固相萃取-高效液相色谱串联质谱法
高效液相色谱-串联质谱法检测鸡肉中四环素类抗生素残留
分析 检测高效液相色谱-串联质谱法检测鸡肉中四环素类抗生素残留 刘培勇 张惠 达州市食品药品检验所鸡肉是人们日常优质蛋白摄入的重要来源，对于人体健康有重要意义。
但在鸡养殖过程中，部分养殖人员因为缺乏专业知识，对于兽药的使用不太规范，兽药滥用，误用及不遵守休药期等现象普遍存在，导致鸡肉中兽药残留过多，带来较大的健康威胁。
四环素类抗生素对于新生儿骨骼、牙齿的生长有很大影响。
因此，采用高效液相色谱－串联质谱法对鸡肉中四环素类抗生素的检测具有重要意义。
试验材料与方法仪器设备。
高相液相色谱－质谱联用仪（安捷伦６４１０Ａ），色谱柱Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｐｌｃ Ｂｅｈ Ｃ１８（１．７ μｍ，２．１ ｍｍ ｘ１００ ｍｍ），冷冻离心机，旋涡振荡器，氮吹仪、纯水净化机。
材料与试剂。
标准品：四环素、土霉素、金霉素（美国Ｓｉｇｍａ公司）；乙腈和甲醇，色谱纯（德国Ｍｅｒｃｋ公司）；ＥＤＴＡ－２Ｎａ、柠檬酸、Ｎａ２ＨＰＯ４，分析纯（成都市科隆化学有限公司）；去离子水（实验室一级用水）；固相萃取小柱，Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ，６０ ｍｇ／３ｍＬ。
试验方法。
标准溶液的配制：称取三种抗生素５１．０ｍｇ放到５０ｍＬ容量瓶，用甲醇溶液溶解定容，配制成１．０ｍｇ／ｍＬ的标准溶液。
仪器条件控制：流动相：Ａ－０．１％甲酸水；Ｂ－０．１％甲酸乙腈。
在０－７ ｍｉｎ，９０％Ａ线性变化至７０％Ａ；７－８ｍｉｎ，７０％Ａ线性变化至９０％Ａ；８－１０ ｍｉｎ，９０％Ａ；流速：０．３ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温：３０ ℃，进样量：５ μＬ。
质谱条件：ＥＳＩ离子源，正离子扫描；离子源温度：１５０ ℃；脱溶剂气温度：３５０ ℃；脱溶剂气流速：１０ Ｌ／ｍｉｎ；碰撞气：高纯氮气。
样品提取：称取鸡肉样品２ｇ（１０００ ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ）到５０ ｍＬ容量瓶中，加入ＥＤＣＡ－Ｍｃｌｌｖａｉｎｃ缓冲溶液８ ｍＬ，旋涡振荡２ｍｉｎ，４０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ（温度在１０ ℃以下）。
高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿奶粉中核苷酸
第42卷第1期2021年1月Vol42No1Jan'2021质谱学报JournalofChinese MassSpectrometrySociety高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿奶粉中核苷酸陈晶燕，陈万勤，王峰，陈碧莲，周霞，刘柱，梁晶晶（浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州310052）摘要：建立了高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定婴幼儿奶粉中胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌吟核苷酸（AMP）、鸟嘌吟核苷酸（GMP）、尿嘧啶核苷核（UMP）、次黄嘌吟核苷酸（IMP）等5种核苷酸含量。
使用碱性磷酸酶去磷酸化作用，把样品中的核苷酸水解成相应核苷，经选择性硼酸固相萃取净化，ACQUITY UPLC HSS T3（2.1mmX100mmXi.8"m）色谱柱分离，以5mmol/L甲酸铵溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱。
采用电喷雾正离子源，内标法定量，以多反应监测（MRM）模式进行质谱分析°结果表明，奶粉中5种核苷在各自线性范围内的线性关系良好，相关系数均大于0.998,回收率为74.2%〜110.7%，相对标准偏差在0.8%〜5.3%之间（n=6）,CMP、AMP、GMP、UMP、IMP的定量限分别为0.7、0.1、0.7、3.3、0.6mg/100g°该方法灵敏度高、重现性好、定量准确，可用于测定婴幼儿奶粉中核苷酸含量°关键词：高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）；奶粉;核苷酸；核苷；多反应监测（MRM）中图分类号:O657.63文献标志码:A文章编号：10042997（2021）01009308doi：10.7538/zpxb.2019.0156开放科学（资源服务）标识码（OSID）:Determination of Nucleotides in Infant Milk Powder by HighPerformance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryCHENJing-yan,CHEN Wan-qin,WANG Feng,CHEN Bi-lian,ZHOU Xia,LIU Zhu,LIANGJing-jing(.Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou310052,China)Abstract:Nucleotides are biologically important small molecules composed of a nitroge-nousbase,afive-carbon sugar(ribose or deoxyribose)and at least one phosphate group.Theyplayimportantroleinimprovinggastrointestinaltractrepairafterdamage, maintainingtheimmunesystem andregulatinglipoprotein metabolism.Nowadaysthe roleofdietarynucleotideshasbeenpaidincreaseda t entionininfantnutrition.Dietary nucleotidesarecrucialtomaintainingnormalgrowthanddevelopmentininfants.There-forethecontentsofnucleotidesininfantmilkpowderbecomeimportant.A methodfor收稿日期：2019-11-15;修回日期：2020-03-10基金项目：浙江省市场监管局项目（018007）浙江省食品药品监督管理局科技计划项目（019002）资助作者简介：陈晶燕（1993—）,女（汉族），浙江杭州人，助理研究员，从事分析化学研究。
固相萃取-液质联用法测定藤茶中11种真菌毒素
摘 要目的 建立固相萃取-液质联用法同时测定藤茶中11种真菌毒素。方法 藤茶样品加入80%乙腈溶液，高
速均质提取，亲水-亲脂平衡（HLB）固相萃取柱净化富集；以乙腈-5 mmol - L-1醋酸铵（pH值3.0）为流动相，经C18色谱柱梯
度洗脱分离，采用电喷雾（ESI）离子源、多反应监测（MRM）及正负离子模式采集数据，以基质匹配标准曲线外标法进行定
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jig • mL-1,批号：1H01J23）, FB2 （50 »g • mL-1,批号: 1H01J23） ,AFM1（10 ig - mL—1,批号：1I00A11）,T-2 毒素 （100 ig • mL—1，批号：1H00I14）, DON （100 ig • mL—1,批 号：1H01B10）,ZEN（25 ig - mL—1,批号：1K00H29）,OTA （10 ig - mL—1，批号：1H01B14）均购自青岛普瑞邦生物工 程有限公司;乙腈、甲醇为色谱纯,醋酸铵为质谱纯，水为 超纯水。 1.3样品49批藤茶样品信息见表1,样品由华中科 技大学同济医学院附属同济医院药学部方建国教授鉴 定, 均为显齿蛇葡萄 Ampellosis grossedentata （ Hand.Mazz.） W.T. Wang 的炮制品。 2方法与结果 2.1色谱条件 美国菲罗门Kinetex XB-C18色谱柱 （100 mmX2.1 mm,1.7 im）;以 5 mmol • L-1 醋酸铵 （pH值3.0） （A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱［0~ 5 min, 10%B ;>5 ~ 6 min, 10%B—20%B ; >6 - 30 min, 20%Bt45%B；>30~35 min,45%B—10%B］；流速为 0.2 mL • min-1 ,柱温 30 T。进样量 4 iL［28-29］ o 2.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（electrospray ionization source, ESI ）,多反应监测模式（multiple reaction monitoring, MRM ）,正、负两种模式进行扫 描［28-29］，各化合物质谱参数见表2,对照品及样品总离 子流图见图1。 2.3混合对照品溶液的配制分别精密吸取上述对 照品适量，加甲醇配制成AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、 AFM1 ,FB1、FB2、T-2 毒素、ZEN、OTA 以及 DON 浓度依 次为 46.5,30,46.5,35,100,50,50,600,75,100,2 000 ng - mL—1的混合对照品溶液。 2.4供试品溶液的制备取藤茶粉末［过三号筛，筛 孔内径（355±13）im,50目］约5 g,精密称定，置均质 瓶，精密加入80%乙腈溶液100 mL,均质器上提取45 s,8 000 r • min-1 离心20 min（ r = 10 cm）,精密量取上 清液20 mL,置50 mL量瓶，加水稀释至刻度，摇匀。 精密吸取稀释后的溶液20 mL,减压浓缩至约5mL,放 冷，离心，孔径0.22 im滤膜滤过，缓慢通过已经活化 好的固相萃取柱（依次用甲醇和水各5 mL淋洗活 化），直至空气进入柱子，先用纯化水5 mL淋洗，再用 甲醇5 mL洗脱，收集洗脱液，于平行蒸发仪上浓缩至 近干，用50%甲醇转移并定容至2 mL,放冷，离心，孔 径0.22 im滤膜滤过，即得供试品溶液。 2.5线性关系与灵敏度考察 为考察基质效应对方 法灵敏度的影响,将上述混合对照品溶液分别用空白 基质和50%甲醇稀释成系列混合标准工作液，以峰面 积对各个真菌毒素的质量浓度作线性回归，绘
固相萃取-高效液相色谱法测定养殖污水中强力霉素残留
固相萃取-高效液相色谱法测定养殖污水中强力霉素残留一、引言随着养殖业的发展，养殖污水中的抗生素残留问题日益严重，其中强力霉素是一种广泛使用的抗生素，其残留会对环境和人体健康造成一定的危害。
对养殖污水中强力霉素的残留情况进行监测和分析具有重要意义。
本文将采用固相萃取-高效液相色谱法（SPE-HPLC）对养殖污水中强力霉素进行测定，为养殖污水治理和环境保护提供科学依据。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）仪器设备：高效液相色谱仪（HPLC）、固相萃取仪（SPE）（2）色谱柱：C18反相色谱柱（3）色谱条件：流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱（4）样品：养殖污水样品（5）标准品：强力霉素标准品2. 实验方法（1）样品处理：将养殖污水样品通过固相萃取仪进行处理，提取强力霉素残留物质。
（2）色谱分析：将提取的样品通过高效液相色谱仪进行分析，采用梯度洗脱的方法进行分离和定量测定。
三、实验结果经过对养殖污水样品的固相萃取和高效液相色谱分析，得到了如下实验结果：（1）强力霉素标准曲线：在不同浓度下制备了强力霉素的标准品，并进行了色谱分析，得到了相应的标准曲线。
（2）养殖污水样品分析：对养殖污水中强力霉素残留进行了测定，得到了样品中强力霉素的含量。
四、实验讨论通过本次实验，我们成功地采用了固相萃取-高效液相色谱法对养殖污水中强力霉素进行了测定。
通过测定结果我们可以得知养殖污水中强力霉素的残留情况，为环境保护和治理提供了科学依据。
六、参考文献1. 赵明芳等. 高效液相色谱法测定环境水样中的强力霉素残留[J]. 环境科学, 2008, 29(5): 1399-1402.2. 李红波等. 固相萃取-高效液相色谱法测定水体中微量强力霉素的研究[J]. 分析测试学报, 2011, 30(5): 34-37.。
固相萃取-高效液相色谱法测定地表水中的苯并三唑和苯并噻唑
为 了获得 良好 的分 离度 ， 本文 考察 了 Ａ ｇ ｉ ｌ ｅ ｎ ｔ 公
司的 Ｚ ０ Ｒ Ｂ Ａ Ｘ Ｓ Ｂ — Ｃ １ ８（ ２ ５ ０ ｍｍ ×４ ． ６ ｍｍ ， ５ ｔ ｘ ｍ） 、 Ｚ Ｏ Ｒ Ｂ Ａ Ｘ Ｅ ｃ ｌ ｉ ｐ ｓ ｅ Ｘ Ｄ Ｂ — Ｃ １ ８（ １ ５ ０ ｍＥ Ｘ ４ ． ６
・
ｌ ４ ０・
色
谱
第３ １ 卷
及工 业循 环冷 却 水 系 统 。 ； 苯 并 噻 唑 常 用 于 橡 胶 工业 生产 过程 中的促 进 剂 ， 另 外 也广 泛 用 于 防 腐 剂 及化 工 中间体 。 等。
由于苯并 三 唑 和苯 并 噻 唑 类 化合 物 为 水 溶性 ， 且 生物 降解 性及 吸 附能 力 均 较 差 ， 因此 经 过废 水 处 理 厂处 理后 的工 业和 生活废 水 中只有 少部 分苯并 三
４ ０ ． ０ ０ 、 ８ ０ ． Ｏ ０ ｍｇ ／ Ｌ的 系列浓 度 的混合 标准溶 液 。
１ ． ３ 色谱 条 件 Ｚ Ｏ Ｒ Ｂ Ａ Ｘ Ｓ Ｂ － Ｃ １ ８色谱 柱 （ ２ ５ ０ ｍＥ ×４ ． ６ ｍｍ ， ５ ｍ； Ａ ｇ ｉ ｌ ｅ ｎ ｔ 公司） ； 流 动相 为 甲醇 一 水（ ５ ５ ： ４ ５ ， ｖ ／ ｖ ） ， 流速 １ ｍＬ ／ ｍｉ ｎ； 紫外 光 检 测 波 长 ２ ５ ４ Ｒ Ｅ； 进 样
苯并 三 唑 （ ５ － ｍｅ ｔ ｈ ｙ ｌ 一 １ Ｈ－ ｂ ｅ ｎ ｚ ｏ ｔ ｒ ｉ ａ ｚ ｏ ｌ ｅ ，５ － Ｍ— Ｂ Ｔ） 、 ５ ， ６ － 二 甲基 苯 并 三 唑 （ ５ ， ６ 一 ｄ ｉ ｍｅ ｔ ｈ ｙ ｌ 一 １ Ｈ－ ｂ ｅ ｎ ｚ ｏ ｔ ｒ ｉ —
高效液相色谱串联质谱法测定人体内30种氨基酸
高效液相色谱串联质谱法测定人体内30种氨基酸一、本文概述随着现代生物技术和分析化学的飞速发展，对于生物体内复杂化学成分的分析和测定要求越来越高。
氨基酸作为生物体内蛋白质的基本构成单元，其种类、数量及代谢状态的检测对于理解生命活动的本质、疾病的诊断与预防等方面具有重要意义。
高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）作为一种高灵敏度、高分辨率的分析技术，已被广泛应用于生物样品中氨基酸的定量分析。
本文旨在探讨利用高效液相色谱串联质谱法测定人体内30种氨基酸的方法。
文章将首先介绍氨基酸的重要性及其在人体内的代谢过程，随后详细阐述HPLC-MS/MS技术的基本原理及其在氨基酸分析中的优势。
接着，文章将重点描述样品的采集与处理、色谱条件的优化、质谱条件的设定以及数据分析方法等实验步骤。
文章还将对实验结果的可靠性进行验证，并讨论该方法在临床医学、营养学及药物研发等领域的应用前景。
通过本文的阐述，读者可以对高效液相色谱串联质谱法测定人体内30种氨基酸的方法有一个全面、深入的了解，为相关领域的研究提供有益的参考和借鉴。
二、实验原理高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）是一种先进的分析技术，结合了高效液相色谱（HPLC）的高分离能力和质谱（MS/MS）的高灵敏度和高选择性，从而实现对复杂生物样品中多种氨基酸的高效、快速和精确测定。
在HPLC-MS/MS分析中，样品首先通过高效液相色谱进行分离。
高效液相色谱利用不同氨基酸在固定相和流动相之间的分配系数差异，将它们从复杂的生物样品中分离出来。
然后，分离后的氨基酸被引入质谱系统进行进一步的分析和检测。
在质谱系统中，氨基酸分子被离子化并产生带电离子，这些离子在电场的作用下被加速并通过一个或多个质量分析器。
质量分析器根据离子的质荷比（m/z）将它们分离，形成质谱图。
通过对比标准品的质谱图，可以确定样品中氨基酸的种类。
通过选择特定的母离子和子离子对，可以实现多重反应监测（MRM）模式，进一步提高方法的特异性和灵敏度。
高效液相色谱串联质谱法测定人血浆中拉莫三嗪的浓度
高效液相色谱串联质谱法测定人血浆中拉莫三嗪的浓度彭向东;谭志荣;周淦;王医成;陈尧;周宏灏【摘要】Objective To develop a simple, quick and sensitive method of liquid chromatography-elec-trospray tandem mass spectrometry to determine lamotrigine in human plasma. Methods After precipitation with methanol, plasma sample was separated on a Thermo Hypurity C18 column (4. 6 × 250 mm,5 μm) ,with mobile phase methanol: 0. 1% formate acid (80 : 20) and flow rate 0. 20 mL/min. The eletrospray tandem mass spectrum in the positive mode and multiple reaction monitor (MRM) were used to detect the concentration of lamotrigine. Results The response was linear over the range of 8. 19 - 2 096 ng/mL for lamotrigine. The relative recovery of lamotrigine was in the range of 80%-120%. The interday and intraday relative standard deviations were less than 15%. Conclusions This method is simple, quick and reproducible for pharmacokinetics and bioequivalence research of lamotrigine.%目的建立简单、快速和灵敏的高效液相色谱串联质谱法以测定人血浆中拉莫三嗪的浓度.方法血浆样品经甲醇直接沉淀蛋白后,采用Thermo Hypurity C18柱(4.6×250 mm,5 μm)分离,流速为0.20 mL/min,以甲醇∶0.1％甲酸=80∶20为流动相等度洗脱.通过电喷雾离子源进入质谱,以二级质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)方式进行检测.结果拉莫三嗪的线性范围为8.19～2 096 ng/mL,平均相对回收率在80％～120％范围内,日内和日间变异均＜15％.结论本法简单、快速、重现性好,能够用于拉莫三嗪的人体药代动力学性研究.【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2012(039)001【总页数】4页(P64-67)【关键词】液相色谱质谱联用;电喷雾质谱;拉莫三嗪【作者】彭向东;谭志荣;周淦;王医成;陈尧;周宏灏【作者单位】中南大学湘雅医学院临床药理研究所长沙 410078;中南大学湘雅三医院药剂科长沙 410013;中南大学湘雅医学院临床药理研究所长沙 410078;中南大学湘雅医学院临床药理研究所长沙 410078;中南大学湘雅医学院临床药理研究所长沙 410078;中南大学湘雅医学院临床药理研究所长沙 410078;中南大学湘雅医学院临床药理研究所长沙 410078【正文语种】中文【中图分类】O657拉莫三嗪片为苯三嗪类的广谱抗癫药。
超高速液相色谱--串联质谱联用法检测食品中灭蝇胺残留量
超高速液相色谱--串联质谱联用法检测食品中灭蝇胺残留量摘要】目的：建立超高速液相色谱--串联质谱联用法检测食品中灭蝇胺残留量的方法。
方法：样品匀浆后经乙腈水提取酸化后经以C18固相萃取柱净化，应用超高速液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱仪多离子反应监测（MRM）定量法检测。
结果：经方法学确认，该方法对灭蝇胺的检出限为 1.0ug/kg，定量限为 1.0ug/kg。
在5.0～200.0的线性范围内，相关系数r>0.9999，回收率78.2%～95.6。
结论：方法灵敏度高、定量准确、测定浓度范围广，是食品中灭蝇胺含量检测的理想方法。
【关键词】超高速液相色谱--串联质谱联用法多离子反应监测（MRM）固相萃取灭蝇胺【中图分类号】R155.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）35-0103-02灭蝇胺（Cyrov maziane）是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是强内吸性昆虫生长调节剂。
主要用于防治菜豆、叶菜类和瓜类的美洲斑潜蝇和潜叶蝇等农业害虫。
是我国农业部推荐的无公害农药。
为了保证食用安全，我国已制定了其在农产品中的残留限量是0.2mg/kg,由于灭蝇胺可以添加到动物饲料中用于控制畜禽养殖场苍蝇的生长发育，农业部将灭蝇胺批准为三类新兽药。
许多养殖户没有严格按照休药期的规定，会造成鸡蛋和肉等动物产品中的药物残留[1]。
现有的灭蝇胺检测方法多采用气相色谱-质谱法[2]和高效液相色谱法（HPLC）[3-4]由于灭蝇胺属于极性化合物，需衍生才能气化，因此采用GC-MS检测时过程较为繁琐：HPLC法易受杂质干扰且灵敏度较低。
本研究建立检测食品中灭蝇胺残留量的超高速液相色谱-串联质谱联用法，其中食品包括谷物、水果、蔬菜及禽肉、内脏、奶、蛋等不同种类样品。
1 材料与方法1.1 仪器与试剂Acuqity-TOQ超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC-MS/MS）,Acquilty UPLC BEHC18色谱柱（Waters公司），灭蝇胺标准品（纯度99.0%，德国 Dr.Ehrenstofer Gmbh公司）。
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固相萃取-高效液相色谱串联质谱法 测定原料奶中5种环境雌激素残留量的研究 李雪1,2，牟光庆1，陈历俊1,2,*，姜铁民2 （1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034； 2.北京三元食品股份有限公司，北京100076）
摘要：建立固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定原料乳中环境雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A）的方法。原料乳用NH2-SPE固相萃取小柱进行富集，旋转蒸发浓缩后，采用高效液相色谱串联质谱法测定。实验结果表明：各待测物在0.01 ~0.5μg/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.9978，加标回收率为68.5%~105.6%，RSD为2.56%~7.59%，最低检出限为0.22 ~0.56μg/L（S/N=3）。本方法操作简便，快速灵敏，适合于牛奶中痕量环境雌激素的残留分析检测。 关键词：高效液相色谱串联质谱，固相萃取，环境雌激素，原料奶，残留检测 Research of the determination of 5 kinds of environmental estrogens residues in raw milk by solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry LI Xue1,2,MU Guang-qing1,CHEN Li-jun1,2,*,JIANG Tie-min2 （1. College of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University , Dalian 116034,China; 2. Beijing Sanyuan Foods Co., Ltd, Beijing 100076,China）
Abstract: A solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass
spectrometry method for simultaneous determination of environmental estrogens including estrone,estradiol,estriol,diethylstilbestrol and bisphenol A in raw milk was established. 5 kinds of environmental estrogens were extracted from the raw milk sample by a NH2-SPE column, and concentrated with a rotary evaporator. The extract was analyzed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometric.Results showed that:a good linear range from 0.01~0.5μg/mL with correlation coefficient of above 0.9978 was obtained.The extraction recovery were 68.5%~105.6% and the relative standard deviation were 2.56%~7.59%.The limit of detection was 0.22~0.56μg/L(S/N=3).The described method was simple,sensitive and accurate.
*通讯作者：陈历俊，chlj@263.net。 作者简介：李雪(1986-)，女，硕士研究生，研究方向：食品安全。 基金资助：奶牛产业技术体系北京市创新团队建设项目；国家科技部 “863”计划(2011AA100903) 。 Key words: high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; solid phase extraction ; environmental estrogens; raw milk; residue detection 中图分类号：TS252.1 文献标识码：A
环境雌激素[1-2]属于环境内分泌干扰物，是指由于人类活动而释放发到环境中的一类有害化学物质，这些物质进入生物体后能够扰乱生物体内分泌功能，通常被称为“外因型内分泌扰乱化学物质”。原料奶的质量是乳制品的根本，是保证奶制品食用安全、维护人类健康的基础。原料乳中是否存在雌激素至关重要，其中若残留激素，则对人体有一定的毒性[3]。 作者对原料乳中5种雌激素进行了分析检测，其中既有内源性雌激素（雌酮、雌二醇和雌三醇）也有环境雌激素（己烯雌酚和双酚A），都属于人工合成或自然界存在的，它们可通过食物链或直接接触等多种途径进入体内，模拟动物体内内源性激素，具有协同或拮抗正常的内源性激素的作用，干扰内分泌功能，多被称为环境雌激素。 近来，对牛乳中环境激素检测的研究较多，常用的方法有：气相色谱-质谱（GC-MS）法、高效液相色谱（HPLC）法、酶联免疫吸附测定（ELISA）法、荧光分析法等[4-11]。例如张红英等人[11]的研究是在有机溶剂提取的基础上对样品进行衍生，然后采用气相色谱-质谱法检测原料乳，但是前处理过程复杂，并且接触大量的有毒试剂，需要长时间的衍生化过程。而本文用固相萃取替代衍生过程，优化了提取、净化、色谱测定等参数，成功建立了固相萃取、LC-MS测定原料乳中5种环境雌激素残留量的方法。不仅提高了分析样品的工作效率，还在优化前处理方法的基础上，取得了比较满意的结果。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 原料奶 采自北京市11个不同的奶牛养殖场；雌三醇标准品 纯度97.4%、雌二醇标准品 纯度96.7% 中国药品生物制品检定所；雌酮标准品 纯度99.5%、双酚A标准品 纯度98.5% 德国Dr. Ehrenstorfer 公司；己烯雌酚标准品 纯度99.7%，中国计量科学研究院；甲醇 HPLC级、乙腈 LC/MS级 美国Fisher公司；氮气、氩气（>99.999%）；超纯水 美国Milli-Q纯水系统制；其他试剂均 为市售国产分析纯试剂。 ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪、Quattro Premier Micromass质谱仪、MassLynx数据处理系统 美国Waters公司；KQ-500DE医用数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Sigma 2K-15高速冷冻离心机 博劢行仪器有限公司；Cleanert NH2-SPE固相萃取柱 500mg/3mL美国Agela公司；旋转蒸发仪RE-52A 上海振捷实验设备有限公司；SHB-Ⅲ型水循环真空泵 郑州市上街区仪器厂。 1.2 LC-MS/MS条件 1.2.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3（2.1×50mm，1.8μm）；流动相：乙腈-甲醇（4：1，A）与0.01%氨水（B），流速0.3mL/min，梯度洗脱程序见表1；柱温35℃；样品室温度25℃；进样量为10μL。 表1 梯度洗脱程序 Table.1 The program of gradient elution 时间（min） A（%） B（%） 梯度变化曲线 0 40 60 3.0 50 50 6 5.0 80 20 6 5.5 80 20 6 5.6 40 60 6 8.5 40 60 6 1.2.2 质谱条件 电喷雾离子源；负离子扫描模式；毛细管电压2.37kV；离子源温度120℃；去溶剂气温度450℃；去溶剂气流量800L/h；锥孔气流量50L/h；碰撞气体为氩气，碰撞气流速度为0.14mL/min，多反应检测（MRM）模式检测。 1.3 标准溶液的配制 分别称取标准品10.0mg于10mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀释定容，得到质量浓度为1.0g/L的单标准储备溶液，于-20℃冰箱保存备用。分别取上述储备液用乙腈-水（1:1，v/v）或乙腈-0.01%氨水（1:1，v/v）稀释为1mg/L的标准溶液用来优化质谱条件。 各取单标准储备液适量，用初始流动相做稀释液配制所需浓度的混合标准溶 液。 1.4 样品前处理 量取2mL原料奶样品于15mL离心管中，加入10mL乙腈，漩涡混匀1min，于25℃超声25min，在4℃下以12000r/min离心10min，移取上清液，待上清液恢复至室温后过NH2柱。在NH2柱中加入约2cm高无水硫酸钠（经650℃烘烤4h，保存在干燥器内，冷却后备用），下接旋转瓶放在固定架上。加样前先用4mL乙腈-甲苯（3：1）预洗柱，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将上清液转移到净化柱上，再用25mL乙腈-甲苯（3：1）洗涤柱子，收集所有流出物于旋转瓶中并在40℃水浴中旋转蒸发浓缩至近干。用1mL乙腈/甲醇4:1-0.01%氨水（2:3，v/v）溶液溶解残渣，经0.22μm滤膜过滤，移入1.5mL自动进样器样品瓶中，供HPLC-MS/MS测定。 2 结果与讨论 2.1 样品处理方法的选择 2.1.1 提取溶剂的选择 这5种环境雌激素都属于疏水性有机化合物，易溶于大多数有机溶剂。本实验采用超声提取方式对样品进行提取，先后比较了甲醇、叔丁基甲醚、乙腈和乙酸乙酯4种溶剂的提取效果，得到5种环境雌激素的回收率，如图1所示。结果发现，乙腈能有效沉淀蛋白质，其总提取效率最高，且提取液清澈，本地干扰少；由于牛乳本身含有很多脂溶性化合物，以叔丁基甲醚和乙酸乙酯为提取剂时乳化现象严重，即使在12000r/min条件下离心10min也不能很好的消除乳化现象，从而造成提取液中含有大量的杂质，给接下来的净化工作带来了很大的困难，而且乙酸乙酯提取环境雌激素的回收率低于20%；甲醇提取效果没有乙腈好，且甲醇很难与水相分层，提取液中残存少量杂质，不利于净化过程，易造成固相萃取小柱堵塞。实验也考察了在提取过程中加入三氯乙酸和0.1%乙酸溶液对蛋白质和脂肪的沉淀效果，以期能得到更纯净的提取液，结果表明，加入0.1%乙酸溶液的样品过固相萃取柱时会使小柱堵塞；而加入三氯乙酸溶液的样品提取率反而降低，因此，选择乙腈作为本实验的提取溶剂。通过不同提取温度（20℃、25℃、30℃）和超声时间（20min、25min、30min）对提取效率的影响发现，在25℃下超声25min时提取效率最高，故本实验选择在此条件下进行提取。