蛋白酶活力由1996.5 U·g-1提高到2368.0 U·g-1，蛋白酶活力提高了18.6%。
实验对米曲霉UV-16的酶系进行了研究，发现该突变株其他酶系基本没发生改变。
实验研究了基质组分和发酵条件对米曲霉UV-16产中性蛋白酶的影响，通过单因素实验，我们确定了麸皮为碳源，豆粕为氮源，豆粕添加量20%，KNO3添加量0.8%，MgSO4添加量0.07%，Na2HPO4添加量0.14%，每10g培养基接种1×108个孢子，温度28℃，加水量为原料量的85%，发酵时间70h，pH自然，并且发现FeSO4对产酶有抑制作用。
经过单因素实验，蛋白酶活提高到2707.8U·g-1，酶活力在诱变的基础上提高了14.3%。
单因素实验后，对加水量、培养温度、培养时间、豆粕添加量、KNO3、MgSO4利用响应面分析法精确找出最优条件。
通过PB实验，确定了培养时间和豆粕添加量为主要影响因素；通过最陡爬坡实验，找到了响应面实验的中心点；再通过中心组合实验，确定了最佳的培养条件：培养基加水量为87%，豆粕添加量23.37%，KNO3添加量0.7%，MgSO4添加量为0.08%，Na2HPO4添加量0.14%，每10g培养基接种1×108个孢子，培养温度为29℃，培养时间67h。
米曲霉UV-16产中性蛋白酶的能力达到2824.9U·g-1，蛋白酶活力再次提高4.3%。
米曲霉对牛乳蛋白降解的研究
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品科技2009年第34卷第9期glucomannan:chemical analysis and13C NMR spec －troscopy[J].Carbohydrate Polymers,2003,53:183-189[9]P Prawitwong,et al.Effects of γ-irradiation on molar massand properties of Konjac mannan[J].Food Hydrocolloids,2007,21:1362-1367[10]Gum Elise Fredheim,Svein Magne Braatan,Bjorn EChristensen.Molecular weight determination of lignosul －fonates by size exclusion chromatography and multi-an －gle laser light scattering[J].Journal of ChromatogyaphyA,2002:191-199[11]汪超,张艳,姜发堂,等.魔芋葡甘聚糖粒度与分子尺度的相关性[J].湖北工业大学学报,2007,22(2):78-81[12]汪超,李斌,谢笔钧.魔芋葡甘聚糖的流变特性研究[J].农业工程学报,2005,21(8):157-160[13]Wen J,Arakawa T,Philo J S.Size exclusion chromatog －raphy with on-line light scattering,absorbance,and re －fractive index detectors for studying proteins and their in －teractions[J].Anal Biochem,1996,240:155米曲霉对牛乳蛋白降解的研究Study on the degradation of milk protein by Aspergillus oryzaeYANG Fan,LV Jia-li(Shaanxi University of Science and Technology,Xi ＇an 710021)Abstract:Milk was fermented by Aspergillus oryzae,and as the degradation raten of the protein for anindicator,which have been studied through one -orthogonal,at the same time weighing the cell dry weight,results showed that:inoculation 4%,with volume of 30mL,shake speed bed for 180r/min is best fector,which can reach the largest the degradation raten 35.6%.And this time the cell dry weight is 3.4g/100mL.Key words:Aspergillus oryzae;milk;the degradation raten of the protein杨帆，吕嘉枥(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)摘要：利用米曲霉对牛乳蛋白进行降解，通过单因子及正交试验以蛋白质降解率为指标，同时测定其菌体干质量。
米曲霉GN―2菌株产中性蛋白酶固体发酵条件的优化
米曲霉GN―2菌株产中性蛋白酶固体发酵条件的优化摘要：对米曲霉（Aspergillus oryaze）GN-2菌株产中性蛋白酶固体发酵的条件进行优化。
单因素试验结果表明，米曲霉的固体适宜发酵条件为发酵原料麸皮∶豆粉为4∶1（质量比，下同），培养时间60 h，培养温度25 ℃，培养基加水量10 mL，接种量1×106个/mL孢子悬液2.0 mL，培养基起始pH 6.0，0.02%（NH4）2SO4溶液1 mL。
正交试验结果表明，在温度25 ℃、加水量20 mL、麸皮∶黄豆粉为4∶1、培养时间72 h的条件下酶活力最高，达1 016.9 U/g。
关键词：米曲霉（Aspergillus oryaze）；中性蛋白酶；产酶条件中图分类号：TQ925；Q93-33 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1637-04Optimizing the Solid Fermentation Conditions of Neutral Protease fromAspergillus oryzae GN-2 StrainHUANG Yan，JU Lu-ning（Minbei V ocational and Technical College，Nanping 353000，Fujian，China）Abstract：The optimal solid fermentation conditions ofneutral protease from Aspergillus oryzae GN-2 strain was studied. The results of single factor test showed that the highest neutral protease activity was obtained under the conditions of wheat bran and soybean powder addition ratio 4∶1，fermentation time 60 h，temperature 30 ℃，water addition 10 mL，inoculum amount 2.0 mL 1×106 spores/mL spore suspension，the initial medium pH 6.0，0.02%（NH4）2SO4 1 mL. The results of orthogonal experiment showed that the highest neutral protease activity was obtained when the solid fermentation was carried out at 25 ℃for 72 h，water addition 20 mL and the addition ratio of wheat bran and soybean powder 4∶1，with the highest neutral protease activity of 1 016.9 U/g.Key words：Aspergillus oryzae；neutral protease；enzyme production conditions中性蛋白酶是指最适作用pH介于6.0～7.5的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。
米曲霉
1.菌种特点：米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。
背面无色。
分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。
分生孢子梗2mm左右。
近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。
顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。
上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。
分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。
（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。
菌落生长较快，质地疏松。
初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。
是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。
也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。
会引起粮食等工农业产品霉变。
米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。
米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。
米曲霉米曲霉米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。
在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。
米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。
米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。
米曲霉固态发酵玉米胚芽粕对蛋白质理化性质及抗氧化性的影响
米曲霉固态发酵玉米胚芽粕对蛋白质理化性质及抗氧化性的影响张会;任健【摘要】以玉米胚芽粕为原料,利用米曲霉对其进行固态发酵,随后从发酵产物中提取玉米胚芽蛋白,对比发酵前后提取的玉米胚芽蛋白的抗氧化性、表面疏水性、巯基含量及氨基酸含量的变化.以可溶性蛋白含量为指标,通过单因素试验和正交试验确定玉米胚芽粕的最佳发酵条件为接种量7.2×108 CFU/g、发酵时间6h、料液比1:2.5,在此条件下玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量为0.827 g/g.与未发酵提取的玉米胚芽蛋白相比,发酵后提取的玉米胚芽蛋白的表面疏水性、游离巯基含量分别增加了10.3和1.5 μmol/g,氨基酸总量和疏水性氨基酸总量分别提高了12.49个百分点和6.29个百分点,抗氧化性(DPPH自由基清除率、还原力)也有所提高.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2019(044)006【总页数】5页(P128-132)【关键词】玉米胚芽粕;米曲霉;固态发酵;可溶性蛋白;抗氧化性【作者】张会;任健【作者单位】齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江齐齐哈尔161006;农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江齐齐哈尔161006;农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006【正文语种】中文【中图分类】TS201.3;TQ92玉米胚芽粕中含粗蛋白质18%～20%，粗脂肪1%～2%，粗纤维11%～12%。
玉米胚芽榨油后，除油脂含量降低外，其他营养成分基本全部保留在粕中，但国内工厂一般将玉米胚芽粕做饲料处理或弃掉，并没有发挥其潜在的经济价值[1]。
米曲霉是我国酿造酱油、酒类等食品工业的传统生产菌种，是一种好气性、易培养、产复合酶的菌株，可产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等[2]。
经米曲霉发酵后，玉米胚芽粕中粗纤维、植酸等难吸收的物质被降解，与传统从玉米胚芽粕提取的玉米胚芽蛋白相比，玉米胚芽粕经发酵后再从中提取的玉米胚芽蛋白性质有明显改善。
米曲霉的介绍
1.菌种特点：米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。
背面无色。
分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。
分生孢子梗2mm左右。
近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。
顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。
上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。
分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。
（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。
菌落生长较快，质地疏松。
初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。
是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。
也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。
会引起粮食等工农业产品霉变。
米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。
米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。
米曲霉米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。
在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。
米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。
米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。
米曲霉的应用研究进展
引言
本次演示将基于RNASeq技术对米曲霉RIB40转录组学进行研究，旨在为该菌 株的基因表达模式提供更深入的了解。
研究方法
1、样品制备
1、样品制备
实验对象：米曲霉RIB40菌株实验条件：不同生长阶段（如对数生长期、静止 期等）和不同环境因素（如温度、湿度等）下培养的米曲霉样品样品处理：将培 养好的米曲霉菌株进行离心收集，提取总RNA，通过质量检测和浓度测定，确定 样品符合实验要求
1、全转录组数据0转录组进行RNASeq测序，得到了高质量的测序数据。实 验中获得了每个样品的大量读数，其中大部分读数的长度超过了200 nt，适用于 进一步的分析。
2、基因表达谱分析
2、基因表达谱分析
利用HTSeq工具对每个样品的基因表达量进行了计算，得到了基因表达谱数据。 通过对基因表达谱数据的分析，发现不同生长阶段和环境因素下，米曲霉RIB40 的基因表达模式存在明显的差异。同时，通过对比先前的研究，发现本实验的结 果与先前报道的结果基本一致，但本实验的基因表达数据更加丰富和精准。
参考内容二
引言
引言
米曲霉（Aspergillus oryzae）是一种重要的工业微生物，广泛应用于食品、 制药、农业和环保等领域。RIB40是米曲霉的一个菌株，具有较高的工业应用价 值。转录组学研究能够揭示生物体在特定生理或环境条件下的基因表达模式，对 于理解米曲霉RIB40的生命活动和工业化应用具有重要意义。近年来，随着测序 技术的不断发展，RNA-Seq技术已成为转录组学研究的重要手段。
参考内容
内容摘要
米曲霉（Aspergillus oryzae）是一种重要的工业微生物，被广泛应用于食 品、制药和发酵工业中。特别是其在酱油、清酒和豆酱等发酵产品的生产中具有 关键作用。随着生物技术的不断发展，对米曲霉的基因组和蛋白质组的研究也越 来越深入，这些研究不仅有助于了解米曲霉的生物学特性，也为优化和提高发酵 生产效率提供了新的途径。
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3.3.2 酶液的制备
准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲 2g，用10－20ml蒸 馏水，30℃浸提半小时，用滤纸过滤。将滤液稀释一定 倍数(使其测定光密度在0.2－0.4范围内为宜)。
3.3.3 测定
取四支试管，分别加入1ml稀释酶液，其中一支为空白 管，三支为平行试验管，置入40℃水浴中预热3－5min。 在三支平行试验管中分别加入1ml 2% 酪蛋白溶液，准 确 计 时 保 温 1 0 min。 立 即 加 入 2 ml 0.4M 三 氯 乙 酸 溶 液 ， l5min 后用滤纸过滤。分别吸取 1ml 清液，加 5ml 0.4M 碳酸 钠溶液，最后加入 1ml 福林 - 酚试剂，摇匀，于40℃ 水浴中 显色20min。 空白管中先加入2ml 0.4M三氯乙酸溶液，再加l ml 2% 酪蛋白溶液，15min后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管 相同。 以空白管为对照，在680纳米波长下测光密度，取其平 均值。
固态培养微生物：主要用于霉菌的培养，但细菌 和酵母菌也可采用此法。其主要优点是节能，无 废水污染。单位体积的生产效率较高。我国广泛 使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过 除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。故染 菌问题未得到根本解决。 本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征： 米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。 菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐 色，反面无色。
米曲霉的培养及蛋白质的分析
一、实验目的
通过固态三角瓶培养曲霉，掌握固态培 养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活 性的分析方法
二、实验原理、过程和方法
1、实验原理 2、实验过程
3、实验方法
1、实验原理
固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一， 具有悠久的历史。在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域 广泛应用。 固态培养方法：（Solid state cultivation）：主要有散 曲法和块曲法。部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培 养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。 固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养； 种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在 温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目 前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置 正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。
2、实验过程
米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制 成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培 养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml） 三角瓶。米曲霉培养物经水溶液萃取， 制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶 活力的测定。
3、实验方法
米曲霉的培养
本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。 三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。 试管斜面培养基： 豆饼浸出汁：100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4小 时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5 波美度。每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷 酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼 脂2克，自然pH。 或采用马铃薯培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼 脂15-20g 加水至1000ml pH自然。
（6）100μ g/m1酪氨酸溶液
精确称取在l05℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步 加入0.1mol/L盐酸(HCl)使溶解，加蒸溜水定容至100m1， 其浓度为1000μg/m1。 再吸取此液10ml以蒸馏水定容至100ml即配成 100μg/m1酪氨酸镕液． 此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁 殖细菌而变质。
三角瓶培养基制备：
米曲霉的培养基1：麸皮80g，面粉（或小 麦粉）20g，水80ml； 米曲霉的培养基2、豆粕粉10g，麸皮90g， 水110ml；
装料厚度：1cm左右； 灭菌：120℃，30-60min；
接种及米曲霉的培养条件：
米曲霉固态培养主要控制条件：温度、湿度， 装料量，基质水分含量。 固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的。 实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂， 则原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备 中进行。这点与液态发酵是不同的。28-30℃， 培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇 瓶，使培养基松散，每隔8小时检查一次，并 摇瓶。培养时间一般为48-70小时。
2、干物质失重的测定
干重失重＝发酵前干重－发酵后干重
3、米曲霉蛋白酶活力的测定
3.1 原理 （1）、福林试剂在碱性情况下极不稳定，可被酚类化合物还 原而呈蓝色反应。 （2）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨 酸及苯丙氦酸等)。 （3）、以酪蛋白为底物，同酶液反应，经一定时间后，加三 氯醋酸，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产 物分开，经过滤后取滤液。用碳酸钠碱化，再加入福林试剂 使之发色，用分光光度计测定。 （4）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水 解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反3.1 标准曲线的绘制
（1）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液
(2)测定步骤 另取 6 支试管按上表编号分别吸取不同浓度的酪氨 酸1ml，各加入0.4mo1/L碳酸钠5m1，再加入已稀释的福 林试剂1m1。 摇匀置于水浴锅中， 40 ℃ 保温发色 20min，在波长 660nm处测定吸光度。一般测3次，取平均值． 以吸光度为纵座标，酪氨酸的浓度为横座标，绘制 成标准曲线。
（5）2%酪蛋白溶液
称取干酪素 2g 加入 0.1mol/L 氢氧化钠 20ml 在水浴中加 热使溶解 ( 必要时用小火加热煮沸 ) ，然后用 pH2.5 乳酸 - 乳 酸钠缓冲液定容至1000ml即成。 配制后应及时使用或放入冰箱内保存。否则极易繁殖 细菌，引起变质。 配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加1~2滴酒 精消泡。 3350 酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸 2~3滴湿润。
三、实验仪器、设备和材料
恒温培养箱或固态培养室，负压式超净 工作台，显微镜，计数器，水浴锅，分 光光度计，试管，茄子瓶，平板及500ml 三角瓶等。 米曲霉菌种（酱油生产用米曲霉）
四、实验分析项目和方法
1、 米曲霉培养效果测定： 米曲霉孢子计数（显微镜观察）；通常 每克曲（干基）孢子数可达100亿以上；
3.3.5 说明
（1）对于同一台分光光度计与同一批福林-酚试剂， 其工作曲线K值可以沿用，当另配福林-酚试剂时，工作曲 线应重作。
（ 2 ）当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时，
其结果会有差异，故蛋白酶活力表示时应注明所用酪蛋白 的生产厂。
五、实验报告内容和数据处理
两种培养基米曲霉培养过程中蛋白酶活性 变化规律。
称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，定容至1000m1。
（4）0.05mol/L pH2.5 乳酸-乳酸钠缓冲液
A液：称取10.6g80-90%乳酸加蒸馏水定容至1000ml。 B液：称取16克70%乳酸钠加蒸馏水定容至1000ml。 取A液16ml与B液1ml稀释1倍即成0.05mol/L pH2.5 乳酸 -乳酸钠缓冲液。
3.3.4 计算
蛋白酶活力单位定义：在 40 ℃ ， pH2.5 下，每分钟水 解酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为1个蛋白酶单位。
式中： K：标准曲线中O·D值为1所相当的酪氨酸的微克数； OD：平行试验管的平均光密度； 4：试管中反应液总体积(毫升)； 10：反应10分钟； N：稀释倍数；W：曲的称取量(克)
3.2 试剂
（1）福林试剂
于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g， 钼酸钠(NaMoO4·2H2O)25g，水700ml，85%磷酸50m1，浓盐酸 1000ml，文火回流10h．加入硫酸锂(Li2SO4)150g，蒸溜水 50m1，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再煮沸l5min，
以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍
有绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至 1000ml。过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸 馏水稀释，即成稀释的福林试剂。
（2）0.4mol/L三氯醋酸(TCA)溶液
称取三氯醋酸65.4g，定容至1000ml。
（3）0.4mol/L碳酸钠溶液