利用小随体多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株

利用小随体多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株 第壹学习小组 段志峰朱江邢英超

刁文涛冯延宾张熠 唐亦辰黄云何骁男 利用微卫星多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株 摘要 我们提出了壹种利用多重PCR对微卫星位点多态性分析快速鉴别酿酒酵母菌种的方法。 无需使用苯酚，简单提取DNA，利用多重PCR扩增SC8132X,YOR267C和SCPTSY7位点，用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行带型分析，这种方法可使我们区分30种商用葡萄酒酿酒菌种。该方法被成功应用于壹项在15和20摄氏度这俩个发酵温度下检验俩个菌株间的显性关系的生态学研究中。 这种方法在酿酒和酵母生产工业中常规的低成本检测酵母菌株的过程中应该有应用价值。 关键词：微卫星，PCR，酵母菌株，葡萄酒，发酵 1.前言 使用选育出的用于酒精发酵的酵母菌株酿造葡萄酒是当下普遍使用的壹种方法。酵母对葡萄酒的质量尤其是口味有很大的影响（ 现代的酿酒学家发现用不同的酵母菌株发酵能够使葡萄酒产生不同的特点。这导致了具有多种特色且能够应用于不同领域的选育菌株工业生产化。当下市场上提供了几百种葡萄酒菌种，它们几乎都属于酿酒酵母菌属。 和此同时，人们对发明快速而且精确检测酵母菌株的方法也产生了兴趣。在葡萄酒酿造中，它的应用包括确定接种菌株对在未发酵葡萄汁中野生菌株的显性优势，实时记录发酵中的菌株动态过程，控制菌株生产的质量且鉴别无效菌株。酿酒时，选育出的菌株被接种于富含野生酿酒酵母和非酿酒酵母的葡萄汁中。快速鉴别酵母菌株的方法应该考虑到菌群生长动态的观察，选育菌株的显性优势和环境因素对酵母菌株的影响。在葡萄酒发酵，温度是影响酵母动力学的壹个主要因素（FleetandHeard,1993）;生态研究也显示出了酿酒酵母菌株的不同行为。(Epifanioetal.,1999;Torijaetal.,2003). 事实上，酿酒商要求菌株的壹个突出特点是能够在特定的温度下进行良好的发酵反应。 很多时候，在壹个典型的发酵白葡萄，发酵温度应保持18摄氏度，但达到12-15摄氏度也不少见，从而提高调味品酯的含量且减少高酒精形成。在此温度下，经常会发生发酵停滞，因此，在这种状况下，选育菌种的低温代谢能力和对野生菌种的显性优势备受重视。 在过去的几年中，研究侧重于用分子生物学方法进行菌株分化（Behetal.,2006），如染色体分析法（CarleandOlson,1985;BlondinandVezinhet,1988）和限制性片段长度多态性（RFLP）分析mDNA（Queroletal.,1992），以及基于PCR的方法，其中包括内部转录序列（ITS）的核糖体DNA测序（Montrocheretal.,1998），δ元件插入位点的多态性（Cameronetal.,1979;Nessetal.,1993），扩增片段长度多态性（AFLP）的（DeBarrosLopesetal.,1999），随机扩增多态性DNA（RAPD）（Baleiras-Coutoetal.,1996），内含子剪接序列扩增（DeBarrosLopes etal.,1996）及PCR内含的线粒体基因（Lo′pezetal.,2003）。 这些方法在关于分辨率和处理时间方面对经典生理学实验起到了增强作用，可是其中壹些方法仍有些限制条件，因为它们几乎不能应用于日常的分析中，或者当它们容易实施时，它们且不能在菌种水平上完全区分这些菌株。此外，在壹些方法中，如δ元件分型和RAPD，其重现性取决于DNA模板的纯度和浓度。(Ferna′ndez-Espinaretal.,2001;Behetal.,2006)。这些缺点意味着花费大量时间和资金进行DNA清理步骤，在某些情况下仍需要几步反应，以评估非重复性带型发生的可能性。 基于具有长度多态性的简单序列重复基因位点分散在整个基因组中，微卫星分析已成功地被用来区分酵母菌株（FieldandWills,1998;GonzalezTecheraetal.,2001;Pe′rezetal.,2001;Hennequinetal.,2001;Malgoireetal.,2005）。最近，利用对具高度多态性的微卫星位点的多重PCR方法能够分离壹系列商用酵母菌株(Schulleretal.,2004;Bradburyetal.,2005;Legrasetal.,2005)。微卫星位点PCR高辨别能力以及其稳定性和实用性使其成为区分酵母菌种最受欢迎的方法之壹。这个方法用于常规检测的瓶颈发生在扩增子分析的步骤：利用聚丙烯酰胺凝胶及测序分析仪确定扩增子的大小较为费时费力。为了避免这个限制，有人提出利用简单的高张力琼脂糖凝胶电泳（RoutmanandCheverud,1994;Ferraroetal.,1998)。最近，Howell等人（2004）建议利用对SC8132X位点的PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶加EB染色电泳来进行酿酒酵母的分型。 为了建立壹种快速精确且且甚至适用于那些低预算高通量实验室的鉴别菌种的方法，我们对3个高多态性微卫星位点的多重扩增（GonzalezTecheraetal.,2001），然后用琼脂糖凝胶电泳进行带型分析。 作为第壹步，我们对壹组29种商用酵母菌株进行测试，另加壹酿酒酵母菌株作为参考，以检查该方法的鉴别能力。然后，我们在测试发酵温度对共接种的俩个选育菌株的生长速率和竞争能力的影响的实验中检查了这种方法的实际适用性。 2.材料和方法 2.1酵母菌株和培养基 酿酒酵母菌株采购于酿酒酵母生产商。酿酒酵母菌株见表1。酵母菌模式菌株（CBS1171）从CRA-IstitutoSperimentaleperl’EnologiaofAsti,Italy(ISE)的收集品中获得。 商用干菌株悬浮于无菌5%的蔗糖液体培养基中，40摄氏度下放置30分钟，稀释，然后涂布于YMA平板(10g/L葡萄糖,5g/L蛋白胨,3g/L酵母浸出物,3g/L麦芽膏和20g/L琼脂),然后在24摄氏度下培养48小时。 2.2DNA抽提 在第壹步检验这种方法的鉴别能力时，我们用Harju等人（2004）的方法抽提DNA。简单的说，将单个菌落重悬浮于200ml的lysisbuffer(2%(w/v)TritonX-100,1%(w/v)SDS,100mmolL_1NaCl,10mmolL_1Tris–HClpH8.0,1mmolL_1EDTApH8.0)中。这些试管放置于-80度冰箱中3分钟（直到完全冻住），然后在95摄氏度下于Thermomixer（EppendorfAG,Hamburg,Germany）中放置壹分钟（不要振荡）使它们快速溶化。重复上述过程，然后以最大速度旋转试管30秒。向试管中加入200ml氯仿冰浴，然后振荡试管2分钟，20，000g，5摄氏度的条件下离心5分钟。取上清液和另壹试管中加入400ml冰的纯乙醇，20摄氏度下静置沉淀10分钟，然后在20，000g，5摄氏度下离心10分钟。去上清，DNA沉淀用0.5mL70%(v/v)乙醇纯化，45摄氏度下真空干燥。得到的DNA溶于15mlTE(10mmolL_1Tris,1mmolL_1EDTA,pH8.0)。第二步检验该方法适用性的过程中，用微量加样吸头直接从单菌落中提取菌体直接悬浮于事先加好PCR混合物的0.2ml孔中。 2.3.PCR和电泳 三个微卫星位点，SC8132X,YOR267C和SCPTSY7被使用是由于他们具有高度的多态性。扩增是依赖于几对特异性的顺式和反式的引物进行的（见表二）SC8132X位点的引物和YOR267C位点的顺式引物是由Field和Wills所设计的，YOR267C位点的反式引物是由GonzalezTecheraetal制作的，而SCPTSY7位点的顺式引物是由Perezetal制作的。SCPTSY7位点的反式引物是由我们使用免费软件Primer3所设计的，目的是使其产生几个电泳带具有明显位置区别的扩增子而不和其他俩个位点重叠。 PCR扩增是进行在壹个具有20微升体积液体的BioradMyCycler热力周期仪中。20微升液体是有以下部分组成的：1微升DNA的萃取溶液（包含20-40ngDNA），3.1mmol/L浓度的MgCl2，0.4mmol/L浓度的各种dNTP,2微升去镁的PCR缓冲液，2个单位TaqDNA聚合酶，SCYOR267C位点引物各10pmol，SC8132X位点引物各15pmol以及SCPTSY7位点的引物各40pmol。PCR反应组分各成分的浓度被设计得尽量减小非特异性扩增。在发酵实验中，反应体系的体积为10微升，试剂组分和所占比例和上述反应体系相同，这样做能够节省Taq聚合酶和其他昂贵的试剂。为了优化对三个位点的多元化扩增，方案如下：94℃保持4分钟，以a.94℃保持30秒;b.56℃保持45秒;c.72℃保持30秒为壹个周期，重复28个周期，最后以72℃保持10分钟处理。 将产物在尺寸为15*10cm2浓度为2.5%（w/v）的琼脂糖凝胶上，浸于TBE缓冲液中，在100V条件下电泳80分钟，凝胶将被溴化乙錠所染色。当使用聚丙烯酰胺凝胶电泳时，应使用预制的8.6*6.8cm210%(w/v)的TBE凝胶，在100V条件下电泳60分钟。Marker应使用标记分子量为100-20bp的Sigma低阶marker。 电泳分布情况被集群分析软件处理，该软件使用壹种类似于二进制的指标，它使用UPGMA的方式创建系统树图。同表象相关性将被用于探知由Rossetti和Giraffa描述的确定的和非确定的聚类。同表项相关性的百分比在各个分支中给出。 2.4.该方法的可重复性和微卫星标记的稳定性 通过对每个菌株取五份菌落DNA萃取液进行扩增来检测可重复性，对扩增产物的分析是将其分为五个不同孔道进行琼脂糖电泳而进行的。 为了检验微卫星标记在酒精发酵中的稳定性，检验是在随意挑选的三个菌株中进行的：菌株2，菌株3和菌株5。再水化后，每个菌株被单独接种在盛有灭菌葡萄汁的500ml烧瓶中。在16℃的条件下发酵20天。 表二用于扩增的三株啤酒酵母微卫星位点引物 分析在十组随意选出的菌落中进行，这些菌落取自发酵开始时和结束时的每个菌株。 2.5.发酵 俩株酵母菌株，DSMCepageChardonnay和VitilevureDV10被选中进行发酵试验，因为他们具有相似的用途和特征（用于白葡萄发酵，醇耐受性和表型杀