免疫酶组织化学技术
酶免疫组织化学技术的操作程序
酶免疫组织化学技术的操作程序一、取样和固定1. 从动物或人体组织中取得所需样本，并尽快进行处理，以避免样本的降解。
2. 将样本放入适当的缓冲液中进行固定。
常用的固定液包括4%的中性缓冲甲醛和70%的乙醇。
固定时间视样本大小和类型而定，通常为24小时。
二、包埋和切片1. 固定后，将样本从固定液中取出，进行脱水。
脱水过程中，需逐渐用浓度递增的乙醇替换固定液，使组织逐渐脱水。
2. 在脱水完成后，将样本置于透明剂（如苯胶）中浸泡，使其透明化。
3. 将透明化后的样本置于熔蜡中，使其浸透于蜡中。
4. 将浸透于蜡中的样本置于组织芯片中，使其与蜡块紧密结合。
5. 利用组织切片机将蜡块切割成薄片，厚度通常为3-5微米。
三、抗原修复和抗体染色1. 将蜡块上的切片放在载玻片上，并进行抗原修复。
抗原修复可以通过热解蜡或酶解蜡来完成。
2. 在抗原修复完成后，使用PBS（磷酸缓冲盐溶液）或TBST（三丁基甲酸盐缓冲盐溶液）进行洗涤，去除残留的蜡块和其他污染物。
3. 在洗涤完成后，将抗体溶液加到载玻片上，与待测蛋白质发生特异性反应。
抗体可以是一种单克隆抗体或多克隆抗体。
4. 将载玻片置于湿润箱中，保持恒定的温度和湿度，进行抗体与待测蛋白质的结合反应。
反应时间视抗体和待测蛋白质的特异性而定，通常为1-2小时。
四、酶标记和显色1. 在抗体与待测蛋白质的结合反应完成后，进行洗涤，去除未结合的抗体。
2. 加入酶标记的二抗或多抗，与第一次结合的抗体发生反应。
常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
3. 经过二次抗体的结合反应后，进行洗涤，去除未结合的二抗。
4. 加入显色底物，使酶标记物发生显色反应。
常用的显色底物有DAB（二氨基联苯胺）和BCIP/NBT（硝基蓝四唑/硝基蓝硝酮）。
五、结果分析和观察1. 经过显色反应后，用清水冲洗载玻片，停止显色反应。
2. 将载玻片进行脱水，并用透明剂进行封片。
3. 使用显微镜观察载玻片下的切片，观察待测蛋白质的表达情况和定位。
免疫酶技术的原理及应用
免疫酶技术的原理及应用1. 什么是免疫酶技术？免疫酶技术是一种利用抗体-抗原相互作用进行生物分析的方法。
它通过利用抗体与特定抗原结合的高度特异性，将酶标记的抗体用于检测和定量目标分子，广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。
2. 免疫酶技术的原理免疫酶技术的原理是基于抗原与抗体之间的高度特异性结合。
一般来说，免疫酶技术包括以下几个步骤：2.1 抗原的制备首先，需要获得目标分子的抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、病毒、细胞表面蛋白等。
通常，抗原会被纯化并加工成适合免疫动物生产抗体的形式。
2.2 抗体的制备接下来，需要制备与目标分子结合的特异性抗体。
通常，抗原会被免疫动物（如兔子、小鼠等）注射，形成抗体。
2.3 酶标记的抗体制备为了便于检测和定量目标分子，可以将酶标记与抗体结合，形成酶标记的抗体。
常用的酶标记包括辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
2.4 抗原-抗体结合反应将样品中的目标分子与酶标记的抗体一起孵育，使抗原与抗体发生特异性结合。
这样，目标分子就被标记上了酶，成为可检测的复合物。
2.5 酶的作用和检测添加适当的底物和辅助试剂后，酶会催化底物的反应，产生可测量的信号。
常见的底物有TMB（3，3′，5，5′-四甲基苯基二氨基甲烷）、BCIP（溴硝基硼邻萘酚磷酸盐）等。
3. 免疫酶技术的应用免疫酶技术在医学、生物学和生物化学等领域有广泛的应用。
以下是免疫酶技术的一些常见应用：3.1 免疫诊断免疫酶技术在临床诊断中被广泛应用。
例如，ELISA（酶联免疫吸附测定法）通过检测血清中特定抗原或抗体的浓度，可以用于诊断疾病，如各类感染病、自身免疫性疾病等。
3.2 蛋白质检测和定量免疫酶技术可以用于检测和定量蛋白质。
例如，Western blotting可以检测特定蛋白质在混合蛋白中的表达情况，通过与标准曲线比较，可以定量目标蛋白的含量。
3.3 免疫组织化学免疫组织化学是一种在组织切片上检测特定蛋白质表达的方法。
免疫组织化学技术在肿瘤诊断中的应用
免疫组织化学技术在肿瘤诊断中的应用肿瘤是一种影响人类健康的疾病，其发病率和死亡率一直居高不下。
在肿瘤的早期诊断和治疗中，免疫组织化学是一种常用的技术，可以准确地识别和定位肿瘤细胞，为肿瘤的治疗提供依据。
本文将从肿瘤的概念、免疫组织化学技术的基本原理、免疫组织化学技术在肿瘤诊断中的应用等方面加以介绍。
一、肿瘤的概念肿瘤是指在人体内不正常增生、不受控制的组织，它可以发生在人体的各个器官和组织中。
肿瘤按照其良恶性分为良性肿瘤和恶性肿瘤。
良性肿瘤不具有浸润和转移的特点，一般不会对人体造成严重的威胁；而恶性肿瘤具有浸润和转移的特点，能够在人体内形成多个转移灶，严重地损害了人体的正常组织和器官，威胁人类的健康。
二、免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是指使用特异性抗体技术来识别物质在组织中的分布和定位。
在免疫组织化学中，首先需要选择适当的特异性抗体，这些抗体都是对某种特定的蛋白质有特异性结合的。
在选定抗体之后，需要对组织进行样品处理、抗原检测、化学染色等步骤。
常用的染色方法有免疫酶标记法（immunoperoxidase staining），免疫荧光染色法（immunofluorescence staining）等。
在免疫组织化学技术中，抗原的完整性、染色的效果以及对比度的高低等都是需要考虑的因素。
三、在肿瘤的诊断中，免疫组织化学技术是一项非常重要的技术。
它可以通过识别肿瘤组织中不同的表面标志物和化学成分来确定肿瘤的类型和癌细胞的分化程度，从而帮助医生制定合理的治疗方案。
具体地说，免疫组织化学技术在肿瘤诊断中的应用如下：1.确定肿瘤类型通过对肿瘤组织中不同的标志物和化学成分的识别，可以精确地确定肿瘤的类型。
如CD20和CD79a是B细胞淋巴瘤的表面标志物，而CK7和CK20则是前列腺癌和结直肠癌的标志物。
因此，在肿瘤的诊断中，选择合适的抗体来定位肿瘤的位置、类型是非常有必要的。
2.评估癌细胞的分化程度肿瘤恶性程度与其癌细胞分化程度呈正相关。
酶免疫组织化学染色技术 -回复
酶免疫组织化学染色技术-回复酶免疫组织化学染色技术（Enzyme ImmunoHistoChemistry, E-IHC）是一种常用于组织学研究和病理诊断的方法。
该技术基于免疫学原理，采用酶标标记抗体和细胞色素底物，通过酶的催化作用来检测组织中特定抗原的分布和表达水平。
本文将一步一步回答与酶免疫组织化学染色技术相关的问题。
第一步：样本处理样本处理是酶免疫组织化学染色技术的重要步骤，它的目的是保持组织结构和细胞膜完整性，同时保留目标抗原的免疫原性。
1. 固定化：将组织样本进行固定化处理有助于保持细胞和组织的形态学结构。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇。
甲醛能够形成甲醛-蛋白质交联，从而固定并保持组织中的抗原。
乙醇可以用于去除水分和酮糖，提高抗体的渗透性。
2. 残胶和抗原修复：许多抗原在标本固定过程中会损失其免疫原性，需要进行抗原修复。
常用的修复方法包括热处理、酶消化和酸碱处理等。
热处理通常使用高温蒸煮或压力加热，可使蛋白质水平解离，恢复抗原性。
酸碱处理则通过改变组织的PH值，使抗原解离。
第二步：抗体选择抗体是酶免疫组织化学染色技术的核心。
选择合适的抗体对于获得可靠的结果至关重要。
1. 一抗和二抗：酶免疫组织化学染色一般采用间接法。
首先，使用一抗与目标抗原特异性结合。
随后，使用标记有酶的二抗来识别和结合一抗，从而可视化目标抗原。
常用的二抗有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
2. 选择合适的抗体：选择抗体需要考虑目标抗原的特异性和抗体的亲和性。
在选择抗体时，可以参考文献报道、试剂公司提供的抗体说明书和其他研究人员的建议。
第三步：酶标标记酶标标记是酶免疫组织化学染色技术的另一个关键步骤。
酶标标记抗体在靶抗原区域内催化底物，从而产生特定的染色反应。
1. 酶标物质的选择：常用的酶标物质有HRP和AP。
HRPHRP常用于DAB法（diaminobenzidine）和AEC法（aminoethyl carbazole）等反应体系中，可产生棕色至棕黑色反应。
《免疫组织化学技术》PPT课件
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双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
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双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
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PAP法的原理
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PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
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PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
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免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
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标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
免疫组织化学检验技术—酶免疫组织化学检验技术(免疫学检验课件)
（二）技术类型 1.直接法
形成抗原一抗体一酶复合物 2.间接法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物 3.酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物
（三）方法评价
三、非标记抗体酶免疫组化染色法
（一）原理 该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特
异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结 合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2） 作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与 结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc 段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对 抗原的检测。
4.APAAP法 APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立
的碱性磷酸酶（AP）- 抗碱性磷酸酶（AAP） 法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。
（三）方法评价
该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于 酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗 体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的 缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥 PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高 的方法。
通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原 的抗体（Ab1）与PAP复合物的抗酶抗体连 接起来Ag-Ab1-Ab2-PAP
3.双桥PAP法 该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体
和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比 PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏 感性。
酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法
二、酶标记抗体的免疫组化染色法
（一）原的共价键作用将酶直接连接在抗体 （或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体） 与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应 后，通过酶对底物的催化作用，生成不溶 性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗 原定性、定位、定量检测的目的。
免疫组织化学技术的应用
免疫组织化学技术的应用免疫组织化学技术概述免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理进行生物分子检测和定位的技术。
它采用抗体与特定抗原结合的顺反应原理，在组织切片中检测和定位某一特定分子。
原理免疫组织化学技术利用抗体与特定抗原结合的顺反应原理，即对一种特定抗原有高度选择性的抗体与组织样品中的该抗原相结合产生可见的信号。
这种信号可以是产生光学、荧光或颜色改变等形式。
应用1.生物医学研究：免疫组织化学技术可以检测组织中特定蛋白质的分布和表达，是研究生物医学领域中蛋白质分子组学的基础技术之一。
2.临床诊断：免疫组织化学技术可以应用于肿瘤诊断、流行病学调查等领域。
通过检测某些肿瘤标志物、细胞表面分子和内分泌指标等，可以帮助医生进行正确诊断。
3.药物制剂：免疫组织化学技术可以帮助研究药物分布和作用机制。
例如，在研究心血管药物时，可以用抗体检测受体的表达和分布，从而了解药物作用机制和药效。
优点1.高度特异性：免疫组织化学技术可以准确地检测特定分子，避免了其他分子的干扰。
2.高灵敏度：可以检测极微量的分子，并精确定位其位置。
3.多样性：可以应用于不同分子种类的检测和定位，有很大的应用前景。
局限性1.抗体交叉反应：某些抗体可能对多种分子有交叉反应，导致误判。
2.样品制备：样品的制备和处理对结果产生影响，需要更加严格的标准化。
3.价格昂贵：用于免疫组织化学技术的抗体相对价格较高，加上试剂盒和设备的购买，成本较高。
结论免疫组织化学技术作为一种重要的实验室技术，具有广泛的应用前景。
这种技术可以在细胞和分子层面上全面解析生物体的结构和功能，是生物医学领域中不可或缺的技术之一。
免疫组织化学技术的操作步骤1.标本制备：首先需要采集组织样本，处理后制成组织切片。
2.抗体处理：挑选合适的抗体，经过处理（如荧光标记、酶标记等），制成特定的抗体试剂。
3.特定抗原检测：在组织切片上滴加特定抗体试剂，进行特定抗原的检测。
4.反应信号检测：根据抗体的标记方式，进行相应信号的检测。
免疫组织化学常用技术方法大全
ABC法特点： 法特点： 法特点 敏感性强， ■ 敏感性强，具有放大作用 特异性强， ■ 特异性强，背景染色淡 ■ 方法简便，节约时间 方法简便， ■ 由于生物素与抗生物素具有与多种 示 踪物结合的能力， 踪物结合的能力，可用于双重或多重染色
注意事项 内源性生物素活性及其消除： ● 内源性生物素活性及其消除：肝、肾、 白细胞、乳腺预先以 白细胞、乳腺预先以0.01%抗生物素和 抗生物素和 0.01%生物素溶液分别作用 min，以消除 生物素溶液分别作用20 生物素溶液分别作用 ， 内源性生物素。 内源性生物素。 试剂的差异，应进行预实验。 ● 试剂的差异，应进行预实验。 试剂盒保存以4℃为佳。 ● ABC试剂盒保存以 ℃为佳。 试剂盒保存以
一、基本原理 抗生物素（卵白素） 抗生物素（卵白素） avidin
分子量68 分子量68 000 糖蛋白 维生素H） 生 物 素 （维生素 ） biotin 分子量 244
biotin
biotin
avidin
biotin
biotin
生物素-过氧化酶复合物技术 二、抗生物素-生物素 过氧化酶复合物技术 抗生物素 生物素
免疫组织化学常用方法大全
基本原理与操作步骤
第一节
免疫酶细胞化学
免疫酶细胞化学是免疫组织化学中 最常用的方法， 最常用方法，它是在抗原抗体特异反 应存在的前提条件下， 应存在的前提条件下，借助于酶细胞化 学手段，检测某种物质（抗原／抗体） 学手段，检测某种物质（抗原／抗体） 在组织细胞内的存在部位。 在组织细胞内的存在部位。即预先将抗 体与酶连结（酶标抗体），再使其与组 体与酶连结（酶标抗体），再使其与组 ）， 织内特异性抗原反应， 织内特异性抗原反应，经细胞化学染色 后，在光镜或电镜下观察分析。 在光镜或电镜下观察分析。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
酶免疫组化技术
实验步骤
1、无菌采集静脉血3ml/2人，注入盛有肝 素的无菌试管中（肝素浓度为20U/ml 全血），立即轻轻摇匀，使血液抗凝。
2、用无菌吸管加入等体积即3ml的室温 PBS液，使血液等倍稀释。
3、取10ml试管2支，分别加入1.5ml淋巴 细胞分离液（Ficoll），将离心管倾斜 45角，在距分层液界面上1cm处将稀释 血液沿试管壁缓慢加至分层液上面，每管 3ml，注意保持两者界面清晰，勿使血液 混入分层液内。
• 本实验以酶免疫组化技术检测CD3为例。 以亲和素-生物素-过氧化物酶（ABC或 SABC） 技术检测T淋巴细胞亚群为例验证 酶免疫组织化学技术检测组织抗原的方法。
酶免疫组化染色中常用的酶及显示底物
• 最常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP） • 常用的供氢体：
二氨基联苯胺（DAB）—反应产物呈棕色 氨基乙基卡巴唑（AEC）—反应产物呈橘 红色 4-氯-1-萘酚—反应产物呈灰蓝色
抗原抗体反应的特异性
组织化学的可见性
分类
➢酶免疫组化技术 ➢荧光免疫组化技术 ➢亲和免疫细胞组化技术 ➢免疫金（银）细胞染色组化技术 ➢免疫标记电镜技术 ➢杂交免疫细胞组化技术
酶免疫组化技术
• 酶免疫组化技术是直接以细胞或组织切片 为抗原相，以酶联免疫技术检测抗原或抗 体的存在与否或定位的一类酶免疫技术。
ABC法原理
1、预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶 标生物结合，形成可溶的亲和素（或链霉亲和素） -生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）。
2、当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法） 或生物素化二抗（间接法）相遇时，ABC（或 SABC）中未饱和的亲和素结合部位就可与抗体上 的生物素结合，使抗原-抗体反应与ABC （或 SABC）标记体系连成一体进行检测。
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第五节 卵白素---生物素
Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同
亚基组成 Biotin小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力
一 、ABC法
Avidin Biotin Complex 原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin
酶素化Biotin＋Avidin --- ABC 复合物 抗原---特异抗体--- Biotin标记
免疫酶组织化学技术
第一节 基 本 原 理
抗原＋抗体（特异性）
＋酶标记抗体，通过酶与 底物作用生成有色反应物，
定位组织或细胞内抗原的 一门技术。
免疫酶组化
免疫学 (抗原抗体反应)
+
酶细胞化学 (底物显色反应)
特异性
敏感性
定位性
可视性
PAP法
免疫酶组织化学基本组成： 抗原 ↓ 抗体 ↓ 放大系统 ↓ 显色系统
● 4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久保
存 ● 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) ～黄色
AKP底物：
AKP 常 用 的 底 物 为 α- 萘 酚 AS-B1磷酸盐
偶联试剂：固兰BB～蓝色 固红TR～红色
第三节 酶标记抗体法
酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在
操作
＊复染
＊抗体稀释度 ＊孵育时间 ＊ PAS洗涤
第九节 免疫酶方法评价
●
组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） HRP
酶桥法
一、PAP法
原理：抗原---特异性抗体---第
二抗体（桥抗体）--PAP复合物 步骤：三步法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
PAP法
特点： 敏感性较高，背景染色较轻
但特异性抗体与PAP必须为 同一种属动物
二、双PAP法： 原 理 ： 在 PAP 的 基 础 上 再 重 复 第二抗体和PAP复合物 抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗 体）---PAP ---第二抗体--- PAP复合物
组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP
双PAP法
组织抗原 第一抗原
第二抗体 PAP复合物
HRP
双PAP法
步骤：五步法 特点：敏感性较高
缺点：但步骤多，费时，非特 异背景重
三、APAAP法
原理：抗原---特异抗体---第二 抗体--- APAAP复合物 步骤：三步法
APAAP法
特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。 但产物易溶于有机溶剂
原理：HRP标记在第二抗体上，
抗原---特异性抗体---第 二抗体 HRP复合物
●
步骤：二步法
组织抗原 第一抗原 第二抗体 过氧化物酶
间接法
特点：敏感性较直接法高，一
种标记抗体能用于相应
动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。
但较直接法费时，非特
异染色稍重。
第四节 酶 抗 酶 法
●
制备抗酶抗体 制备PAP复合物
（二）碱性磷酸酶（AKP）
从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取
● ● ●
组织穿透能力较弱 内源性AKP较高 左旋咪唑具有抑制作用
（三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定
●
体内无内源性GOD 分子量大，穿透力较弱
●
二、底物及其特点
酶＋底物→酶 底物→酶＋ 产物（显色）
·
HRP的底物： HRP的底物为低浓度的H2O2， 供氢体为胺类及酚类化合物。
抗体分子上，制备成酶标记抗体，通 过抗体去寻找相应抗原。
一、直接法 原理：HRP标记在特异性抗体
（第一抗体）上，抗原--抗体 HRP复合物
●
组织抗原 第一抗体 过氧化物酶
直接法
步骤：一步完成
特点：方法简便、省时，专一
性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。
二、间接法
特点：
敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和 10 mole第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin 的干扰。
第七节 基本操作步骤
1. 抗原修复
2. 内 源 性 过 氧 化 物抑制 3. 正常血清封闭 4. 第一抗体 5. 第二抗体 6. 酶标记体 7. DAB- H2O2显色
★ 酶在PH中性液内较稳定。 ★ 组织中不应存根过氧化物酶 碱性磷酸酶
葡萄糖氧化酶
（一）辣根过氧化物酶（HRP）
★ 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位
★ 稳定，易获得较高纯度酶
★ 具有较高活性及特异性 ★ 可溶性佳，生成的产物不扩散 ★ 组织中内源性酶较少 ★ 可作用于多种底物，产生不同颜色 ★ HRP穿透力强，易进入细胞内
HRP---多聚合物---特异性
抗体。
步骤：一步法
特点：快速，简便，特异性强，
敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵
二、EnVision法
Enhanced Labelled Polymer System
原理：HRP ---多聚合物---第二 抗体
组织抗原 一抗 二抗 酶 多聚骨架
第一步
第二步
EnVisionTM方法
ABC法
免疫酶特点：
信号定位准确 标本可长期保存 阳性标记与病变关系 方法简便，易推广
第二节
一、酶及其特点
酶选择标准：
酶 和 底 物
★ 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜 或电镜观察。 ★ 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好 定位。
★ 酶易于纯化，获得纯制品。
★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。
第二抗--- Avidin Biotin HRP
● ●
组织抗原
第一抗体
第二抗体 HRP 生物素
卵白素
ABC法
步骤：三步法
特点：敏感性较高，特异性强， 应用范围广
●
某些脏器存在内源性生物素
干扰
●
Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应
SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase
HRP显色反应： HRP＋H2O2 电子供体 HRP
＋H2O＋电子供体（氧化型）
电子供体被氧化后，迅速改变
颜色，通过聚合等反应，生成不溶 性有色颗粒，并就地原位沉淀。
HRP常用的电子供体：
● 3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色 ● 氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂， 易扩散，用水溶性封固剂。
特点：敏感性高，特异性强， 方法简便
第六节 多聚合物酶法
HRP---多聚合物---抗体 一、Epos法 Enhanced staining polymer one-step
多聚合物酶法
组织抗原 一抗
HRP
多聚骨架
EPOS 方法
原理：采用一种具有惰性的多聚
化合物作为骨架，将特异
性抗体和HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成
第八节 抗原定位及非特异染色
组织细胞
＊固定问题
＊脱蜡不彻底 ＊内源性过氧化物 ＊内源性生物素
抗原
＊抗原弥散 ＊抗原异常表达 ＊共同抗原决定簇
特异性抗体
＊非特异吸附 ＊抗体不纯 ＊交叉反应
第二抗体
＊ IgG交叉反应 ＊ 二抗不纯
标记物
＊质量 ＊纯度 ＊标记水平
底物溶液
＊ DAB ＊ H2O2
Complex SABC法已代替ABC法
二、LSAB法
Labelled Streptavidin Biotin Method
原理： ● Biotin标记第二抗体
LSAB法
●
HRP标记Avidin 抗原---特异性抗体---Biotin标记
第二抗体---Avidin HRP复合物
●
步骤：三步法