β-葡聚糖酶活力测定
β-葡聚糖酶活力测定方法
• 1 原理
• β-葡聚糖酶(EC.3.2.1.6)水解1，3（4）-β-D-葡聚糖苷键，放出还原糖基团与3，5-二硝基水杨酸(DNS试剂)发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖的含量成正比关系，在540nm测其光的吸收值，查标准曲线（以葡萄糖计），可得到还原糖的量，据此计算β-葡聚糖酶的活力。
• 2 仪器和设备
• 2.1 分析天平：精度0.0001g
• 2.2 恒温水浴：精度±0.2℃
• 2.3 计时表
• 2.4 分光光度计
• 2.5 沸水浴器
• 2.6 振荡混合器
• 2.7 pH计: 精度0.01pH单位
• 3 试剂和溶液
• 3.1 0.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH5.0）
• 溶液A:量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。
• 溶液B:称取8.2g醋酸钠，溶解定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
• 使用时以A:B =3:7的比例混合，低温冷藏备用。
• 3.2 1%的β—葡聚糖溶液的配制
• 准确称取0.25gβ—葡聚糖放入100ml锥形瓶中，加2ml无水乙醇摇匀到无可见颗粒。加20ml无离子水混合15分钟，盖紧塞子在沸水中煮5分钟，放置室温自然冷却，或用自来水流水降温。将已冷却到室温的底物溶液倾入一只25ml容量瓶中，加入2.5ml1M醋酸缓冲液（pH5.0），并用无离子水定容到25ml。
• 3.3 3,5—二硝基水杨酸（DNS）溶液
• 溶液A:称分析纯的NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3,5－二硝基水杨酸。
• 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。
• 将A、B溶液混合，加入1200ml水，定容5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用。
• 3.4 0.1%苯甲酸
• 0.1g苯甲酸加入大约80ml无离子水中溶解，用无离子水定容至100ml。
• 3.5 标准葡萄糖溶液的配制
• 无水葡萄糖80℃烘干至恒重，准确称取100mg溶于100ml水中，加1mg叠氮化钠防腐。4℃冷藏备用。
• 4 分析步骤
• 4.1 标准曲线的绘制
• a) 取7支带有15ml刻度的试管，按下表取试剂 •
•
试管号 0 1 2 3 4 5 6
取标准葡萄糖溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
蒸馏水（ml） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8
葡萄糖的实际含量（mg/ml） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
DNS显色剂（ml） 2 2 2 2 2 2 2
沸水浴 10min
定容（ml） 15ml
OD540
• b) 测得OD值与葡萄糖毫克数在计算机上或人工拟合曲线，求得Y=ax+b一元线性方程中间的a和b值。要求所绘曲线相关系数r≥0.999。
• 4.2 样品测定
• 4.2.1 酶样制备
• 准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用pH5.0醋酸缓冲液溶解并定容至100ml，则该酶已经稀释100倍。
• 4.2.2 酶样测定
• a) 对于每一个被测酶样品，取1ml底物溶液置于四支试管(1ml/管),三支供测试酶活性，一支作空白,50±0.2℃保温2-3分钟.
• b) 加1ml酶稀释液向三个测试管中，空白管中加1ml无离子水代替酶稀释液。
• c) 四支试管均于50℃反应10分钟。
• d) 取出后每管加2mlDNS试剂,具塞,沸水煮5分钟。
• e) 冷却后，加10ml无离子水，充分混匀。
• f) 用空白管调零，于540nm测OD，
• 4.2.3 计算
• 将测得的各平行样求OD值的均值， 计算酶的活性单位依据以下公式
• β—葡聚糖酶的活力= U/g(ml)
•
• 式中 x:为样品OD 值的平均值
• b和a由葡萄糖浓度和相应的OD值通过回归方程求的
• n:酶粉（液）的稀释倍数
• 10:酶促反应的时间
• F:底物校正因子（1.047）通常由底物提供厂家标明
• W:酶样品的重量（1g或1ml）
酶活力测定方法
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准 SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。
纤维素酶DNS酶活力测定方法
DNS, 活力, 纤维素酶, 测定
1 定义
1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。
2 原理
纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。
3.试剂和溶液
3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定）
3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液
取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。取滤液100ml， 20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。
3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）
4仪器和设备
4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃)
4.2分光光度计
含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。
5测定步骤
5.1 标准曲线绘制
分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测操作SOP文件
声 明
本产品属精密光学仪器，在日常使用中，应严格按照我公司出具的操作流程进行试验操作，并确保工作环境正常。本试验的操作者必须为经我公司培训合格的微生物实验室检验人员，如需更换操作者，请做好交接工作，确保新的操作者了解仪器特性、熟悉操作流程。为避免试验结果不准确，请操作者认真阅读操作注意事项及操作流程，并严格遵守。如有任何疑问，请联系我公司售后服务部。
售后服务部电话：400-811-9958
北京金山川科技发展有限公司
真菌（1-3）-β-D葡聚糖测定
1.目的
建立真菌（1-3）-β-D葡聚糖检测标准操作规范，保证实验结果的准确性。
2.授权操作人
经培训合格的微生物实验室检验人员。
3.实验原理
（1-3）-β-D葡聚糖检测原理：真菌（1-3）-β-D葡聚糖激活酶反应主剂中的G因子后形成凝固蛋白， 根据其所引起的浊度变化对真菌（1-3）-β-D葡聚糖浓度进行定量测定。
（1-3）-D-Glucan
活化因子G 因子G
凝固酶原 凝固酶
凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶）
4．产品性能指标
4.1 灵敏度 最小检出值5pg/ml
5．实验组成
5.1实验仪器及器具：
MB-80微生物快速动态检测系统、洁净工作台、低速离心机、恒温仪， 20~200ul加样器、100~1000ul加样器、旋涡混合器、定时器。
5.2实验耗材：
200ul无热原吸头、1000ul无热原吸头、无热原平底试管、无热原真空采血管。
5.3试剂盒组成：
真菌（1-3）-β-D 葡聚糖检测试剂盒（光度法）：
试剂盒包括反应主剂 和样品处理液 。
6．工作环境
相对湿度：20%~80%；温度控制：10~30℃；电源电压：220V±10%，50Hz±2%。
7．标本采集、处理及保存
测定大麦和燕麦中的葡聚糖
测定大麦和燕麦中的β-D-葡聚糖
美国官方化学家协会官方方法 995.16
本方法适用于整个的燕麦食品、磨成粉部分及不加糖谷类食品和其他谷类食品（如大麦和黑麦）中β-D-葡聚糖的测定。此方法也可用于使用乙醇进行前处理后的葡聚糖含量高的谷类食品中。
下表中的数据为在多个实验室进行的试验数据。
A 原理
使用纯的苔聚糖酶和β-葡萄糖苷酶快速、定量测定谷类研磨液中β-D-葡聚糖。通过，通过苔聚糖酶使β-D-葡聚糖被特异地水解成低聚糖，然后β-葡萄糖苷酶定量的裂解成淀粉酶。葡聚糖使用葡聚糖氧化酶-过氧化物酶的缓冲混合物。
B 仪器
a）研磨 使用12个旋转器皿和0.5mm筛子，或者相似的设备。可选择旋风磨碎机用于小的实验室样。
b）台式离心机 16*120mm玻璃试管，1000*g
c）水浴锅 维持温度50℃±1
d）沸水浴锅 煮沸水在95-100℃,
e）试管振荡器
f）pH 测定仪
g）数显秒表
h）上皿天平
i）分析天平
j）烘箱 为测定试样的干重，维持温度103℃±1
k）分光光度计 510nm测定最大波长
l）吸量管 用一次性枪头准确移取100uL和200uL。另外，可使用自助手动移液器。 m）完全移液器 用5.0ml的移取100或200uL，用50mL移取4.0或者5.0ml。
n）分配器 使用葡聚糖氧化酶-过氧化氢酶-混合缓冲液，500mL容量，调整体积0-5.0mL。
o）玻璃试管 16*120mm，17mL容积，离心在 1000*g
p）离心管架 48个位置，能放16*120mm的试管
q）温度计 读数103℃±1
r）定量滤纸 快速 无灰
C 标准溶液
a）苔聚糖酶溶液 50U/mL 用20mL磷酸缓冲液稀释1mL 苔聚糖酶-硫酸铵e）。分离酶测定溶液5mL，低温储存在聚丙烯容器中防止微生物感染。硫酸铵溶液中未稀释的苔聚糖酶在4℃下能储存6年。（注：1单位的酶活力是酶要求的从大麦的β苔聚糖酶（10mg/mL），pH6.5，温度40℃每分钟释放1uM葡萄糖或者等量还原性糖♂）
酶法测定大麦提取物β-葡聚糖含量研究
ｌ２ 粮食与油脂 ２００６年第５期
酶法测定大麦提取物ｐ一葡聚糖含量研究
连喜军１，鲁晓翔１，蔡保松２ （１．天津商学院生物技术与食品科学学院，天津３００１３４； ２．上海交通大学农业与生物学院，上海２０１１０１） 摘 要：目前国际认可Ｂ一葡聚糖含量测定方法是酶法，此法测定成本高，我国目前多采用苯酚一 硫酸法测定，但测定结果准确性较差。该研究在国际Ｂ一葡聚糖酶法测定基础上用纤维素酶代替昆 布多糖水解酶水解Ｂ一葡聚糖，用苯酚一硫酸法代替葡萄糖试剂盒法测定Ｂ一葡聚糖酶解后得到葡 萄糖含量，设计适于我国应用的Ｂ一葡聚糖酶法测定方法。此法测定过程为：１．５ ｍｌ浓度为６０ ｐ￣ｇ／ｍＬ 标准Ｂ一葡聚糖和一定浓度样品，用浓度为５０ Ｕ／ｍＬ纤维素酶０．５ ｍｌ酶解６０ ｍｉｎ；然后用蒸馏水稀释 至３０ ｍｌ，从中吸取０．５ ｍｌ到另一试管，再加入浓度为２ Ｕ／ｍＬ Ｂ一葡聚糖酶ｌｍｌ，作用１５ ｍｉｎ后，用 苯酚一硫酸法测定标准Ｂ一葡聚糖和样品酶解液中葡萄糖含量，计算出样品中Ｂ一葡聚糖含量。 关键词：酶法；大麦提取物；Ｂ一葡聚糖；Ｂ一葡聚糖酶 Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ［３－ｇｌｕｃａｎ ｉｎ Ｂａｒｌｅｙ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｅｔｈｏｄ ＬＩＡＮ Ｘｉ－ｊａｎ ，ＬＵ Ｘｉａｏ－ｘｉａｎｇ２，ＣＡＩ Ｂａｏ－ｓｏｎｇ 【１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００１３４，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１１０１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎｚｙｍｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ Ｂ—ｇｌｕｃａｎ ｗａｓ ａｄｖｉｓｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｌｙ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｈｉ ｇｈ ｃｏｓｔ， ｐｈｅｎｏｌ—ｓｕｌｐｈｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｍａｉｎｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｏｕｒ ｃｏｕｎｔｒｙ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｐｏｏｒ ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ Ｏｕｒ ｃｏｕｎｔｒｙ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｔ ｂａｓｅ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ Ｌｉｃｈｅｎａｓｅ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ ｂｙ ｐｈｅｎｏｌ—ｓｕｌｐｈｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｎｅｗ ｅｎｚｙｍｅ ｍｅｔｈｏｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗａｓ：１．５ ｍＬ Ｂ—ｇｌｕｃａｎ（６０ ｐ．ｇ／ｍＬ）ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｗｅｒｅ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｗｉｔｈ ０．５ ｍＬ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｎｚｙｍｅ（５０ Ｕ／ｍＬ）ｆｏｒ ６０ ｍｉｎ；ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｄｉｌｕｔｅｄ ３０ ｍＬ，０ ｌ ｍＬ ３－Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（２ Ｕ／ｍＬ）ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ ｉｎ ０．５ ｍＬ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｆｒｏｍ ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂ—ｇｌｕｃａｎ ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｐｈｅｎｏｌ—ｓｕｌｐｈｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ａｆｔｅｒ １ ５ ｍｉｎ，ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ １３一ｇｌｕｃａｎ ｉｎ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｏｕｔ Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：ｅｎｚｙｍｅ ｍｅｔｈｏｄ；ｂａｒｌｅｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｐ—ｇｌｕｃａｎ；ｐ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ 中图分类号：ＴＳ２０２．３；ＴＳ２０１．２ ３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－－９５７８（２００６）０５－－００１２－－０４
DNS法测定饲用℃β—葡聚糖酶活力
DNS法测定饲用℃β—葡聚糖酶活力
刘永举;于海明
【期刊名称】《中国饲料》
【年(卷),期】1999(000)018
【总页数】1页(P26)
【作 者】刘永举;于海明
【作者单位】莱阳农学院;山东省畜牧局
【正文语种】中 文
【中图分类】S816.79
【相关文献】
1.对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖法测定饲用α-半乳糖苷酶(黑曲霉)活力的方法 [J],
潘宝海;李德发;陆文清;代建国
2.DNS法测定带有保护剂的β-葡聚糖酶酶活研究 [J], 李皎;杨国武;汪大敏;毛勇;邓媛
3.饲用β-葡聚糖酶活力测定需注意的几个问题 [J], 王在贵;何瑞国;张宏福
4.饲用木聚糖酶、β-葡聚糖酶活力测定方法的调研 [J], 王在贵;张宏福;何瑞国
5.DNS法测定饲用木聚糖酶活力 [J], 王清吉;尹西竹
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真菌(1-3)-β-D葡聚糖
附1 真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测标准操作规程
1. 目的
规范真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测的操作规程，保证结果准确性。
2. 原理
实验条件下，来源于某些真菌细胞壁的(1-3)-β-D葡聚糖能够特异性地激活本试剂盒反应试剂的酶促凝集系统，使反应溶液的透光度发生变化。利用(1-3)- β-D葡聚糖标准品建立β-D-葡聚糖生物效应与透光度变化关系的标准曲线，便可定量地测定人血液的(1-3)- β-D葡聚糖含量。
3. 试剂
真菌（1-3）-β-D葡聚糖检测试剂盒，湛江安度斯生物有限公司。
试剂盒包装规格：20人份/盒。
试剂盒组成：
β-G试剂 冻干粉状，0.25 ml / 支，10支
β-G试剂复溶液 无色液体，0.3 ml / 支，10支
样品稀释瓶 无色液体，0.9 ml / 支，20支
复溶后的试剂溶液应在10分钟内使用。若当次试验有剩余，可将剩余的试剂溶液置-20℃以下冷冻保存，一周内使用。不能反复冻融试剂溶液。
4. 检测设备： LKM动态试管检测仪。
5. 实验用具： 250 μl无热原吸头、20-200 μl移液器、75℃试管恒温仪、旋涡混合器、塑料试管架、无热原真空采血管（肝素抗凝剂）。
6. 标本采集及送检要求
6.1 标本采集要求
6.1.1 采集过程要求无菌操作，用指定的肝素类抗凝、无菌、无β葡聚糖采血管；
6.1.2 常规住院病人早上用药前空腹采血，血透患者透析前采血。
6.2 标本的送检和保存要求
标本采集后应在半小时内离心，4小时内检测完。若当日不能及时检测的标本应将离心后的血浆转移至无β葡聚糖的容器内-20℃以下冷冻保存，一周内使用。
7. 实验操作
7.1 在试验开始前，先开启LKM动态试管检测仪，预热，一段时间后发出哔的一声，试管仪温度达到37℃，待用；
7.2 取本试剂盒所配的无热原真空采血管取受试者静脉血1～2 ml，以400 g离心10分钟；
乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法
942023/7 NO.259 中国乳业质量安全Quality Control乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法徐聪玲1，2，钟世欢1，2，张思奇1，2，黄 南1，2，杨天明1，王 辉11 浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 3100092 赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310009摘 要：[目的]目前国内尚无酵母β-葡聚糖在乳制品中定量检测方法的国家标准和行业标准。本文利用离子色谱法建立快速、准确的乳制品中酵母β-葡聚糖检测方法。[方法]样品加入沉淀剂离心后，倒去上清液，反复数次至无干扰，加入1 mol/L盐酸溶液，经121 ℃ 60 min酸水解，调节pH值稀释后，过钠柱，用离子色谱仪测定。[结果]通过对水洗次数、色谱柱选择等因素选择优化，葡萄糖在1～20 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数R2>0.999，方法检出限为5 mg/100 g，定量限为15 mg/100 g；葡萄糖的回收率为84.8%～94.9%，相对标准偏差为2.34%（n=6）。[结论]该方法稳定，定量准确，适用于乳制品中酵母β-葡聚糖含量的检测。关键字：酵母β-葡聚糖；离子色谱仪；乳制品；葡萄糖文章编号：1671-4393（2023）07-0094-05 DOI:10.12377/1671-4393.23.07.180 引言酵母β-葡聚糖具有增强动物免疫力、抗肿瘤、抗感染、降低胆固醇、促进伤口愈合等功能，2010年5月20号，被原卫生部批准为新资源食品，可添加到乳制品、功能饮料、焙烤制品、糖果等食品中；2012年使用范围再次扩大至较大婴儿配方乳粉。此外，酵母β-葡聚糖还具有脂肪样口感，可作为低卡路里食品添加剂，在色拉调料、奶酪类似物等冷冻甜点中作为脂肪替代物使用，具有广泛的应用价值，国内已有乳品企业将其作为营养强化剂添加在产品中。但国内目前没有酵母β-葡聚糖在乳制品中定量检测方法的国家标准和行业标准，因此，本文利用酵母β-葡聚糖是一种无味无臭不溶于水的多糖，且不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，可与蛋白、基金项目：浙江省基础公益研究计划（LGN19B05003）作者简介：徐聪玲（1990-），女，黑龙江讷河人，大专，工程师，研究方向为食品机械与管理； 钟世欢（1992-），女，浙江杭州人，本科，工程师，研究方向为食品检测； 张思奇（1995-），男，甘肃礼县人，本科，助理工程师，研究方向为食品检测； 黄 南（1986-），女，浙江杭州人，本科，工程师，研究方向为食品检测； 杨天明（1990-），男，浙江杭州人，本科，工程师，研究方向为食品检测； 王 辉（1985-），男，浙江杭州人，大专，工程师，研究方向为食品检测。Copyright©博看网. All Rights Reserved. 95
酶活测定方法
酶活测定方法
还原法
酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加
化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下
比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。
色原底物法
通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色
基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即
可求出待测酶的活力。
粘度法
该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和 β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和 β-葡聚糖溶液通常
情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和 β-葡聚糖会被切割成较小的分子
使其粘度大 为降低。基 于 Poiseuille 定律我们知道
,只要测定一定条件下溶剂和样品溶
液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法
酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行
色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物
的含量 ,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法
常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根
据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应 ,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂
家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法
将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在
琼脂平面上打出一个约4-5mm 半径 的小孔。在点加酶样并培养24h 以后 ,用染色剂显色
或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定 随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应
β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,β-1,3-GA)试剂盒说明书
第1页，共2页
货号：QS2611 规格：50管/24样
β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，β-1,3-GA）试剂盒说明书
可见分光光度法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。
测定原理：
β-1,3-GA水解昆布多糖，内切β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率来计算其酶活性。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂4℃
保存；
试剂二：液体30mL×1瓶，4℃保存；
粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。
饲用酶制剂的酶活检测方法及评定
饲用酶制剂的酶活检测方法及评定
随着我国畜牧业的发展和生物工程技术的不断进步，酶制剂在饲料工业中的应用越来越多。由于酶制剂能够消除饲料中的某些抗营养因子的负面作用，提高饲料消化率，改善动物生产性能，降低生产成本，因此日益受到饲料界的重视。
但是，由于酶制剂来源比较复杂、分子结构不明确，分离提纯困难等多种原因，使这类产品有国家标准的不多，即使有国标也存在一些问题。给广大养殖用户和生产企业带来很大不便。本文简单介绍一下常用的酶活测定方法及测定过程的影响因素，仅供广大饲料工作者提供参考。
1 酶制剂的定义及分类
所谓的酶制剂就是通过产酶微生物发酵工程
或含酶的动、植物组织提取技术生产加工而成，具
有一种或多种底物清楚的酶催化活性，有助于改
善动物对饲料营养成分的消化、吸收等，并有功效
的生物学评定依据，符合安全性要求，作饲料添加
剂用的酶制剂产品（NY/T 722-2003）。工业上应用
的酶制剂大多为水解酶，按作用底物的不同，可分
为淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果
胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。按动物体内是否分
泌，分为消化酶和非消化酶两大类。消化酶指动物
自身能够分泌的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，在幼
龄动物或特殊生理阶段时，动物也存在消化酶分
泌不足需要外源供给的情况。非消化酶是指动物
自身不能够分泌或很少分泌，必须由外源供给的
酶，这类酶能消化动物自身不能消化的物质或降
解一些抗营养因子，主要有植酸酶、木聚糖酶、果
胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
2 常见的酶活测定方法
通常酶制剂活性的检测是采用实验室分析手
段来进行评价，它可以用来筛选优质酶制剂、确定
复合酶制剂的最佳组方及确定产品的最佳添加量
等，酶制剂实验室评价技术是目前饲料厂家应用
最为广泛的一种方法。其操作相对简单，检测所用
时间短，便于生产实践应用。酶活测定结果虽不能
完全反映酶的使用效果，但通过检测至少可以避
免使用劣质的酶制剂。我国饲料工业标准中已经