原代神经细胞培养方法
1 神经细胞培养
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。 我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:
一. 鸡胚背根神经节组织块培养
主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观
察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1． 材料和方法
（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气
室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置
灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧
排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料
培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2． 结果
鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。
二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养
背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。
1． 材料和方法
取新生一天的大鼠(wistar种)和小鼠(昆明种)。用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤,
然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨,暴露脊髓和神经节,用解剖镊分离出神经节。鸡胚背根神经节的取材方法同前。 剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105 个细胞/ml密度的细胞悬液，接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml细胞悬液置。置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。24h后倾去培养皿内种植培养液，改用饲养(Feeding)培养液培养。接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神经细胞的增殖, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。 2 2.培养液成份
种植培养液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L);10%胎牛血清; 10%马血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脱氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。
饲养培养液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,)；5 % 马血清；
NGF 20ng/ml；神经营养素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。
3． 新生大鼠背根节神经元的生长分化和形态特征
新生大鼠背根节神经元接种后4h,大部分细胞可贴壁, 呈圆形或椭圆形,直径8-14μm,
胞体周围呈现一圈光晕。神经元的细胞核位于中央或偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元。接种后24h, 大部分贴壁细胞开始长出突起。其中多数为具有多个突起的多极神经元,少数为双极和假单极神经元, 突起细长,并可观察到突起末端的生长锥。除单个散布的神经元外,还常见到几个或多个神经元聚集在一起, 它们向四周发出树枝状的神经突起。 培养2-3d后神经元的突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的神经网络。随着培养时间的延长, 神经元突起的主干和分枝明显延长并增粗,神经突起网络变得更加稠密, 神经元胞体逐渐增大。大鼠背根节神经元可维持培养2个月。
4． 新生小鼠背根节神经元的生长分化和形态特征
新生小鼠背根节神经元的形态结构和生长分化基本上与新生大鼠相似,但小鼠背根节神经元的胞体较大鼠稍小。 神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大。小鼠背根节神经元亦可维持培养2个月。
5． 鸡胚背根节神经元的生长分化和形态特征
鸡胚背根节神经元的生长分化基本上亦与新生大鼠和小鼠相似。但鸡胚背根节神经元以假单极为多见。 与大鼠或小鼠背根节培养神经元相比,神经突起分枝较少。神经元胞体稍小,神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大。鸡胚背根节神经元亦可维持培养2个月。
三. 新生小鼠颈上交感神经元分散细胞培养
交感神经系统在维持机体的正常功能和对环境的适应性反应中起着十分重要的作用。交感神经细胞培养特别有助于神经细胞发育和可塑性研究，利用体外培养系统可进行交感神经细胞的发生、死亡、形态和生化发育、递质表形的获得，以及靶组织与传入纤维的突触形成的研究。此外，通过体外培养系统可获得关于神经营养因子、激素，细胞因子等调节交感神经元发育的信息，了解传入纤维的输入以及与靶组织的联系的机制。
1．材料和方法
实验用出生当天的昆明种小鼠，在无菌条件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖镊在解剖显微镜下找到气管两侧的颈总动脉,并以此为标志,在颈总动脉分为颈内外动脉交叉处找到上颈交感节, 取出上颈交感节, 置于含 1 % 胶元酶(Collagenase)和1 % 消化酶(Dispase)的2ml混合消化液中消化(37℃， 1 h)分散后，用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的的细胞悬液；接种于涂有小牛皮胶或以小鼠脑皮层胶质细胞为背景的35mm塑料培养皿中，每皿2ml细胞悬液置。置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。24h后倾去培养皿内种植培养液,改用饲养(Feeding)培养液培养。接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液,以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
2． 培养液成份
种植培养液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L)；10%胎牛血清；10%马血清；NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脱氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。
饲养培养液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,)；5%马血清； NGF 3 20 ng/ml；神经营养素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。
3． 新生小鼠交感节神经元的生长分化和形态特征
新生小鼠交感节神经元在含 NGF 的培养液中种植后4h, 细胞即开始贴附在胶元薄膜或在皮层胶质细胞层上生长, 交感神经元的胞体一般为圆形, 有时亦可见椭圆或梭形,体积较大,
直径约8-14μm左右,胞体周围呈现一圈光晕,神经元的细胞核大多偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元 。接种后24h, 大部分贴壁神经元开始长出突起。培养2-3天后,神经元突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的网络。随着培养时间的延长, 神经突起网络变得更加稠密。神经细胞的主干和分枝明显延长并增粗, 神经元的胞体逐渐增大。小鼠交感神经元可维持培养1-2个月。
四. 胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元培养，
中枢神经系统包括脑和脊髓，脊髓是中枢的初级部分，其功能有二，一是传导感觉和运动冲动，二是完成躯体运动的基本反射。脊髓突然被横断并与高级中级失去联系后产生脊休克。因此，利用体外培养的脊髓腹角运动神经元进行脊髓损伤和修复的研究日益受到重视。
1． 材料和方法
用12-14d 胚龄的小鼠、12-14d 胚龄的大鼠、 孵化10 d 的鸡胚，在无菌条件下取出胎鼠或鸡胚脊髓，剥除脊膜后,将整个脊髓腹侧面朝上置于平皿中，用微解剖镊和双面刀片沿脊髓中央管纵切两半，再将脊髓两侧的腹侧部分切下，将组织块切碎， 用0.125% 胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后,用种植培养液(同第二节)稀释成5×105个细胞/ml密度的细胞悬液,接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml,置36℃、10%CO2的培养箱中培养,24h后倾去培养皿内种植培养液, 改用饲养培养液(同第二节)进行培养。以后每周换液两次,每次更换50%的新鲜饲养培养液。
2． 胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元的生长分化和形态特征
胚鼠和鸡胚脊髓腹侧神经元培养12h后,大部分神经元可贴壁,贴壁神经元呈圆形,直径5-8μm,其中少数神经元开始伸出1-2个突起。培养24h后, 神经元突起逐渐增多并延长,形成稀疏的网络,培养的脊髓神经元以双极和多极为多见, 神经元呈圆形或椭圆形及多边形不等,胞核清楚,多数具1-2个核仁。随着培养时间延长, 神经元突起进一步增多、增粗并延长,形成稀疏的神经网络, 神经元胞体逐渐增大。 多极胞体大的神经元逐渐增多,经胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫组织化学染色和乙酰胆碱酯酶(AChE)组化染色呈阳性反应。此后，只要定期换液并适当抑制非神经细胞的过度增殖,胚眙大鼠、胚盼小鼠和鸡胚脊髓腹侧运动神经元在体外可维持培养2个月。
五. 新生大鼠海马神经元分散培养
海马属大脑边缘系统，与情绪、学习及记忆有关，它具有明显的长突触传递的长时间程长时程增强（LTP）和长时程抑制（LDT）的能力。LTP和LDP具有协动性、特异性、长时性的特点，目前已被认为是学习和记忆的基础。而且海马组织常常是引起癫痫发作的病变部位，并且海马细胞对缺血、缺氧特别敏感。这些特征反映了海马神经元的内在性。例如，对缺氧的可塑性和易感性均与NMDA（N-methyi-D-aspartate，N-甲基-D-天冬氨酸）受体的独特性质相关。海马具有中枢神经系统的典型特性，有相对同源性的神经元群体，据估计，海马主要的细胞类型---锥体神经元占海马全部神经元的85%-90%。海马CA1和CA2区含有的锥体细胞在电生理特性及其相互连接的形式上各不相同，并能分别进行培养。海马锥体细胞具有特征性的形态，它们有单根轴突和数根树突组成，所有的树突都高度分化并密布树突嵴。此外，海马锥体神经元相互之间与中间神经元群体之间均有直接联系，在体外培养系统缺乏外源性传入纤维的情况下，海马神经元相互间仍然能产生广泛的突触联系。
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定
一 前 言
神经干细胞(Neural stem cells, NSCS)是神经系统内能产生神经元和胶质细
胞的未分化原始细胞【1-2】。文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分
化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。此外，NSC
还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来
替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而
如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。本实验拟建立
绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培
养技术，为后面的实验提供方法支持。
二 实验所需仪器、试剂及其配制
（一） 实验仪器
光学显微镜 （Olympus,Japan）
倒置荧光显微镜 （LEICA DMIRB）
冰冻切片机 （Leica CM1900，Germany）
光明DZKW型电热恒温水浴锅 （北京市光明医疗仪器厂） XK96-A快速混匀器 （姜堰市新康医疗器械有限公司）
HT-200 电子天平 （成都普瑞逊电子有限公司川制）
FA1004型精密电子天平 (上海良平仪器仪表有限公司)
MP 8001单臂脑立体定位仪 (深圳市瑞沃德科技有限公司)
10μl微量进样器 （Pressure-Lok，PRECISION SAMPLING
CORP，BATON ROUGE，
LOUISIANA，Made in USA）
0.5ml、1ml Eppendorff管 （Ependorff）
手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄
刀片等。
1
（二） 试剂
1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
链脲佐菌素诱导培养皮层神经细胞损伤作用的观察
中西医结合心脑血管病杂志２ＯｌＯ年６月第８卷第６期 ・ ７１９ ・ 链脲佐菌素诱导培养皮层神经细胞损伤作用的观察 马国英，杨小荣，赵欣，秦华平，史瑞红，王晔，张策 摘要：目的研究链脲佐菌素（ＳＴＺ）对原代培养大鼠皮层神经元是否具有损伤作用。方法 常规原代神经细胞培养的方法，培 养新生１ ｄ～３ ｄ的Ｗｉｓｔａｒ大鼠皮层神经元，通过检测ＣＣＫ一８，乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）释放检测和ｃａｌｃｅｉｎ—ＡＭ染色，观察加入不同浓 度ＳＴＺ（１ ｔｏｏｌ／Ｉ １０ ｔｏｏｌ／Ｌ、１Ｏ０ ｍｏｌ／Ｉ １ ０００ ｔｏｏｌ／Ｌ）３６ ｈ后对细胞损伤的作用。结果ＳＴＺ处理后对原代培养大鼠皮层神经 细胞产生明显的损伤作用，包括细胞活力的下降，活细胞数目的减少，ＬＤＨ释放的增加并呈现剂量依赖性。结论 ｓＴｚ对离体培养 的神经细胞具有类似脑室注射同样的神经损伤作用。 关键词：培养神经细胞；链脲佐菌素；损伤 中图分类号：Ｒ２５６．４６ Ｒ７４２．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：ｌ６７２—１３４９（２Ｏ１ Ｏ）Ｏ６一Ｏ７ｌ９—０２ 新近研究结果表明，胰岛素是中枢神经系统内重要的神经 元存活和代谢的调节冈子，具有神经营养作用 。研究显示，中 枢的胰岛素一方面来自外周，另一方面来自神经元自身合成口一， 这些胰岛素参与神经细胞的信号转导，发挥神经细胞的代谢和 调节作用。胰岛素受体密集地分布在海马和认知密切相关的皮 质脑区 ］。胰岛素与细胞膜上的胰岛素受体（ＩＲ）相结合，通过 信号转导过程激发细胞内特定的生理生化反应，发挥调控作 用 。 阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一种常见的以 进行性记忆减退、认知障碍为主要临床表现的中枢神经系统退 行性疾病。研究证实，糖代谢紊乱（糖尿病）和ＡＤ发病机制有 密切的联系 一。ＡＤ也常伴有脑内糖代谢障碍 。因而有专家 提出ＡＤ可能是一种大脑特异的神经内分泌疾病或者称“３型 糖尿病”＿７ 。 链脲佐菌素（ＳＴＺ）是一种烷基化物，腹腔内注射可通过破 坏胰腺８细胞引起糖尿病 ，然而在利用ＳＴＺ诱导的糖尿病的 模型中，观察到神经损伤及ＡＤ样的病理变化。进一步研究发 现，脑室注射ＳＴＺ可以导致正常大鼠出现ＡＤ样的神经退行性 变化。其机制可能是消弱或破坏胰岛素的信号转导，破坏胰岛 素受体的自身磷酸化和内在酪氨酸激酶活性，增加磷酸化酪氨 酸磷酸酶的活性 。在整体动物条件下包括腹腔注射及脑室注 射ＳＴＺ可以干扰胰岛素的信号转导系统，引起糖代谢紊乱，导 致神经损伤及ＡＤ样的退行性病变，那么在离体培养的神经细 胞ＳＴＺ是否可引起同样的神经损伤？ １材料与方法 １．１实验动物出生１ ｄ～３ ｄ的Ｗｉｓｔａｒ大鼠，雌雄不限，南山 西医科大学动物管理中心提供。 １．２试剂 ＳＴＺ、多聚赖氨酸、阿糖胞苷、胰酶、Ｃａｌｃｅｉｎ—ＡＭ 购于Ｓｉｇｍａ公司，ＤＭＥＭ购于Ｇｉｂｉｃｏ，胎牛血清（ＦＢＳ）购于杭州 四季青公司，其余试剂均为周产。将ＳＴＺ溶于Ｄ—Ｈａｎｋｓ溶液 中，配成１０ ｍｍｏｌ／Ｉ ，１ ｍｍｏｌ／Ｌ的母液，由于ＳＴＺ溶液的半衰 期在生理ｐＨ值条件下１９ ｒａｉｎ 。 ，需要溶解后立即使用。 １．３实验分组对照组以全配液进行培养；胰岛素组在全配液 中加入总浓度为１５“ｕ／ｍＩ 胰岛素作对照；ＳＴＺ组在全配液巾 加入浓终度为１５ Ｕ／ｍｌ 胰岛素和终浓度分别为１ ｒｎｏｌ／Ｉ 、１０ ｔｍｌｏｌ／Ｌ、１００ ｔ￣ｍｏｌ／Ｉ 、１ ０００ ｔ￣ｍｏｌ／Ｉ 的ＳＴＺ，继续培养３６ ｈ后观 察细胞的活力以及活细胞数目（乳酸脱氢酶、ＣＣＫ一８和Ｃａｌｃｅｉｎ— ＡＭ染色）。 １．４ 原代皮层神经细胞培养 出生１ ｄ～３ ｄ的Ｗｉｓｔａｒ大鼠， 常规手术，将大脑皮层神经细胞分离成单细胞悬液，经１ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心５ ｒａｉｎ，按细胞的浓度为１×１Ｏ Ｉ 接种于预先用多 聚赖氨酸包被的培养皿或９６孔板中，置３７ Ｃ，５ ＣＯ。培养箱 中培养。２４ ｈ后加入阿糖胞苷（１０ ｔ￣ｍｏｌ／Ｉ ）抑制胶质细胞和血 管内皮细胞的生长。 １．５细胞活力分析 在９６孑Ｌ板中培养的神经细胞经ＳＴＺ诱 导３６ ｈ后，换新的全配液，每空加入１０ Ｉ 的ＣＣＫ ８，３７ Ｃ避 光培养２ ｈ，到酶标仪上测定４５０ ｎｍ吸光度值。 １．６ 乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）释放的检测 将神经细胞培养在培养 皿中，经ＳＴＺ诱导３６ ｈ后，收集细胞培养液进行ＬＤＨ活性的 检测。 １．７ Ｃａｌｃｅｉｎ—ＡＭ染色 将神经细胞培养在有玻片的培养皿 中，经ＳＴＺ诱导３６ ｈ后，用ＰＢＳ液冲洗３次，加入终浓度为１Ｏ ／￣ｍｏｌ／Ｉ 的Ｃａｌｃｅｉｎ—ＡＭ，３７¨Ｃ避光培养２０ ｒａｉｎ，再经ＰＢＳ避光 洗涤３次后，在激光共聚焦显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＦＶ一１０００）下观察 细胞，激发波长为４９０ ｎｍ，发射波长为５１５ Ｉｌｍ拍片。 １．８统计学处理采用ＳＰＳＳ １３．０统计学软件进行分析，计量 资料用均数±标准差（ ±Ｓ）表示，进行单因素方差分析，Ｐ＜ ０．０５为有统计学意义。 ２ 结 果 ２．１ ＣＣＫ一８测定 在培养细胞分别加入胰岛素和ＳＴＺ，观察 对培养细胞的影响。胰岛素组与对照组细胞活力相比无统计学 意义；加入ＳＴＺ后，细胞活力与对照组比较，ＳＴＺ １ ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ组 和ＳＴＺ１０“ｔｏｏｌ／Ｉ 组细胞活力分别下降１ ８．８ ８ 和２ ７．７ ４ （Ｐ＜０．０５），ＳＴＺ １Ｏ０ ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ组和ＳＴＺ １ ０００ ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ组细胞活 力分别下降３７．ｏ９ 和４Ｏ．８８ （Ｐ＜０．０１）。详见表１。 表１ ＳＴＺ诱导皮层神经细胞的损伤作用（ＣＣＫ一８检测） ２．２ Ｃａｌｃｅｉｎ—ＡＭ染色胰岛素组与对照组比较，活细胞的数 量没有明显变化；加入ＳＴＺ后，活细胞的数量与胰岛索组比较， ＳＴＺ １ ｔｌｍｏｌ／Ｉ 和ＳＴＺ １０ ｔ￣ｒｎｏｌ／Ｉ 处理后，活细胞的数量减少， 伴有突起数量的减少；ＳＴＺ １００ ｔ￣ｍｏｌ／Ｉ 和ＳＴＺ １０００ ｔｌｍｏｌ／Ｉ 处 １）为山西省基础研究项目（项目名称：Ｈｕｍａｎｉｎ拮抗ＮＭＤＡ诱导的神经毒作用机制一ＭＡＰＫｓ通路分析）
王鸽脑神经细胞原代分离培养与纯化的研究
第３９卷第３期
２００８年３月 东北农业大学学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ３９（３）：８４－８７
Ｍａｒ．２Ｏ０８
文章编号１００５—９３６９（２００８）０３—００８４—０４
王鸽脑神经细胞原代分离培养与纯化的研究
王 敏，崔雅莉，李文军，徐世文，李 术
（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨１５００３０）
摘要：研究采用７～８日胚龄的王鸽脑组织，采用胰蛋白酶消化法制备神经细胞悬液，接种于包被多聚赖氨 酸的６孔培养板中培养，用阿糖胞苷抑制非神经细胞的生长，以寻求一种简单、可行的原代王鸽脑神经细胞培养方
法。结果表明，试验成功地进行了原代王鸽脑神经细胞培养、纯化，并保证有足够数量的神经元存活，证明酶消化 法原代培养王鸽脑神经细胞是一种可靠、稳定的获得神经元的方法。 关键词：王鸽；神经细胞；原代培养
中图分类号：￥８３６；￥８１３．３ 文献标识码：Ａ
自２０世纪７０年代开始，神经细胞培养技术 已广泛应用于实验室脑损伤、脑血管疾病等神经 系统疾病的研究。建立一个稳定的神经元培养体
系，不仅直接途影响到科研工作的进展，也为诱 导干细胞向神经元定向分化提供可能。目前关于 鼠的原代神经细胞培养技术已成熟，并已对神经 元体外发育规律等进行了研究 ，而对鸟类原代 神经细胞培养的报道较少。为建立一种稳定、可 靠获得纯度较高神经元的方法，特进行本试验， 为鸟类神经系统的离体研究提供试验模型。
１ 材料与方法
１．１试验动物来源 纯种美国王鸽由哈尔滨动物园提供。
１．２主要试剂 ＤＭＥＭ（高糖）培养基购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，多聚 赖氨酸、胰蛋白酶、阿糖胞苷购自Ｓｉｇｍａ公司，优 级胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所，
培养板购自Ｏｒａｎｇｅ公司。 １．３方法
１．３．１培养板处理 在进行培养前４ ｈ，使用０．１ ｍｇ・ｍＬ 的多聚
收稿日期：２００７一Ｏｌ—ｌ５ 基金项目：国家自然科学基金面上资助项目（３０４７１２７８）；黑龙 江省教育厅科学基金项目（１０５４１０２９）；黑龙江省研究生创新基金 （ＹＪｓＣＸ２ｏ０７—０ｏ６４ＨＬＪ） 作者简介：王敏（１９８１一），女，黑龙江人，硕士研究生，研究 方向为环境毒理学。 通讯作者Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｕｓｈｉｗｅｎ１０１＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ 赖氨酸对６孔培养板进行包被，待接种细胞悬液 前弃去其内液体，并使用无菌ＰＢＳ液冲洗２～３遍， 待用。
细胞的原代培养和传代培养
实验五 细胞的原代培养和传代培养
1. 实验目的
初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。
2. 实验指导
细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。
细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。
要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。
贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。
常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。二者可分别使用，也可共同使用。钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。
细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。
胎鼠DRG神经元细胞培养方法的建立
收稿日期262基金项目国家自然科学基金资助项目(366)作者简介杨瑞瑞(82),女,硕士生,专业方向神经及血管电生理。通讯作者司军强(652),男,教授,从事神经及血管电生理研究。第25卷 第5期2007年10月石河子大学学报(自然科学版)
JournalofShiheziUniversity(NaturalScience)Vol.25 No.5Oct.2007
文章编号:100727383(2007)0520596203
胎鼠DRG神经元细胞培养方法的建立
杨瑞瑞1,石文艳1,骆海舰1,赵 磊1,成洪聚1,司军强1,2
(1新疆地方与民族高发病教育部重点实验室,新疆石河子832002;2武汉大学基础医学院生理学系,湖北武汉430071)
摘要:目的建立胎鼠背根神经节(dorsalrootganglion,DRG)神经元原代培养的方法。方法无菌条件下取E16天的胎鼠DRG进行原代培养,观察神经元生长状态并用神经元特异性烯醇化酶(neuronalspecificenolase,NSE)免疫细胞化学染色鉴定细胞。结果培养的DRG神经元可存活1个月左右,并长出突起,形成密集的网络。NSE鉴定细胞阳性表达率高,神经元达到90%左右纯度。结论本文建立了DRG神经元细胞简洁、经济、高效的培养方法并成功鉴定了神经元。为对神经元的深入研究提供了实验模型。关键词:神经元;细胞培养;背根神经节;特异性烯醇化酶;免疫细胞化学中图分类号:R338.1 文献标识码:A
细胞培养是从体内组织取出细胞在体外模拟体
内环境下,使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术。该技术已经成为当今生物医学研究的
主要方法之一。其主要优点在于,体外细胞培养的
条件减少了在体神经组织的复杂性以及对细胞环境
的操纵性,有利于预测和研究单个细胞在在体的功能[1]。此外,有大量证据表明,体外培养的神经细胞
也能表达许多在体细胞的同样特征,更重要的是培
养的细胞的膜特性不变,受体的所有组成成分不变[2]。但是神经元高度分化,离体和出生后即不再
小鼠原代神经元提取
小鼠原代神经元提取
1. 背景介绍
小鼠是神经科学研究中常用的实验动物，尤其是小鼠原代神经元是研究神经细胞生长、形态及功能的理想模型。提取小鼠原代神经元是展开这类研究的重要步骤。
2. 提取方法
2.1 原代神经元分离
将小鼠脑的皮层或海马区取出，用酶消化等方法分离出原代神经元。其中，较为常用的来源是阿霉素（Ara-C）处理后，剥离出菜花状星形胶质细胞后得到神经元。
2.2 细胞贴附
将原代神经元移植到附着于玻璃片或培养皿的细胞培养基中，使其附着并生长。
2.3 细胞培养
在培养基中加入营养物质，如神经生长因子、谷氨酸等，加速神经元的生长，并使组成更加丰富多彩。
2.4 细胞鉴定
通过标记染色、光镜观察等手段，检测培养出来的细胞是否为神经元。 3. 应用领域
小鼠原代神经元的提取及培养成为研究神经科学和神经元特性的重要手段。研究重点主要包括神经元的细胞膜特性、各种信号转导途径、神经元与神经胶质细胞之间的相互作用及神经元发育等问题。此外，还可运用于药理学研究、癫痫及脑防护药物的开发研究等。
4. 注意事项
提取方法中，对原代神经元的提取、分离及培养有许多细节问题，包括材料选择、酶消化时间调节、培养基添加条件等。在实验过程中，需要注意操作规范化、洁净化，并遵守实验室安全规范。
胚胎大鼠背根神经节神经元的原代培养
胚胎大鼠背根神经节神经元的原代培养
孙青;梁晓春;张宏
【摘 要】目的 原代培养胚胎大鼠背根神经节神经元(DRGn),并观察其生长特性.方法 取E15 SD胎鼠的背根神经节,用胰蛋白酶消化法分离成单细胞,通过密度梯度离心法和差速贴壁法进行分离纯化,在无血清培养基中培养,用抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体鉴定神经元.结果 纯化培养神经元生长状态良好,纯度可达93％左右.结论 该方法具有较好的可操作性和可重复性,用于DRGn的相关实验研究.
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2016(045)001
【总页数】4页(P66-68,73)
【关键词】背根神经节神经元;原代培养;胚胎大鼠
【作 者】孙青;梁晓春;张宏
【作者单位】100730 中国医学科学院/北京协和医学院北京协和医院中医科;100730 中国医学科学院/北京协和医学院北京协和医院中医科;100005 中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所细胞中心
【正文语种】中 文
【中图分类】R3
背根神经节神经元(dorsal root ganglion neuron，DRGn)是周围神经系统重要的初级感觉神经元，能量代谢旺盛，线粒体丰富，这种结构和功能特点使其对高糖和氧化应激等具有高度易感性，是周围神经病变重要的靶细胞之一[1]。DRGn因其原代培养难度大、纯化复杂、培养基条件要求高，相关报道较少。本研究介绍一种实验中摸索出的DRGn原代培养方法，旨在为周围神经病变的体外研究提供可靠的实验模型。
1.实验动物：孕15天(E15)的SPF级Sprague Dawley(SD)大鼠，购自北京大学医学部实验动物科学部，实验动物许可证号：SCXK(京)2006-0008。
2.主要试剂与仪器：Neurobasal培养基、DMEM高糖培养基、神经生长因子、B27添加剂(美国Invitrogen公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、Hepes、多聚赖氨酸(美国Sigma公司)；青霉素、链霉素(华北制药集团有限公司)；人淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品公司)；兔抗大鼠NSE多克隆抗体(丹麦Dako公司)；其余试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。CO2培养箱(美国Forma公司)、超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)、倒置相差显微镜(日本Olympus公司)、激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)(德国Leica公司)、低温高速离心机(美国Thermo公司)、解剖显微镜(上海光学仪器六厂)。
包被细胞培养板的相关问题
培养板的包被及相关问题：为了适应不同的实验需要，可对培养板用不同的物质进行包被后使用，这其中有促进细胞黏附的，也有用于一些特殊检测需要的。不同的实验目的可能具体的方案亦不同，根据需要灵活掌握。
(一)多聚赖氨酸包被：
问：我要培养原代神经细胞培养，要用多聚赖氨酸铺细胞培养板，请问赖氨酸液怎么配，怎样铺扳子
答：配制0.01%的多聚赖氨酸: 首先买来sigma 公司的多聚赖氨酸，如是25mg，就需要250ml三蒸水，用移液管将少量三蒸水加到多聚赖氨酸的小塑料瓶中，然后将溶解的多聚赖氨酸加到200ml左右三蒸水中，(已置烧杯中)。最后加三蒸水达250ml，过滤除菌分装与小瓶中即可。保存于-20度，近期用的话可放于4度冰箱内保存。注意每一小瓶的量不要太满，若20ml的瓶子，只装15ml可，若太满，放于-2度有可能会将瓶子弄碎，因冻后体积增加。(我就有这个教训) 另外烧杯，小瓶、移液管都要灭菌处理的，泡酸高压什么的。我们用的是一种用注射器过滤的过滤器，一次性的。一个能最多有效过滤200ml。
铺板的操作:首先要在消毒实验室，包括超净台，紫外消度20-30分钟。消毒后30分钟进入实验室。事先准备100ml三蒸水，经高压灭菌处理。具体细节就不多说了。
首先打开板子，用消毒好的试管将0.01%的多聚赖氨酸加入每一孔中，大概每孔3-4滴吧。将板子盖好放到培养箱中(37度 5%CO2)30分钟。
取出板子，用吸管将多聚赖氨酸吸出。换吸管，加入三蒸水，冲洗三次，即将每孔内加入三蒸水，没过底，多点也行。再将水吸出来。反复三次。注意换吸管，要无菌操作的。
最后将铺好的板子放于培养箱待用。
如果你做免疫组化，需要放小的玻片到孔内，就在加多聚赖氨酸之前用无菌的镊子将无菌的玻片夹到孔内即可。
问：PLL的分子量有3-5万，7-15万，15-30万几种，应怎样选择？？谢谢：）
答：我们养神经细胞，用的是分子量3万到7万的pll 。
参麦注射液对缺氧_缺糖_复氧诱导神经细胞损伤的影响
·1056· 中国中医药信息杂志 2004年12月第11卷第12期
参麦注射液对缺氧/缺糖/复氧诱导
神经细胞损伤的影响
张根明,孙塑伦,朱陵群,王硕仁,高 颖,张 壮
(北京中医药大学东直门医院,北京 100700)
摘要：目的 探讨参麦注射液对缺氧/缺糖/复氧诱导神经细胞凋亡及胞浆内游离钙的影响,阐明参麦注射液治
疗缺血性中风急性期的脑保护作用机制。方法 用孕17～18 d的SD胎鼠大脑皮层作原代神经细胞培养,制作缺氧/
缺糖/复氧致神经细胞损伤模型,采用 AnnexinV/PI 双染色法以流式细胞仪定量分析神经细胞凋亡率；FIuo-3负
载,流式细胞仪定量分析胞浆内游离钙的变化。结果 参麦注射液能降低缺氧/缺糖/复氧原代培养神经细胞的凋亡
率和胞浆内游离钙浓度。结论 参麦注射液治疗急性缺血性中风的疗效机制与提高神经细胞耐缺血缺氧能力,抑制
细胞内钙超载,从而减轻凋亡有关。
关键词：参麦注射液；神经细胞；缺氧/缺糖/复氧；凋亡；钙超载
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2004)12-1056-02
Effect of Shenmai Injection on the Injured Neurons Cell Following Hypoxia/Hypoglycemia/
Reoxygenation ZHANG Gen-ming, SUN Su-lun, ZHU Ling-qun, et al (Dongzhimen Hospital of Beijing University
of TCM, Beijing 100700, China)
Abstract：Objective To investigate the effect of Shenmai injection (SMI) on the injured neurons cell following hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation and to clanify the intrinsic mechanism of SMI treating acute ischemic apoplexy and protecting brain. Methods The cortical neurons of E 17～18 days fetal rat was primarily cultured. The injured model of primary cultured cortical neurons following hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation was established. Effect of SMI on cytosolic free calcium concentration as well as the rate of apoptosis following hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation was analyzed quantitatively by flow cytometry. Results SMI could reduce the rate of apoptosis and lower the concentration of cytosolic free calcium remarkably.
原代培养星形胶质细胞 鉴定方法
原代培养星形胶质细胞 鉴定方法
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原代培养星形胶质细胞鉴定方法
在神经科学领域，对星形胶质细胞的研究日益受到重视。这种细胞在神经系统中发挥着重要作用，包括支持神经元、维持神经环境稳定等。原代培养星形胶质细胞是研究该领域的重要手段之一，而其鉴定方法更是至关重要。本文将介绍原代培养星形胶质细胞的鉴定方法，包括步骤、技术、以及实验注意事项等。