胃肠道间质瘤的临床病理及免疫组化分析

摘要：目的：探讨胃肠道间质瘤（GIST）的临床表现、临床病理特征和免疫组织化学特征。方法：对我院18例手术切除的GIST患者标本的临床表现、临床病理特征和免疫组织化学特征进行分析。结果：本组GIST最常发生于小肠，占55.6%（10/18）；其次为胃，占27.8%（5/18）；直肠，占11.1%（2/18）；结肠，占5.6%（1/18）。肿瘤最小0.6cm×0.5cm×0.4cm，最大25cm×14cm×12cm。梭形细胞为主14例，上皮样细胞为主3例，混合细胞（兼有梭形和上皮样细胞特征）1例。本组GIST的CD34阳性率88.9%（16/18），CD117阳性率94.4%（17/18），SMA灶性阳性率16.7%（3/18），S-100均阴性，Desmin均阴性。18例GIST患者中，良性5例，交界性9例，恶性4例。结论：免疫组化联合使用，包括CD117和CD34在内的一组抗体是必要的，只有这样才可能提高GIST的诊断率。但在GIST良、恶性诊断上仍需结合肿瘤的大体、组织学形态及生物学行为等综合考虑。

关键词：胃肠道间质瘤；病理；免疫组化

GIST是消化道最常见的间叶源性肿瘤，是一种独立的疾病，在形态学上主要由梭形细胞和上皮样细胞组成，因其形态多变，光镜下很难与平滑肌（肉）瘤和神经鞘瘤相区别[1]，随着免疫组化及分子生物学研究的突破，发现这类肿瘤具有多种免疫表形及分化，不一定具有平滑肌的免疫表型和电镜特点，目前认为其起源于胃肠道壁的卡哈尔细胞并表达CD117和/或CD34。本篇对18例GIST 的临床表现、临床病理特征、免疫组织化学特征等进行分析，为GIST的诊断、鉴别诊断和治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

18例标本来自我院病理科2001年11月—2007年11月期间手术切除的GIST 患者，均符合目前公认的GIST组织学形态标准[2]，并经免疫组化染色证实诊断；其中男10例，女8例；年龄15～83岁，平均54岁；临床表现主要为呕血、黑便、黏液便、腹痛、腹胀和腹部包块。

1.2 方法

全部标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，厚4mm连续切片，HE染色，光镜观察。采用S-P法检测CD117、CD34、结蛋白（Desmin）、平滑肌肌动蛋白（SMA）和S-100蛋白（S-100）。切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后，

3%H 2O 2冲洗；血清封闭非特异抗体；加一抗在室温下放置2h，冲洗；滴加试剂1，室温20min，冲洗；滴加试剂2，室温20min，冲洗；应用DAB溶液

免疫组化染色操作步骤

免疫组化染色操作步骤 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】

免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和 2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H 2O 2 和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）

胃肠道间质瘤的治疗

胃肠道间质瘤的治疗发表时间：2010-08-25T16:09:32.513Z 来源：《中外健康文摘》2010年第16期供稿作者：刘文彬[导读] GIST不包括平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、施万瘤和神经纤维瘤等，也不包括恶性黑色素瘤、纤维瘤病、血管肉瘤和Ewing肉瘤刘文彬（黑龙江省中医药大学 150040）【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)16-0107-01 【摘要】目的探讨胃肠道间质瘤诊断和治疗。方法回顾性分析2006年6月～2008年12月浙一医院外科收治并经病理证实的23例胃肠道间质瘤的临床资料。结果本组患者共23例,平均年龄54.5岁,男16例,女7例,均发生于胃部。病理诊断示:交界性4例,良性2例,恶性4例。其中6例行免疫组化检查。CD117,CD34(+)5例,SMA,S-100(-)6例。10例均行胃部分切除或大部切除术,其中1例行腹腔镜胃部分切除术。结论胃肠道间质瘤的诊断需要内窥镜、病理诊断和免疫组化的结合。手术切除是最主要治疗方法。【关键词】胃间质瘤胃肠道间质瘤治疗胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是一种免疫表型上表达KIT蛋白(CDll7)、遗传学上存在频发性c-kit基因突变、组织学上主要以梭形细胞和上皮样细胞呈束状交叉或弥漫性排列为特征的胃肠道间叶组织来源的肿瘤。 GIST不同于胃肠道的其他间叶源性肿瘤(gastrointestinal mesenchymal tumor，GIMT)。 GIMT除包括GIST外，还包括平滑肌瘤和肉瘤、施万瘤、神经纤维瘤、颗粒细胞瘤、脂肪瘤、球瘤、Kaposi肉瘤和血管肉瘤等。GIST不包括平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、施万瘤和神经纤维瘤等，也不包括恶性黑色素瘤、纤维瘤病、血管肉瘤和Ewing肉瘤等。一临床资料一般资料：本组23例中男12例，女11例，年龄35～74岁，平均57.2岁；50岁以上16例（69.5%），40岁以下仅2例，所以病例诊断均经手术及病理结果证实，23例患者中胃间质瘤13例（56.5%），小肠间质瘤5例（21.7%），结肠间质瘤3例（13.0%），食管间质瘤2例（8.69%）。二临床特点 1．性别和年龄肿瘤略多见于男性或男女相等，发病高峰年龄55～65岁，40岁以下少见。 2．部位整个消化道均可发生GIST，最常见于胃(60％～70％)，以下依次为小肠(20％～30％)，结、直肠和食管分别为18．1％和1．4％。偶尔，相似于GIST的肿瘤也可发生于腹腔软组织(网膜、肠系膜)和腹膜后，称为胃肠道外间质瘤(extra-gastrointestinal stromal tumor，EGIST)。EGIST少见，约占GIST的3％～4％，肿瘤位于网膜和肠系膜者多于腹膜后者。 3．症状和体征肿瘤小，通常无症状。常在体检、X线、胃镜检查、CT检查或在其他手术时偶尔发现。肿瘤大，可出现症状，通常为非特异性，与部位有关。位于食管者可有吞咽困难；位于胃者可有不适、上消化道溃疡和出血；位于肠道者可有腹痛、腹块、梗阻、便血或穿孔等。恶性肿瘤可有体重减轻、发热，偶尔出现腹腔播散和肝转移症状。三诊断和鉴别诊断在做GIST诊断时，形态学标准仍具有不可替代的作用，Rosai认为，至少目前形态学比 CDl 17免疫染色在预测治疗反应和预后方面要好得多，并指出，用单个分子改变作为肿瘤分类惟一标准的危险性。大多数GIST都有明确的临床病理特点，病理学家对诊断GIST是否必须用免疫组化证实KIT阳性的意见不完全一致。一些学者认为，不必做免疫组化可以诊断，而且KIT阳性肿瘤不一定都是GIST，文献报告，精原细胞瘤、肥大细胞瘤、恶性黑色素瘤均表达KIT，某些透明细胞肉瘤、Ewing肉瘤、原始神经外胚层瘤、Kaposi肉瘤、血管肉瘤、孤立性纤维瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、肌纤维母细胞瘤、纤维瘤病、分化良好脂肪肉瘤和转移性小细胞癌都可不同程度表达KIT。尽管如此，目前多数意见认为，为了使GIST诊断标准化和确定病人是否适宜应用伊马替尼治疗，应做KIT免疫染色。四治疗治疗上首选手术切除，对于术后切缘阳性的肿瘤或高度恶性者，应给予相应的辅助治疗；而对复发的或者转移者，甲磺酸伊马替尼是首选，根据具体情况采用并结合手术治疗。完全切除是外科治疗的关键，此疾病具有很高的转移率和手术后复发率。手术的规范、合理是影响疗效的重要方面。切缘阴性的完整切除为外科治疗标准。不同于胃癌或肠癌，间质瘤的生长方式是膨胀式生长。切缘不需要达到5cm，一般认为，切缘2～3cm已经足够。其转移方式与上皮来源的癌不同，以腹腔种植和血行转移为主，淋巴结转移的发生率低于10％，因此不主张进行淋巴结清扫。无瘤操作是降低手术后复发的重要环节，假包膜破裂不但可能导致出血，而且显著增加肿瘤种植转移的危险。最佳手术方式是包括肿瘤组织和周围部分正常组织在内的完整切除。扩大切除并不能提高生存率，只有当肿瘤侵犯邻近器官时，为防止种植播散和切缘阳性，可将邻近脏器一并切除。手术前穿刺可能造成肿瘤破裂和出血，增加肿瘤播散风险。因此，对于临床怀疑为 GIST者，手术前不做穿刺活检。参考资料 [1]朱雄增，侯英雄.对胃肠道间质瘤的再认识[J].中华病理学杂志，2004，33(l):3. [2]师英强,杜春燕.胃肠道间质瘤临床治疗进展[J].实用肿瘤杂志,2003，18(4)∶263. [3]吴斌，等.胃间质瘤的手术治疗.中国现代手术学杂志,2005,9(3):1183-185.

2020 CSCO胃肠间质瘤指南首次发布详解指南要点

2020 CSCO胃肠间质瘤指南首次发布详解指南要点从共识到指南，CSCO胃肠间质瘤（GIST）指南今年首次发布：推荐等级更高；由文字变为表格，使用更便捷；依据证据级别进行推荐，更具说服力。今年BOC/BOA会议期间，北京大学肿瘤医院的李健教授为大家解析了CSCO胃肠间质瘤2020版指南要点。详情如下： CSCO GIST指南由六部分构成：病理、影像、手术、药物、随访、附录。病理部分对于经典型GIST病理类型，I级推荐新增SDHB（胃），其他I级推荐包括CD117、DOG-1、Ki67；II级推荐：CD34；III级推荐：PDGFRA。SDH缺陷型GIST的I级专家推荐同经典型GIST。II级推荐为SDHA。 NF1相关性GIST的I级专家推荐包括CD117和DOG-1，II级专家推荐为Neurofibromin。 BRAF突变型GIST的I级专家推荐包括CD117和DOG-1，II级专家推荐为BRAF。 GIST分子检测 GIST分子诊断适应人群，I级推荐：拟行靶向治疗患者、继发性耐药患者；II级推荐新增：如一代测序检测为野生型GIST，可行NGS，其他推荐包括

低危GIST、疑难病例明确诊断、同时性或异时性多原发GIST；III级推荐新增：小GIST、微小GIST。外科治疗外科治疗总体原则没有更新，手术目标的I级推荐为原发GIST R0切除（2A 类证据）或需急诊处理并发症或转移性GIST切除；淋巴结清扫的I级专家推荐：通常无需淋巴结清扫，存在病理性肿大淋巴结的情况下需行淋巴结清扫（2A类证据）。小GIST的处理原则是今年指南的重要更新：对于胃部最大径≤2cm小GIST，且有不良因素患者，I级推荐更新：表现为不良生物学行为的小GIST，开放手术切除或腹腔镜切除（2A类证据）；II级推荐更新：胃小弯侧、胃后壁、胃食管结合部等部位GIST,腹腔镜或内镜切除（有经验的腹腔镜中心）（2B 类证据）。辅助治疗对于高危患者，新增III级推荐：伊马替尼辅助治疗5年（3类证据）（肿瘤破裂患者应延长伊马替尼辅助治疗时间）；这类患者的I级推荐为伊马替尼辅助治疗3年（1A类证据）。相关研究进展 PERSIST-5研究是一项单臂II期研究，旨在评估5年伊马替尼辅助治疗用于原发性GIST的疗效和安全性，主要终点为无复发生存率（RFS），研究纳入

胃肠道间质瘤诊治指南

胃肠道间质瘤诊治指南 1.定义 GIST是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，由突变的c-kit 或血小板源性生长因子受体α (PDGFRA)基因驱动;组织学上多由梭形细胞、上皮样细胞、偶或多形性细胞，排列成束状或弥漫状图像，免疫组化检测通常为CD117或D0G-1表达阳性。 2.流行病学 GIST 临床较为少见，发病率约为1/10万～2/10万，占胃肠道肿瘤的2%～3% ，发病部位从食管到肛门皆可出现，而胃和小肠最为多见，60% ～70%发生于胃部，以胃体、胃窦和贲门部多见，20%～30%发生于小肠，结直肠占5%，食管<5%，近年来在肠系膜、网膜、肝脏及女性阴道等处也发现了间质瘤。发病年龄多>40岁，男性多于女性。 3.病因研究认为c-kit基因的功能获得性突变是引起GIST的主要原因。这些功能获得性突变最常位于外显子11(71%)，其他外显子，如9、13、14、17不常见，而外显子11突变的患者对伊马替尼的治疗反应。小部分KIT阴性GIST患者存在血小板原性生长因子受体α(PDGFRA)外显子18点突变或缺失，此部分患者对伊马替尼治疗不敏感。 4.病理解剖 4-1GIST 的生长方式 GIST 可向腔内和/ 或腔外生长，通常与周围组织界限清楚，可有或无包膜，切面灰红或灰白色，较大的肿瘤可发生出血坏死或黏液样变性。肿瘤生长方式有腔内型：向腔内生长，表面可出现溃疡;壁内型：沿胃肠道管壁内生长，舯物表面黏膜隆起;腔外型：向腔外生长舯物;混合型：腔内、腔外混合生长。 4-2.组织学特点 GIST 具有很大的组织学变异，需借助免疫组化来验证诊断。GIST 呈阳性表达的标记物有：kit(95%)、CD34(60%～70%)、ACAT2(平滑肌肌动蛋白30%～40%)、S100(5%)、DES(结蛋白1%～2%)、角蛋白(1%～2%)，其中KIT 是最特异、最敏感的标记物，然而约5%的GIST 为KIT 阴性，且这类患者的一部分可能获益于KIT 靶向治疗。 5.病理生理 5-1.c-kit 基因突变 1998 年Hirota率先发现GIST 中存在c-kit 基因功能获得性突变及c-kit 蛋白产物

免疫组化操作步骤

免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#

免疫组化操作流程试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。操作流程免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化：脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟；无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟；自来水中浸泡3分钟；

梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片）高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；

胃肠道间质瘤的治疗

胃肠道间质瘤的治疗胃肠道间质瘤（GIST）是胃肠（GI）道最常见的肉瘤，这种疾病不常见，占所有胃肠道肿瘤的1％，GIST通常是成人疾病，中位年龄约为60岁，男性占优势。虽然GIST可能出现在从食道到直肠的任何地方，但胃是最常见的部位，其次是小肠。大多数小肠肿瘤存在于空肠和回肠中，少数在十二指肠中发生。该疾病的病理生理学的理解已经迅速发展，并且目前可能比任何其他GI恶性肿瘤更好。目前的发现GIST的发展似乎需要与ICC谱系转录因子ETV1合作的酪氨酸激酶的致癌活化。大约75％的GIST具有活化突变KIT，与PDGFRα 在另外10％的突变。 GIST的多数大小为5至7厘米，但肿瘤可能超过30厘米。GIST可以通过症状发现，或者在其他病症的检查期间或在无关手术时通过内窥镜检查或成像偶然发现。大多数症状都是非特异性的，例如早期饱腹感和腹胀。其他人会出现腹痛或明显肿块。GIST不像腺癌那样原发粘膜，而是从肠壁的肌肉层生长，但由于粘膜的侵蚀，仍然可能伴有多达四分之一的患者出血。肿瘤出血也可能从肿瘤破裂进入腹腔，这可能导致危及生命的出血。肠梗阻很少见，因为GIST倾向于通过取代其他结构而不是侵入它们来增长。转移通常涉及肝脏或腹膜腔。淋巴结受累在成人GIST中很少见。诊断口腔和静脉造影的腹部和骨盆CT是首次评估GIST的首选影像学检查。典型的GIST表现为胃或肠壁发生的增强肿块。大块肿块可能表现出由坏死引起的异质增强。CT上可能看不到小的GIST。由胃引起的大血管性GIST可能被误认为原发性肝肿瘤。单独的CT检查，确定相邻结构是否涉及大肿瘤可能是困难的。在探索时，通常发现这种肿瘤是可移动的并且可能不需要多部分切除。对于壶腹周

中国胃肠间质瘤诊断治疗共识(完整版)

中国胃肠间质瘤诊断治疗共识（完整版）近年来，胃肠间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）在诊断、治疗及研究领域取得快速进展，部分研究结果将对GIST临床诊疗实践产生重要影响。为了进一步推动我国GIST的规范化诊断和治疗，经中国临床肿瘤学会（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）胃肠间质瘤专家委员会对关键内容进行充分讨论，并对争议问题进行投票，最终，在2013年版共识基础上，形成了《中国胃肠间质瘤诊断治疗共识（2017年版）》，现予公布。 1 病理诊断原则 1.1 GIST的定义GIST是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，在生物学行为上可从良性至恶性，免疫组化检测通常表达CD117和DOG1阳性，显示卡哈尔细胞（Cajal cell）分化，大多数病例具有c-kit或血小板源性生长因子受体α多肽（platelet derived growth factor receptor alpha，PDGFRA）基因活化突变，少数病例涉及其他分子改变，包括SDHX、BRAF、NF1、K/N-RAS及PIK3CA等基因突变等。 1.2 对标本的要求手术后的标本需要及时固定，标本离体后应在30分钟内送至病理科，采用足够的中性10%福尔马林液（至少3倍于标本体积）完全浸泡固定。对于直径≥2 cm的肿瘤组织，必须每隔1 cm予以切开，达到充分固定。固定时间应为12～48小时，以保证后续免疫组化和分子生物学检测的可行性和准确性。有条件的单位应留取新鲜组织妥善冻存，以备日后基因检测之用。

1.3 GIST的病理诊断和辅助检测 1.3.1 基本诊断组织学上，依据瘤细胞的形态可将GIST分为3大类：梭形细胞型（70%）、上皮样细胞型（20%）及梭形细胞-上皮样细胞混合型（10%）。即使为同一亚型，GIST的形态在个例之间也可有很大的差异。除经典形态外，GIST还可有一些特殊形态，少数病例还可见多形性细胞，尤多见于上皮样GIST。间质可呈硬化性，可伴有钙化，特别是小GIST，偶可呈黏液样等。此外，发生于小肠的GIST内常可见嗜伊红色丝团样纤维小结（skeinoid fiber），对诊断也具有一定的提示性意义。 1.3.2 靶向药物治疗后的GIST 经靶向药物治疗以后，GIST可发生坏死和（或）囊性变，部分病例中细胞密度明显降低，瘤细胞成分稀疏，间质伴有广泛胶原化，可伴有多少不等的炎性细胞浸润和组织细胞反应。近年来，经靶向治疗后再经手术切除的GIST标本也逐渐增多，对这类标本推荐的组织学疗效评判标准为：①轻微效应，0%～10%；②低度效应，＞10%且＜50%；③中度效应，≥50%且≤90%；④高度效应，＞90%。但是组织学评估疗效与GIST预后的相关性尚有待于更多病例的积累和研究。 1.3.3 GIST的免疫组化GIST的免疫组化检测推荐采用CD117、DOG1、CD34、琥珀酸脱氢酶B（SDHB）及Ki67标记，可酌情增加SDHA 标记。CD117和DOG1建议加用阳性对照。 1.3.4 GIST的分子检测应在符合资质的实验室进行分子检测，推荐采用聚合酶链式反应（polym-erase chain reaction，PCR）扩增-直接测序的方法，以确保检测结果的准确性和一致性。GIST的分子检测十分重要，有助于疑难病例的诊断、预测分子靶向药物治疗的疗效及指导临床治疗。

免疫组化步骤

免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法 1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。 2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min →二甲苯II 20min→二甲苯Ⅲ20min →无水乙醇10min（清洗二甲苯）→无水乙醇10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置} 目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境 <以下步骤是为细胞染色做准备> 3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}； 4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。枸橼酸修复液只能用一次。修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s,如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。 5）到时间后，把高压锅放入水池中用凉水冲至气体放出完，旋下锅盖，自然冷却至室温，大于30min。 6）冷却后取出切片架用凉清水冲洗3次，放入3% H2O2 罐中10min，目的：封闭过氧化物酶。【每天用前新放入10ml H2O2 】【配制方法：1000ml 3%的过氧化氢=100ml 30%过氧化氢+900ml蒸馏水，（H2O2保存需避光）】 7）捞出后用凉清水冲洗多次，应注意H2O2 有腐蚀性，最后一次用PBS（磷酸盐缓冲液），PBS

对伊马替尼继发耐药的晚期胃肠道间质瘤治疗策略

中国实用外科杂志2012年8月第32卷第8期论著文章编号：1005-2208（2012）08-0648-04 对伊马替尼继发耐药的晚期胃肠道间质瘤治疗策略探讨王洪山a ，王翠众a ，侯英勇b ，沈坤堂a ，高晓东a ，秦净a ，孙益红a ，秦新裕a 【摘要】目的探讨对伊马替尼继发耐药的复发和转移的晚期胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors, GIST ）的治疗策略。方法回顾性分析复旦大学附属中山医院2000—2009年对伊马替尼继发耐药的复发和转移的晚期8例GIST 病人的临床资料。结果所有病人均行手术治疗，完整切除原发肿瘤后，肿瘤复发和（或）转移，口服伊马替尼治疗产生继发耐药，采取手术切除复发和转移灶（特别是耐药病灶）联合伊马替尼等靶向治疗为主的综合治疗模式，均获得较好的治疗效果。1例死亡，存活96个月；其余7例仍存活，目前存活时间65~145个月，平均98.6个月。结论伊马替尼继发耐药的复发和转移的晚期GIST ，选择手术联合酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗为主的多学科综合治疗模式，参考肿瘤的基因状态，采取个体化治疗，可取得较好的疗效。【关键词】胃肠道间质瘤；伊马替尼；耐药；复发；转移中图分类号：R6文献标志码：A Treatment of advanced gastrointestinal stromal tumors acquired resistance to imatinib WANG Hong-shan*, WANG Cui-zhong,HOU Ying-yong,et al.*Department of General Surgery,Zhongshan Hospital,Fudan University, Shanghai 200032,China Corresponding author:SHEN Kun-tang,E-mail:kuntang_shen@https://www.360docs.net/doc/c16927402.html, Abstract Objective To discuss and explore the treatment strategy for recurrent and metastatic advanced gastrointestinal stromal tumors (GIST)acquired resistance to imatinib.Methods The clinical data of 8cases of recurrent and metastatic advanced GIST acquired resistance to imatinib admitted between 2000and 2009at Zhongshan Hospital of Fudan University were analyzed retrospectively.Results All cases were performed complete resection of primary tumors,followed by oral administration of imatinib.All cases got acquired resistance to imatinib before or after recurrence and/or metastasis.A comprehensive treatment of surgical resection combined with molecularly targeted therapy was employed with considerably effectiveness in all cases.One case died of recurrence after 96months of survival time.Other 7cases survived for 98.6months of the mean existing survival time （65-145months ）.Conclusion For recurrent and metastatic advanced GIST acquired resistance to imatinib,a multidisciplinary approach,mainly characterized by surgical resection combined with molecularly targeted therapy based on gene features,is an effective treatment strategy,which can offer a better prognosis. Keywords gastrointestinal stromal tumors;imatinib;resistance;recurrence;metastasis 近年来，伊马替尼成为复发、转移性胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST ）治疗的一线药物，然而，对于伊马替尼继发耐药的复发和转移的晚期GIST 的治疗目前仍是一个棘手的问题。回顾性分析我院2000-2009年收治的8例对伊马替尼继发耐药的复发和转移的晚期GIST 病人的临床资料。报告如下。 1临床资料本组8例GIST 病人，年龄29~70岁，其中胃间质瘤3例，小肠间质瘤4例，直肠间质瘤1例。首次手术均完整切除原发病灶后，肿瘤复发和（或）转移，口服伊马替尼治疗中产生继发耐药。针对复发和转移病灶（特别是耐药病灶），采取了手术切除联合伊马替尼等靶向治疗为主的综合治疗模式，参考肿瘤的基因状态，合理选择药物剂量，及时改换药物，适时手术，病人均获得了较好的治疗效果。1例死亡，存活96个月；其余7例仍存活，目前存活时间65~145个月，平均98.6个月。病人的具体临床资料见表1。基金项目：国家自然科学基金青年基金资助（No.81101809）作者单位：复旦大学附属中山医院a.普外科b.病理科，上海200032 通讯作者：沈坤堂，E-mail：kuntang_shen@https://www.360docs.net/doc/c16927402.html, · ·648

免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较

免疫组化组织细胞地取材、固定、切片操作方法及要点

从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。用于免疫组化的组织一般取材大小为1．OcmXl．OcmX0．2cra。取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。一、动物的致死法及取材 (一)致死法 (1)空气栓塞法向动物静脉注入一定量的空气，使动物很快死亡。一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。 (2)麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器进行麻醉，也可用4％戊巴比妥作静脉注射，或用20％氨基甲酸乙酯做腹腔注射。适用于鼠等小动物。 (3)断头法用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。适用于小动物。 (4)去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。 (5)股动脉放血法动物麻醉后，切开股动脉放血致死。 (二)取材注意事项 (1)最好在动物心脏还在跳动时立即取材，并迅速投入环保组织固定液。脏器的上皮组织易变质，争取在死后半小时取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。 (2)切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。二、尸体解剖的取材尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。 (1)心和大血管右心室一块，左心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。 (2)肺右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。 (3)肝右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。 (3)脾一块。 (4)胰一块。 (6)肾两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。右肾一块切成正方形，左肾一块切成长 (7)膀胱一块。 (8)肾上腺左、右各取一块。 (9)消化道食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。 (10)骨脊椎骨一块。 (11)胸腺一块。 (12)子宫宫颈和宫体数块。 (13)睾丸或卵巢各一块。 (14)脑左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。 (15)脑下垂体一块，前叶或包括前后叶。如有较严重或复杂病变时应适当增加取材数量，以便彻底检查而作出正确诊断。三、活检标本的取材 (一)常规活检标本的取材应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。取材用的刀剪

胃肠间质瘤外科诊治的中国专家共识与NCCN指南解读(最全版)

胃肠间质瘤外科诊治的中国专家共识与NCCN指南解读（最全版）胃肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是起源于消化道的最常见的间叶组织来源肿瘤。近年已逐渐被外科学界熟悉，为了更好地普及推广这个较新的肿瘤概念，及时更新知识和规范诊疗，2010年中国临床肿瘤协作组(chinese society of clinical oncology，CSCO)成立专家委员会，首次编写GIST中国共识(2011版)[1]。共识每年进行更新，2012版已修订完毕。而美国国家癌症综合网络(national comprehensive cancer network，NCCN)发布的NCCN指南早已为大家熟知，可以说是目前全球应用最为广泛的癌症治疗指南。笔者就GIST的最新国内共识和新版NCCN指南的外科诊治部分作以解读。一、GIST的活检原则和适应证 GIST患者症状无特异性，只有病理学检查才是确诊GIST的唯一方法。但GIST质脆、血供丰富，部分呈囊实性，不适当的活检可能引起肿瘤出血、破溃，以致肿瘤播散种植的严重后果。因此，国内外共识或指南对于大多数可完整切除且原发性局限GIST，不推荐手术前进行常规活检。术前活检适用于拟进行伊马替尼治疗的患者，这类患者在治疗前必须取得明确病理诊断。对于首诊即合并转移的可疑GIST，必须进行活检明确诊断，再开始靶向药物治疗。而对于术中冰冻活检，专家共识为不推荐常规进行。只有当手术中怀疑GIST周围有淋巴结转移或手术中肉眼不能排除是其他恶性肿瘤时，才考虑术中冰冻活检。

至于活检方式，NCCN指南始终推荐首选超声内镜下细针抽吸法活检(EUS-FNA)。由于该方法穿刺针直径小，导致肿瘤出血的风险极低；此外，从胃肠腔内进针，有效避免了经皮穿刺引起针道种植和肿瘤破溃导致腹腔播散转移的危险。尽管取得的组织较少，但活检阳性率高，国外报告诊断准确性可达90%以上[2]。获得的组织足够进行HE和免疫组化染色，但可能难以满足基因检测的要求。此外，尽管NCCN指南未提及，但国内专家共识当GIST累及黏膜形成溃疡(通常呈脐样)时，内镜钳取活检常能获得肿瘤组织而明确诊断。直肠中下段GIST可经直肠壁进行粗针穿刺活检，阳性率极高，且收获组织足够进行基因检测。国内外专家共识均认为经皮穿刺有针道种植和肿瘤破溃导致腹腔播散的风险，仅适用于可疑转移的GIST。二、局限性GIST的治疗 (一)局限性GIST的外科治疗外科手术仍是原发、局限GIST的主要治疗方法。已经明确，肿瘤能否完整切除直接与预后相关。对可手术切除的GIST，国内外专家共识和指南有明确的指引，应手术切除病灶或先行新辅助治疗后再行手术。除2 cm 以下的胃GIST，其余原发局限GIST均应手术切除。经活检(推荐细针穿刺)证实小于2 cm的胃GIST，如有超声内镜的高危征象(肿瘤边缘不规则，内部回声不均匀，局部囊性或实性回声)应考虑手术切除。否则可间隔6～12个月复查超声内镜，暂不手术。不止一项回顾性研究证实，小GIST(1～2 cm，milliGIST)或微小GIST(<1 cm，microGIST)在尸检中常见，发现率可达20%～30%[3]。尽管微小GIST同样可以检测到KIT或PDGFRA

免疫组化染色操作步骤

免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。

图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》） SP 法与ABC 法相似，其不同于ABC 法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。SP 法简化了操作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术。二、实验准备： 1. 标本准备 ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片：由病理室常规处理 ③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h 。 2. 试剂准备 ①抗体选择单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体图2. SP 法原理示意图

胃肠道间质瘤的治疗进展(精)

?２５２? ?综述? 胃肠道间质瘤的治疗进展黄旭明刘锦涛摘要：胃肠道间质瘤是源于胃肠道的间叶源性肿瘤，绝大多数存在ｃ－ｋｉｔ或血小板源性生长因子受体基因突变。近十年来，间质瘤治疗取得了令人瞩目的进展。此文就外科手术、消化内镜、腹腔镜及其联合治疗、分子靶向治疗等进行综述。关键词：胃肠道问质瘤；治疗；腹腔镜；内镜胃肠道间质瘤（ＧＩＳＴ）是较常见的消化道间质达膜受体蛋白ＣＤｌ１７。虽然ＧＩＳＴ只占全部消化道治疗方面取得了重大进展。１．１手术切除与淋巴结清扫范围目前开腹手术是局限性ＧＩＳＴ的主要治疗手ｃｍ可行局部切除，直径３～５ｃｍ根据部位行楔形ｃｍ者均应行根治性胃ｃｍ。治疗效果与预后因素手术效果与能否完全切除肿瘤有很大关系。ｃｍ的患者术后３作者单位：５１８００１深圳市第五人民医院消化内科万方数据除了一般外科手术需要注意的事项外，ＧＩＳＴ内镜治疗ＧＩＳＴ多呈外生膨胀性生长，而非弥漫浸润性ｍｉｎ（３０～ｍｉｎ），只有２例因意外情况而改为开腹手术，中ｄ，患者均平稳恢复。ＧＩＳＴ常见于老Ｇｒｅｃａｃｍ巨大ＧＩＳＴ的７８肿瘤，其起源于胃肠肌层的神经节细胞，大多数表肿瘤的１％，但其３０％可发生恶变［１］。临床上对ＧｌＳＴ尤其恶变者主张积极治疗。近十年来，ＧＩＳＴ１外科传统开腹术不易切除或发生转移。１．３手术注意事项手术特别要注意的是：与一般胃肠道癌不同，ＧＩＳＴ仅有一薄层包膜，且存在一定张力，稍一触碰即破溃，尤其是小肠间质瘤常悬挂于肠壁及系膜上，如果有破溃，一般无法处理，往往只能任其破溃加重，导致腹腔播散。因此，原则上强调不主张瘤体触摸探查，即行非接触性手术切除，并避免过度翻动胃壁、肠管和系膜。如果肿瘤即将破溃，可用纱布垫覆盖肿瘤并缝于胃壁或系膜上，或用生物胶喷洒至肿瘤表面，防止医源性播散［６］。２

免疫组化操作步骤(自编)

免疫组化操作步骤一免疫组化（ LP 法）操作步骤： 1．切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行 2. 缓冲液洗 3min/2 次。 3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。 4. 缓冲液洗 5min/2 次。 5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。） 6. 缓冲液洗 5min/2 次。 7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定） 8. 缓冲液洗 5min/2 次。 9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。 10 ．缓冲液洗 5min/2 次。 11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。） 12 ．缓冲液洗 5min/2 次。 13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。） 14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液， 37 ℃孵育 1-2 小时或 4 ℃过夜。（ 5 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。