【CN110075122A】一种肝癌治疗性外泌体药物【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910383325.5(22)申请日 2019.05.09(71)申请人 复旦大学附属中山医院地址 200032 上海市徐汇区枫林路180号(72)发明人 周俭 樊嘉 胡捷 刘维峰 王征 周凯乾 (74)专利代理机构 上海申浩律师事务所 31280代理人 贾师英(51)Int.Cl.A61K 35/13(2015.01)A61K 9/50(2006.01)A61K 47/46(2006.01)A61K 31/7105(2006.01)A61P 35/00(2006.01)C12N 15/90(2006.01)C12N 9/22(2006.01)C12N 15/867(2006.01)
(54)发明名称一种肝癌治疗性外泌体药物(57)摘要本发明公开了一种肝癌治疗性外泌体药物，其为VPS35基因表达下调的肝癌细胞分泌的外泌体，并且导入了用于治疗肝癌的微小RNA分子。本发明的肝癌治疗性外泌体药物能够用于肝癌临床治疗，降低高危患者术后复发率，抑制肝癌进展，
从而改善肝癌切除或肝移植的预后。权利要求书1页 说明书9页
序列表1页 附图2页CN 110075122 A2019.08.02
CN 110075122
A1.一种肝癌治疗性外泌体药物，其为VPS35基因表达下调的肝癌细胞分泌的外泌体，并且导入了用于治疗肝癌的微小RNA分子。2.如权利要求1所述的肝癌治疗性外泌体药物，其特征在于，所述肝癌细胞来源于肝癌手术切除或者肝移植术后肿瘤组织。3.如权利要求1所述的肝癌治疗性外泌体药物，其特征在于，所述微小RNA分子是miR-26a。4.一种制备如权利要求1所述肝癌治疗性外泌体药物的方法，其包括如下步骤：1)通过RNA干扰技术或者基因编辑技术下调或敲除肝癌细胞的VPS35基因，得到VPS35基因表达下调的肝癌细胞；2)培养步骤1)中得到的VPS35基因表达下调的肝癌细胞，收集其分泌的外泌体；3)通过电转导或者化学转导法将微小RNA分子导入到步骤2)中得到的外泌体中，组装得到外泌体药物。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术是CRISPR/Cas9系统。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述RNA干扰技术包括如下操作步骤：a)针对VPS35基因，设计靶向该基因的siRNA；b)设计用于表达siRNA的shRNA；c)将shRNA编码序列克隆入质粒，构建表达shRNA的慢病毒；d)用步骤c)构建的慢病毒转化肝癌细胞。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述siRNA为SEQ ID NO:2。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述shRNA的正义链为SEQ ID NO:3，反义链为SEQ ID NO:4。9.如权利要求1至3中任一项所述的肝癌治疗性外泌体药物在制备抗肝癌药物中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，通过将所述抗肝癌药物与体外Organoid模型共培养、并且/或者通过尾静脉注射进入肝癌PDX动物模型体内予以验证肝癌抑制效果后，
再施用于肝癌细胞来源的肝癌手术切除患者或者接受肝移植术的肝癌患者。权 利 要 求 书1/1页
2CN 110075122 A
外泌体提取试剂盒及其在肿瘤等疾病液体活检中的应用[发明专利]
![外泌体提取试剂盒及其在肿瘤等疾病液体活检中的应用[发明专利]](https://360docs-1393072327.cos.ap-beijing.myqcloud.com/a67aa6a6767f5acfa0c7cd50.webp)
专利名称：外泌体提取试剂盒及其在肿瘤等疾病液体活检中的
应用
专利类型：发明专利
发明人：张灏
申请号：CN201510508129.8
申请日：20150818
公开号：CN105087546A
公开日：
20151125专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及提取RNA的方法、试剂盒以及RNA的应用。该方法包括：S1、将生物样品离心
以获得上清液；S2、在上清液中加入外泌体沉淀溶液，在混匀、离心之后获得外泌体沉淀物；S3、在
外泌体沉淀物中加入总RNA抽提试剂以及等体积的酒精，剧烈混合之后加入吸附柱；S4、离心吸附
柱，且之后加入RNA预洗液、RNA清洗缓冲液以及去离子水反复冲洗并离心以获得总RNA。还涉及
从体液的外泌体中提取的融合RNA和其他肿瘤特异性RNA在肿瘤早期诊断、筛查、诊治方面的应用。
通过从外泌体中提取融合RNA和其他肿瘤特异性RNA，从而将其用于例如食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤
的早期诊断、筛查，从而简单地实现了创伤小，病人依从性好、收集储存方便的癌症液体诊断。
申请人：张灏
地址：515014 广东省汕头市饶平路7号汕头大学肿瘤医院
国籍：CN
代理机构：深圳市顺天达专利商标代理有限公司
代理人：邹秋菊
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【CN109957621A】一种用于测定人循环血外泌体环状RNA的方法及其试剂盒【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日
(21)申请号 201910258172.1
(22)申请日 2019.04.01
(71)申请人 中国人民解放军海军军医大学国家肝癌科学中心地址 201805 上海市嘉定区安亭镇前炬路366号
(72)发明人 王红阳 李亮 危晏平 梁驰 任一彬
(74)专利代理机构 上海申新律师事务所 31272代理人 车超平
(51)Int.Cl.C12Q 1/6886(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01)
(54)发明名称一种用于测定人循环血外泌体环状RNA的方法及其试剂盒(57)摘要本发明涉及一种用于测定人循环血中外泌体环状RNA的方法及试剂盒，该方法包括：采集人静脉血，离心，收集血浆样本；对血浆样本进行外泌体分离及总RNA抽提，获得总RNA样品；测定RNA样品的浓度，并取适量的RNA样品进行逆转录反应，获得逆转录产物cDNA；采用如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2的扩增引物对逆转录产物cDNA进行PCR扩增，并根据扩增产物分析测定外泌体中环状RNA的含量。本发明还涉及一种人血清外泌体环状RNA Circ-CDYL作为肝癌的诊断标记物的应用。本发明通过对人血浆外泌体分离及RNA抽提步骤的优化，并针对目的基因设计特异性引物，可从少量人血浆样本中分离外泌体，快速定量环状RNA的表达量，并可通过分析肿瘤等病人与健康人群的环状RNA的差异，用于肝癌的诊断和高
危人群监测。权利要求书1页 说明书8页
序列表2页 附图3页CN 109957621 A2019.07.02
CN 109957621
A1.一种用于测定人循环血样本外泌体环状RNA的试剂盒，其特征在于，包括如SEQ ID
NO:1-SEQ ID NO:2所示序列的扩增引物和如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示序列的内参引
物。
2.一种用于非诊断目的的测定人循环血外泌体中环状RNA的方法，其特征在于，包括如
干细胞外泌体在老年肿瘤治疗中的研究进展
国际老年医学杂志 ２０２１年３月 第４２卷第２期 ＩｎｔＪＧｅｒｉａｔｒ，Ｍａｒｃｈ２０２１，Ｖｏｌ．４２Ｎｏ．２２０２１国际老年医学杂志编辑部 ２０２１ｂｙｔｈｅＥｄｉｔｏｒｉａｌＯｆｆｉｃｅｏｆＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｒｉａｔｒｉｃｓ
广东省医学科学技术研究基金（Ｃ２０１６０６３）王媛媛和丁 宇为并列第一作者通讯作者：丁克祥，电子邮箱ｄｉｎｇｋｘｄｉｎｇｙｕ＠１２６ｃｏｍ；戴 萌，电子邮箱：檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏殏殏殏
ｄｍ４２２９８＠１２６ｃｏｍ综 述干细胞外泌体在老年肿瘤治疗中的研究进展王媛媛１ 丁 宇１ ＴｈａｍＳｅｎｇＫｏｎｇ２ 冷 芬１ 毛 娟１ 朱 玲１ 丁克祥３ 戴 萌１１南方医科大学南方医院，广州 ５１０５１５；２马来西亚阿尔卑斯医学中心，吉隆坡 ６３０００ 马来西亚；３南方医科大学公共卫生学院，广州 ５１０５１５ ［摘 要］ 老年肿瘤恶性程度高、转移速度快，且并发症和恶病质多见，特别是合并多种慢性疾病，临床治疗具有很大难度。目前，对老年肿瘤大多数采用姑息治疗、保守治疗、消极治疗、甚至放弃治疗，使患者错过了最佳治疗期。干细胞外泌体可以传递和运载某些治疗性核酸、蛋白和靶向药物等抗癌药物或制剂，是较为理想的肿瘤药物传递载体，且可选择性地结合肿瘤内皮细胞传递到癌组织。另外在某些方面，间充质干细胞对肿瘤生长有不同的作用，包括改变肿瘤细胞生长微环境、调控肿瘤细胞某些生物信息和遗传特性、抑制已形成肿瘤的进展、明显减少在治疗过程中对其他正常组织的副作用。不过，干细胞外泌体用于肿瘤临床治疗的应用研究仍处于基础医学与临床应用研究阶段。随着对干细胞外泌体的深入研究，其在未来可能对于肿瘤干细胞治疗、药物递送等领域发挥重要作用。 ［关键词］ 干细胞；外泌体；老年肿瘤；治疗；研究进展 ｄｏｉ：１０３９６９／ｊｉｓｓｎ１６７４－７５９３２０２１０２０１４ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＳｔｅｍＣｅｌｌＥｘｏｓｏｍｅｓｆｏｒｔｈｅＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＣａｎｃｅｒｉｎＯｌｄｅｒＰａｔｉｅｎｔｓＷａｎｇＹｕａｎｙｕａｎ１，ＤｉｎｇＹｕ１，ＴｈａｍＳｅｎｇＫｏｎｇ２，ＬｅｎｇＦｅｎ１，ＭａｏＪｕａｎ１，ＺｈｕＬｉｎｇ１，ＤｉｎｇＫｅｘｉａｎｇ３，ＤａｉＭｅｎｇ１１ＮａｎｆａｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０５１５；２ＡＬＰＳＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＭａｌａｙｓｉａ，ＫｕａｌａＬｕｍｐｕｒ ５８２００，Ｍａｌａｙｓｉａ；３ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０５１５ＡｕｔｈｏｒｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｅｑｕａｌｌｙｔｏｔｈｉｓｐａｐｅｒＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＤｉｎｇＫｅｘｉａｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉｎｇｋｘｄｉｎｇｙｕ＠１２６ｃｏｍ；ＤａｉＭｅｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｍ４２２９８＠１２６ｃｏｍ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｃａｎｃｅｒｉｎｏｌｄｅｒｐａｔｉｅｎｔｓｉｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙｈｉｇｈｍａｌｉｇｎａｎｃｙ，ｒａｐｉｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ｍｏｒｅｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄｃａｃｈｅｘｉａ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｗｉｔｈａｖａｒｉｅｔｙｏｆｃｈｒｏｎｉｃｄｉｓｅａｓｅｓ，ａｎｄｉｓｈａｒｄｔｏｔｒｅａｔ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｐａｌｌｉａｔｉｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｎｅｇａｔｉｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｅｖｅｎｇｉｖｉｎｇｕｐｔｒｅａｔｍｅｎｔａｒｅａｄｏｐｔｅｄｆｏｒｏｌｄｅｒｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃａｎｃｅｒ，ｗｈｉｃｈｍａｋｅｓｐａｔｉｅｎｔｓｍｉｓｓｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｅｒｉｏｄ．Ｓｔｅｍｃｅｌｌｅｘｏｓｏｍｅｓｃａｎｄｅｌｉｖｅｒａｎｄｃａｒｒｙｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄｄｒｕｇｓ．Ｔｈｅｙａｒｅｉｄｅａｌｃａｒｒｉｅｒｆｏｒａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙ，ａｎｄｃａｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙｂｉｎｄｔｏｔｕｍｏｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｔｏｄｅｌｉｖｅｒｄｒｕｇｓｔｏｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅ．Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃａｎｃｈａｎｇｅｔｈｅｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ｒｅｇｕｌａｔｅｓｏｍｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｆｏｒｍｅｄｔｕｍｏｒｓ，ａｎｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｓｉｄｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｏｔｈｅｒｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓｄｕｒｉｎｇｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｅｘｏｓｏｍｅｓｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃａｎｃｅｒｉｓｓｔｉｌｌｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｓｔａｇｅ．Ｗｉｔｈｔｈｅｉｎ－ｄｅｐｔｈｓｔｕｄｙｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｅｘｏｓｏｍｅｓ，ｔｈｅｙｍａｙｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙａｎｄｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｉｎｔｈｅｆｕｔｕｒｅ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｓｔｅｍｃｅｌｌ；Ｅｘｏｓｏｍｅｓ；Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｔｕｍｏｒ；Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｒｅｓｅａｒｃｈａｄｖａｎｃｅ—４１１—国际老年医学杂志 ２０２１年３月 第４２卷第２期 ＩｎｔＪＧｅｒｉａｔｒ，Ｍａｒｃｈ２０２１，Ｖｏｌ．４２Ｎｏ．２王媛媛，等．干细胞外泌体在老年肿瘤治疗中的研究进展 老年肿瘤学是当今老年医学的重要内容，其恶性程度高、转移速度快、治疗耐受性差，而且老年肿瘤并发症和恶病质多见，特别是合并多种慢性疾病，在接受常规肿瘤治疗后，发生不良反应的概率大大提升。因此，目前临床治疗老年肿瘤患者均采用姑息治疗、保守治疗、消极治疗、甚至放弃治疗，使得肿瘤患者错过了最佳治疗期。当然，临床也有针对老年肿瘤患者的积极治疗策略，但每种治疗方法仍然存在这样或那样的问题、不足或缺陷。精准医疗是以老年肿瘤患者自身基因组信息为基础，结合蛋白质组、代谢组等相关信息，从基因组中分析和鉴别老年肿瘤患者的疾病差异，为老年患者提供最合理的治疗方案，在减少老年肿瘤患者不良反应的基础上，达到临床治疗效果有效性的最大化。其中，干细胞外泌体正是对老年肿瘤患者精准医疗研究新的方向之一，也是具有一定希望和应用前景的老年肿瘤临床亚细胞与分子靶向药物结合治疗的新技术之一。因此，本文综述干细胞外泌体在当前肿瘤治疗中的基础与临床研究进展，展望其在未来老年临床肿瘤治疗与干预中的应用。１ 干细胞及其外泌体概述 人类干细胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＳＣｓ）的发现、分离制备及体外培养扩增及其基础与临床应用研究成果被全世界大多数科学家认为未来最有价值和希望用于临床多种疾病治疗和干预的理想种子细胞和明星万能细胞。干细胞是一类具有强大增殖、多向分化、再生修复及自我更新的原始细胞和种子细胞，可从多种组织或器官中分离制备，体外培养，它们是损伤组织修复与再生、更新和替代的重要细胞来源。干细胞不仅具有强大的增殖能力，而且具有多种生物活性和功能。然而，随后的研究结果表明，对损伤部位移植的干细胞的存活率和实际分化均较低，而且其维持时间也短暂［１］。特别是，实施移植的干细胞本身也难以穿过血脑屏障、血脊屏障和皮肤屏障等，因此，依赖干细胞移植存在着明显的技术瓶颈和局限性。但进一步研究发现，干细胞可以旁分泌的方式分泌多种生物活性因子，干细胞可以旁分泌的方式分泌多种生物活性因子才是干细胞移植治疗的“执行者”，也是其产生疗效的真正作用机制。尤其是干细胞旁分泌产生的外泌体，因其含有多种生物活性物质以及生物信息等，可参与细胞间物质交换、生物信息交流和细胞信号传递及通讯等作用。因此，研究人员推测外泌体是干细胞的旁分泌效应体，也是在某种状态和某些靶部位执行干细胞功能和生物学效应的新的活性细胞器，其实际作用和功能与干细胞基本相似，包括可以缩小心肌梗死面积、促进肾脏损伤的修复、调节免疫反应、参与肿瘤发生、发展等。１１ 干细胞外泌体的起源及产生１９８３年Ｐａｎ和Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ等首先在绵羊网织红细胞向成熟红细胞转化和演变的过程中发现了一种形态大小为纳米囊泡的分泌小体。以后将这些小泡称为外泌体［２］。后来进一步证实，这种细胞外泌体实际上可携带多种脂质、蛋白质、ＤＮＡ、ＲＮＡ等生物活性成分和细胞信号分子，广泛参与抗炎反应、免疫调节、对抗细胞凋亡、细胞损伤修复与再生、促进或者抑制肿瘤细胞生长等过程。尤其是２００７年，外泌体内含物ＲＮＡｓ和ｍｉＲＮＡｓ被发现，外泌体作为新的细胞间通讯介质受到高度关注。此后，许多类型的真核细胞被发现分泌外泌体，包括机体免疫细胞（Ｂ细胞和Ｔ细胞）、树突状细胞、巨噬细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、干细胞等，而这些外泌体被证明有重要的细胞间信息传递功能。虽然，干细胞外泌体的产生和分泌机制错综复杂，但可简单归纳为“内吞－融合－外排”３个步骤：①细胞内吞作用使其质膜向内凹陷成芽产生胞内小泡，进而融合形成早期核内体；②早期核内体继续通过胞膜内陷逐渐成熟为晚期核内体，并在囊泡分拣蛋白如转运必需核内体复合物（ｅｎｄｏｓｏｍａｌｃｏｍｐｌｅｘｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ＥＳＣＲＴ）的作用下识别、分类、挑选外泌体内含蛋白生成多囊泡体或者在神经酰胺协助下生成多囊泡体，该过程分为ＥＳＣＲＴ参与的ＥＳＣＲＴ依赖途径及ＥＳＣＲＴ非依赖途径。晚期核内体形成过程中装载蛋白质、脂质、ＲＮＡ，形成多泡小体；③装载有母细胞蛋白质、脂质、ＲＮＡ等成分的多泡小体逐步驱动和迁移到细胞内膜边缘并外排至该细胞之外形成外泌体，最后外泌体将储存在囊泡内的生物信息和生物物质传递给靶细胞，靶细胞对外泌体的接收可以通过配体－受体相互作用、胞饮、吞噬或胞膜融合等方式来实现。研究发现，骨髓间充质干细胞培养基上清液中发挥损伤修复作用的物质可能是１种直径在５０～１００ｎｍ的磷脂膜包裹的小囊泡，首次从人外泌体来源的间充质干细胞条件培养基中分离并鉴定外泌体［３］。１２ 干细胞外泌体的形态、结构与特性细胞外泌体是真核细胞外囊泡的一种亚型，也是来源于细胞却是非完整细胞结构的亚细胞结构。干细胞外泌体作为该细胞产生并向其胞外分泌的一种具有脂质双分子层膜结构的生物活性柔性囊泡，其微粒直径大约为３０～１５０ｎｍ，而该微粒密度约为１１３～１１９ｇ／ｍｌ。干细胞外泌体最独特的功能可能是与靶向受体细胞的特异性相互作用，从而在体内广泛分开的区域之间实现细胞间的信息传递。从而参与了重要的生理和病理过程。这些功能依赖于外泌体内所包含的成分，特别是蛋白质和核酸。干细胞外泌体中的蛋白质成分并不保持恒定。—５１１—国际老年医学杂志 ２０２１年３月 第４２卷第２期 ＩｎｔＪＧｅｒｉａｔｒ，Ｍａｒｃｈ２０２１，Ｖｏｌ．４２Ｎｏ．２王媛媛，等．干细胞外泌体在老年肿瘤治疗中的研究进展在３个独立批次的干细胞外泌体中，分别检测到３７９、４３２和４２０个独特蛋白，其中仅有１５４个蛋白为常见的蛋白。根据这些蛋白的功能证明外泌体具有驱动许多生物学过程的能力，并与干细胞外泌体治疗多种疾病的疗效一致，蛋白酶体单元已被报道存在于干细胞外泌体中。此外，通过质谱分析干细胞外泌体，可以检测到２０Ｓ蛋白酶体的蛋白补体，２０Ｓ蛋白酶体负责细胞内氧化损伤蛋白的降解，部分参与了干细胞外泌体的心脏保护活性。在大多数情况下，干细胞外泌体作为载体的功能依赖于核酸ｍｉＲＮＡ，通过调节受体细胞促进肿瘤发展。一些研究人员发现，干细胞外泌体通过ｍｉＲＮＡ促进乳腺癌细胞增殖，如ｍｉＲ－２１和ｍｉＲ－３４３４ａ相互作用参与肿瘤的转移。其中大部分蛋白质是肿瘤支持因子，包括血小板源性生长因子受体（ＰＤＧＦＲ－β）和金属基质蛋白酶抑制剂（ＴＩＭＰ－１和ＴＩＭＰ－２）［４］。随后，ｍｉＲＮＡ被认为是外泌体诱导反应的主要信使。Ｂａｇｌｉｏ团队对干细胞外泌体小型ＲＮＡ进行分析，发现除了ｍｉＲＮＡ外，干细胞外泌体还富含转运ＲＮＡ（ｔＲＮＡ），其作用与ｍｉＲＮＡ等同。１３ 干细胞外泌体的提取制备与分析鉴定目前，可用于提取制备干细胞外泌体的方法和技术很多，但目前国内外实验室大多采用超速离心法（简称超离法）、梯度密度分离法、超滤法或纳滤离心法、特异性免疫结合捕获法（使用抗ＥｐＣＡＭ包被的磁珠分离法）等。其中，普遍认为目前干细胞外泌体最常用和最简单提取方法是超速离心法，亦被称之为干细胞外泌体提取分离法的经典法和“金标准”。但超离法较易引起干细胞外泌体的黏附性聚集，且反复多次离心造成干细胞外泌体的丢失或破坏增加导致得率减少，加上超离法难以将样本中的微粒、微泡、细胞碎片和凋亡小体完全分离导致干细胞外泌体纯度有限［３］。为了提高干细胞外泌体提取分离的纯度和得率，有研究者在提取分离过程中采用２种或２种以上方法相结合及优势互补的优选技术流程，如在ＥＶ－ｆｒｅｅ缓冲液中洗涤后先进行超滤、再应用密度梯度离心法或色谱分析法［３，５］。另外，为了获得更好的得率和纯度，也可采用分子排阻色谱法和高分子量离心过滤，或使用中速微分超速离心法和剪切流过滤等［６］。虽然，超速离心法与蔗糖浓度梯度或蔗糖缓冲相结合的技术与方法可大大提供高度富集的干细胞外泌体［７］。但迄今为止，国内外对干细胞外泌体提取分离方法并无确定规范要求和统一标准，且仍没有能同时具备外泌体含量、纯度和生物活性都满意的最佳分离技术与方法。干细胞外泌体的提取、分离、纯化制备虽是其临床应用研究的前提和基础，在成功获得该干细胞外泌体后必须进行其相关生物特性的分析鉴定［８］。而科学和准确的干细胞外泌体分析鉴定则是其临床应用研究的关键保证。目前最低要求需要符合以下４种方式对细胞外泌体分析鉴定的结果：①干细胞外泌体形态学鉴定：外泌体通常具有完整的脂质双分子层膜包绕，微囊泡呈圆形、椭圆形、碟形、杯形等，隐约可见其内含有低电子密度物质；②干细胞的粒径及其分布检测：干细胞外泌体粒径在３０～１５０ｎｍ；③干细胞外泌体特征性蛋白的表达水平检测：如热休克蛋白（ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０）、ＧＴＰ酶（ＥＥＦ１Ａ１、ＥＥＦ２）和核内体标记蛋白（Ａｌｉｘ）以及肿瘤易感基因ＴＳＧ１０１等；④干细胞外泌体膜上特征性表面标志物分子检测：干细胞外泌体膜上特异性表达ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２等。用于分析鉴定干细胞外泌体的技术手段主要包括电子显微镜（扫描电子显微镜和透射电镜）、原子力显微镜、纳米粒子跟踪分析、流式细胞检测分析、免疫印迹试验和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ检测）［９］。干细胞外泌体被认为具有独特的蛋白质和脂质，因此其鉴定具有一定的特点。它们含有多种黏附分子，这些黏附分子在它们的细胞膜上表达，例如含有膜转运和融合蛋白（ＧＴＰａｓｅｓ、ａｎｎｅｘｉｎ和ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、跨膜四蛋白（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１和ＣＤ８２）、参与多泡体生物过程的蛋白（Ａｌｉｘ和ＴＳＧ１０１），以及与脂质相关的蛋白和磷脂酶，可通过流式细胞分析、免疫印迹试验和ＥＬＩＳＡ检测。２ 干细胞外泌体在肿瘤中的临床研究 干细胞、免疫细胞和肿瘤细胞旁分泌的外泌体在临床肿瘤研究中同样表现出某些相似的共性，却也表现出不同的个性和特点及干细胞外泌体与肿瘤关系的双重性。大多数免疫细胞旁分泌的外泌体通常可以通过激活或杀伤肿瘤细胞而发挥以抑制肿瘤生长为目的的主导作用；而肿瘤细胞旁分泌的外泌体则通常表现为抑制免疫激活、促进肿瘤恶性生物学行为的发展进程。肿瘤细胞外泌体在免疫调节作用方面通常表现为免疫促进或抑制作用，如肿瘤细胞旁分泌的外泌体通过抑制效应Ｔ细胞激活、抑制效应Ｔ细胞增殖、诱导Ｔ细胞凋亡、抑制效应Ｔ细胞杀伤功能、以及对ＮＫ细胞、单核细胞—巨噬细胞、树突状细胞的抑制和骨髓来源的免疫抑制细胞、调节性Ｔ细胞等，但在某些条件下也可使肿瘤细胞旁分泌外泌体的作用趋势主要表现为抗肿瘤免疫。干细胞外泌体在临床肿瘤中的研究，特别是在临床肿瘤治疗中，主要体现在它们充当肿瘤治疗药物的载体杀伤肿瘤细胞和通过改变或调整肿瘤细胞内微环境条件影响肿瘤细胞生存等发挥抗肿瘤的生物学作用。当然，也不排除干细胞外泌体与肿瘤关系的双重性，即具有抗肿瘤效应、也存在促进或—６１１—
若干药物专利纠纷案例分析
若干药物专利纠纷案例分析
药物专利纠纷案例是指涉及制药行业中的专利权纠纷，涉及到新药研发、专利保护、市场竞争等方面的问题。下面将分析三个药物专利纠纷案例，以帮助读者更好地了解该领域的法律问题和挑战。
案例一：InterMune v. Actavis
该案以抗癌药Esbriet（pirfenidone）为中心，涉及到InterMune公司对Actavis公司的专利侵权指控。InterMune公司持有Esbriet的专利，并通过该药物治疗肺纤维化病患者。Actavis公司推出与Esbriet相似的通用药，并申请了对应的生产和销售批准。InterMune随即起诉Actavis侵犯了其专利权。
此案的争议点在于InterMune的专利是否有效和Actavis是否构成了侵权。InterMune论证其专利是有效的，并且Actavis的通用药与其专利所涵盖的技术相似。而Actavis则主张InterMune的专利无效，并且其通用药不侵犯InterMune的专利权。
最终，法院裁定Actavis侵犯了InterMune的专利，并禁止其在专利有效期内生产和销售通用药。该案例对于制药公司在专利侵权纠纷中证明专利有效性的重要性进行了强调。
案例二：Bayer v. Natco Pharma
该案以抗癌药Nexavar（索拉非尼）为中心，涉及到Bayer公司对Natco Pharma公司生产和销售其通用版本的专利侵权指控。Nexavar是一种口服的多激酶抑制剂，用于治疗肝癌和肾癌。 Natco Pharma在印度获得了生产和销售Nexavar的许可，但其通用版本的价格远低于Bayer拥有专利的原始药物。Bayer公司指控Natco
Pharma侵犯了其对Nexavar专利的独家权益，并要求法院禁止Natco
Pharma销售其通用药。
该案例的争议点在于Natco Pharma是否违反了Bayer的专利权，并且是否构成了非法的竞争。Natco Pharma主张其通用药没有侵犯Bayer的专利，并且提供了低价药物使更多的患者能够获得治疗。
治疗各种癌症专利配方各种癌症都治
治疗各种癌症专利配方各种癌症都治
在医学领域中，癌症是一种严重的疾病，造成了许多人的生命威胁。为了寻找有效的治疗方法，许多研究人员致力于寻找新的药物和疗法。在这个过程中，一些创新的治疗方法已经被开发出来，并且被授予了专利保护。在本文中，我们将讨论针对不同类型癌症治疗的专利配方。
一. 乳腺癌的专利配方
乳腺癌是女性最常见的癌症类型之一。专利配方 xxx 是一种针对乳腺癌的创新治疗方法。该配方结合了多种药物，在临床试验中显示出显著的抗癌效果。它通过干扰癌细胞的生长和分裂来减缓病情的进展，提高患者的生存率。
二. 肺癌的专利配方
肺癌是全球范围内造成许多人死亡的主要原因之一。专利配方 xxx
是一种创新的治疗肺癌的方法。它包含了一系列的化学物质，这些化学物质具有抗癌特性。通过靶向癌细胞，减少其生长和扩散的能力，这种配方可以有效地抑制肺癌的发展。
三. 结直肠癌的专利配方
结直肠癌是消化系统中最常见的癌症类型之一。专利配方 xxx 是一种专门针对结直肠癌的治疗方法。通过抑制癌细胞的血液供应，并促进免疫系统对癌细胞的攻击，该配方可以有效地抑制结直肠癌的生长和转移。 四. 前列腺癌的专利配方
前列腺癌是男性最常见的癌症类型之一。专利配方 xxx 是一种创新的前列腺癌治疗方法。该配方通过抑制癌细胞的黏附和入侵能力，改善患者的症状，并延长生存期。它还可以减少手术的需要，给患者带来更好的治疗效果。
五. 肝癌的专利配方
肝癌是一种高度恶性的癌症，常常出现在肝脏功能受损的患者中。专利配方 xxx 是一种针对肝癌的创新治疗方法。通过干扰肿瘤的血液供应，并促使肝细胞的再生，该配方可以有效地抑制肝癌的发展，并提高患者的生存率。
六. 结语
癌症是一个严重的健康问题，对于很多患者来说，寻找到有效的治疗方法是他们生存的希望所在。专利配方的研发在一定程度上满足了这一需求，为医疗领域带来了新的希望。然而，我们仍然需要进一步的研究和临床试验，以验证这些专利配方的安全性和疗效，并使其能够尽早惠及更多的患者。
新型抗肝癌药—米铂及冻干制剂
新型抗肝癌药—米铂及冻干制剂
南京工业大学江苏省药物研究所有限公司唐建华
一、产品基本信息
商品名：Miripla®
英文名：Miriplatin Hydrate
日文名：ミリプラチン水和物
化学名：(SP-4-2)-[(1R,2R)-1,2 环己二氨-N, N ′ ]二(十四酸-O)合铂
CAS 登记号：141977-79-9，
结构式：
分子式：C34H68N2O4Pt・H2O，
相对分子量：782.01。
适应症：用于肝细胞癌。
用法用量：将70mg 本品溶于3.5 mL 本品专用混悬液中，通过插入肝动脉内的导管注射进肝脏，直至药液充满肿瘤血管内时结束。给药上限为每次6 mL（含本品120mg），且需重复给药时要设4 周以上的观察期。 二、产品简介[1]
Miriplatin Hydrate 是大日本住友制药株式会社开发的脂溶性铂复合物抗癌药，于2009 年10 月16 日获得日本厚生劳动省批准，用于治疗肝细胞癌。本品专用混悬液已于同年8 月20 日获得批准。2010 年1 月20 日，Miriplatin
Hydrate 及其专用混悬液同时上市销售。
肝细胞癌是世界上最常见的、复发率很高的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第5 位，死因第3 位，且呈逐年增长趋势，已超过62.6 万人／年，我国发病人数约占全球总发病人数的55％，日本2005 年肝细胞癌患者约6.6
万人。肝细胞癌的发病特点多为丙型肝炎病毒或乙型肝炎病毒持续感染导致慢性肝炎、肝硬化而最终发展为肝细胞癌。临床上通常采用肝脏切除、移植等外科手术治疗；射频消融术、经皮微波凝固疗法、经皮无水乙醇注射疗法等内科局部治疗；经导管肝动脉化疗栓塞术（TACE）、经导管的动脉灌注治疗；全身化疗。其中，TACE 尽管只在无法实施外科手术或内科局部治疗的时候才使用，但在首次治疗中的比例却为29.6％，在肝内复发治疗中占53.3％，其重要地位可见一斑。TACE 是将抗癌药物与碘化罂粟子油的混合物从肝动脉内注入病灶，同时注入明胶海绵等栓塞物质堵塞动脉，切断动脉血流，达到致肿瘤坏死的目的。用于TACE 的抗癌药物有盐酸阿霉素、盐酸表柔比星、丝裂霉素、顺铂、净司他丁斯酯等。其中，铂类抗癌药物顺铂因其高效抗癌活性与广谱抗癌效果而被广泛使用，对肝细胞癌也表现出良好的临床效果，但其水溶性的特点使得它利用碘化罂粟子油为载体的物理稳定性受到严重影响；净司他丁斯酯是唯一作为以碘化罂粟子油脂肪酸乙酯（ethyl ester of iodinated poppy-seed oil fatty acid）为载体、由肝动脉注射给药的抗癌药物获得批准的，自1994 年上市后抗肿瘤效果获得首肯，但该药存在可能导致肝动脉血管损伤、对肝胆系统的影响不可逆转等问题，对以后治疗及预后有影响，用药安全存在隐患。因此，寻找与碘化罂粟子油脂肪酸乙基酯亲和性高、抗癌效果不逊于净司他丁斯酯、预后安全、隐患小的药物成为药物研发的新目标。