双酶切连接反应之全攻略
载体双酶切
载体双酶切技术是分子生物学领域常用的实验技术之一，它通过利用两种不同的限制性内切酶作用于同一个质粒DNA，从而实现对目标DNA片段的精确剪切和克隆。
本文将从载体双酶切技术的原理、应用和优缺点等方面进行详细介绍。
一、原理载体双酶切技术的原理主要基于两种不同的限制性内切酶对DNA的特异性切割。
首先，选择两种能够在同一质粒上切割出相互兼容的黏性末端的内切酶，并确定其最佳反应条件。
然后，将目标DNA片段与质粒进行双酶切反应，使得目标DNA片段的末端与质粒的末端具有互补的黏性末端。
最后，通过DNA连接酶的作用，将目标DNA片段与质粒连接成重组质粒，实现目标DNA片段的克隆插入。
二、应用载体双酶切技术在分子生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于重组质粒的构建，将外源基因插入到质粒中，用于基因克隆、表达和功能研究。
其次，还可以通过双酶切技术对质粒进行定向修饰，如引入点突变、插入序列或者删除特定片段等，用于研究基因的结构与功能。
此外，载体双酶切技术也被广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因组编辑等领域。
三、优缺点1. 优点（1）精准：通过双酶切技术可实现对DNA片段的精确切割和定向连接，保证了重组质粒的稳定性和可靠性。
（2）灵活：可以根据实验需要选择不同的限制性内切酶组合，实现对DNA的多样化操作。
（3）高效：相比传统的单酶切技术，载体双酶切技术能够提高DNA片段的连接效率和克隆成功率。
2. 缺点（1）操作复杂：双酶切技术需要充分考虑两种内切酶的选择、反应条件的优化及连接方法的调整，操作过程较为复杂。
（2）局限性：某些情况下可能无法找到适合的双酶切位点，导致目标DNA片段无法有效插入到质粒中。
（3）成本较高：需要购买多种限制性内切酶和连接酶，增加了实验成本。
综上所述，载体双酶切技术作为一种重要的分子生物学工具，在基因工程和分子生物学研究中发挥着重要作用。
随着技术的不断进步和完善，相信它将在更多领域展现出其巨大的潜力和价值。
双酶切鉴定
四、双酶切鉴定㈠双酶切反应(Double Digests)1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“seq”标注。
㈡连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
质粒双酶切构建经验！
质粒双酶切构建经验！大神教你做酶切！1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
限制性酶切方式及连接
2 限制酶切后的连接
2.1 DNA ligase:
能催化dsDNA片段紧靠在一起的3‘羟基末端与5’磷酸基团末端之间形成 磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA ligase
载体自连
目的基因 自连
2.2 DNA片段之间的连接 具互补黏性末端之间的连接 具平末端之间的连接
5‘CAAGCTCA3’ 3’GTTCGAGT5’ AluI
5’GTAGCTTA3’ 3’CATCGAAT5’ AluI
P-CTCA-3’ 5’CAAG-OH OH-GAGT5’ 3’GTTC-P
P-CTTA3’ 5’GTAG-OH OH-GAAT-5’ 3’CATC-P
AluI
T4 DNA ligase
5’CA AGCT TA-3’ 3’GT TCGA AT-5’
AGCT
HindⅢ AAGCTT
结论：
如果两个DNA片段的末端是用同一 种酶切割后产生的，连接后的DNA分子仍 保留那种酶的识别序列，有的会出现另一 种新的限制酶识别序列。
思考题： 1 限制酶切的方式 2 限制酶切后的连接
感谢下 载
具互补黏性末端片段之间的连接
5‘GGACTG-0H
P-AATTCTGCAA-3’
3’CCTGACTTAA-P
0H-GACGTT-5’
E.coR I 切割
E.coR I切割
DNA ligase 5‘GGACTGAATTCTGCAA-3’ 3’CCTGACTTAAGACGTT-5’
E.coR I 识别序列
线性DNA分子完全酶切的结果，产生DNA片段数是两种限制酶识别序列数加1.
双酶切构建载体的步骤
双酶切构建载体的步骤
嘿，朋友们！今天咱来聊聊双酶切构建载体的那些事儿。
你想想看，这就好比是给基因搭个特别的“小房子”。首先呢，得把
需要的片段准备好，就像盖房子得有合适的材料一样。然后就是选择
合适的酶啦，这可不能马虎，得像挑合适的工具一样仔细。
把载体和要插入的片段都拿出来，就像把盖房子的地基和各种材料
都摆好。接下来，酶就开始工作啦，它们就像精准的小剪刀，咔嚓咔
嚓，把该切的地方切得整整齐齐。这一步可得小心，不能切错了地方
呀，不然“房子”可就盖歪啦！
切完之后呢，把切好的片段和载体混合在一起，让它们相互认识认
识。这就好像把不同的积木拼在一起，看看能不能拼成想要的形状。
然后呢，就是让它们连接起来，形成一个完整的载体。这就跟搭积木
把各个部分紧紧连在一起差不多。
这中间还得注意一些细节哦！比如酶的活性呀，温度呀，可都不能
马虎。不然就像盖房子的时候材料质量不好或者施工环境不合适，那
房子能结实吗？
再想想，要是酶切得不好，那不就像房子的结构不牢固一样，随时
可能出问题呀！还有呀，连接的时候也要注意，要连接得稳稳当当的，
不能松松垮垮。
哎呀，这双酶切构建载体真的是个技术活呢！就像盖一座漂亮又结
实的小房子一样，需要我们精心地去操作，每一个步骤都不能马虎。
只有这样，我们才能构建出一个完美的载体，让基因在里面舒舒服服
地“住”着。
总之呢，双酶切构建载体可没那么简单，但只要我们认真对待，就
一定能做好！大家加油呀！
双酶切编辑
2连接反应
3注意事项
1简介编辑双酶切反应(Double Digests)
1、同步双酶切
同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
双酶切建议缓冲液
注：
只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“seq”标注。
3、转化：
a、一般转化仅需要加入2μl加入至100μl正常的TOP10感受态细胞中，冰浴放置30分钟。
b、再在水浴中42℃热激一般90～120秒钟后，再在冰中放置3分钟。
c、加入800μl无抗生素培养基，37℃全温振荡摇床培养40分钟。
取100μl涂布平板。一般转化质粒不建议离心涂布（除非感受态效价特别低），
双酶切编辑
做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。
载体双酶切
标题：载体双酶切技术的原理与应用引言：载体双酶切技术是一种常用于基因工程领域的重要技术手段，通过利用两个限制性内切酶在目标DNA分子上进行切割，实现特定DNA序列的插入、删除或替换。
本文将介绍载体双酶切技术的原理、步骤以及在基因工程中的应用，旨在为读者提供全面的了解和应用指导。
一、原理：1. 限制性内切酶的作用原理：限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并将其切割成碎片的酶。
它们通常具有两种切割模式，即粘性末端切割和平滑末端切割。
粘性末端切割会在目标DNA序列的两侧产生可互相配对的粘性末端，而平滑末端切割则会在目标DNA序列的两侧产生平滑末端。
2. 载体双酶切的原理：载体双酶切技术利用两个限制性内切酶在目标DNA分子上进行切割。
首先，选择两个限制性内切酶，使其能够识别并切割目标DNA序列的不同区域。
然后，在合适的条件下，将目标DNA与载体DNA同时暴露于这两个限制性内切酶的作用下，使它们发生特异性切割。
3. 插入、删除或替换目标DNA序列：通过载体双酶切技术，可以实现对目标DNA序列的插入、删除或替换。
具体操作方法是在目标DNA和载体DNA的切割末端引入互补的粘性末端序列，使它们能够通过互补配对连接起来。
根据需要，可以选择性地连接不同的DNA片段，实现基因组重组或DNA片段的插入。
二、步骤：1. 设计限制性内切酶切位点：根据需要，选择适当的限制性内切酶，并在目标DNA序列和载体DNA序列上设计出其切割位点。
确保切割位点的选择合理，以避免对目标DNA和载体DNA 的其余部分产生意外影响。
2. DNA提取与纯化：从相应的生物样本中提取目标DNA，并进行纯化处理，以去除杂质和其他干扰物质。
确保提取到的目标DNA具有良好的质量和纯度。
3. 切割反应：将目标DNA和载体DNA与适当的切割缓冲液和限制性内切酶一起反应。
根据切割酶的不同，可以选择在不同的温度和时间下进行切割反应。
确保反应条件的控制准确，以获得理想的切割效果。
双酶切的实验步骤
双酶切的实验步骤
1.准备DNA：将目标DNA放入离心管中，添加适量的酶切缓冲液和限制性内切酶，混匀后置于37℃恒温水浴中反应。
2. 制备琼脂糖凝胶：在琼脂糖溶液中加入适量的TBE缓冲液，混匀后加热至溶解，然后冷却至温度适宜进行凝胶浇注。
3. 浇注凝胶：将琼脂糖溶液倒入凝胶模具中，插入电极并使其冷却凝固。
4. 打孔：将凝胶模具放入电泳槽中，用尖端针头在凝胶表面打孔。
5. 样本处理：将酶切后的DNA样本加入凝胶孔中。
6. 电泳：在电泳槽中加入TBE缓冲液，将电极连接电源，设定电场强度和电泳时间，进行电泳分离。
7. 染色：将凝胶置于染色试剂中，使DNA成为可见的带状物。
8. 可视化：将凝胶置于紫外线照射仪下，观察DNA带状物的形态和大小。
9. 分析：根据DNA带状物的大小和数量，分析DNA序列和样本来源等信息。
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双酶切的实验步骤
双酶切的实验步骤
1.准备DNA样本和限制酶：选取目标DNA，加入适量的切割酶和缓冲液，混合均匀。
2. 反应体系配置：根据切割酶的要求，配置适当的反应体系，包括酶切缓冲液、酶、DNA样本、水等成分。
3. 体系酶切：将反应体系在适当的温度下反应，根据酶切时间、温度等条件控制反应的进程。
4. 酶切反应停止：反应完成后，在适当条件下停止反应，如加入适量的酶停反应液。
5. 转移样品：将反应体系转移到试剂管或离心管中，准备进行下一步实验操作。
6. 凝胶电泳：根据实验需要，选取适当的凝胶电泳条件，将样品进行电泳分离，将DNA条带可视化。
7. 数据分析：根据凝胶电泳结果，分析DNA条带的大小、数量等信息，得出实验结果并进行解释。
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双酶切实验
双酶切实验双酶切实验是一种常见的分子生物学技术，旨在通过不同特异性的限制性内切酶对DNA分子进行切割，从而得到指定的DNA序列片段，有助于进一步分析、鉴定和应用DNA分子。
本文将从实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果和分析等多方面介绍双酶切实验的具体过程和应用。
一、实验原理双酶切实验是一种分子生物学实验，其基本原理是通过限制性内切酶对DNA分子进行识别和切割，以获取所需的DNA序列片段。
限制性内切酶是一种酶，在特定的识别酶切位点中切割DNA分子，多数限制性内切酶都会切割对称型的序列，并产生黏性末端或平滑末端，这些末端能够用于DNA的连接、克隆或标记等。
双酶切实验是指利用两种或更多不同的限制性内切酶对同一个DNA分子进行切割，从而得到所需的DNA序列片段。
此时，需要将两种内切酶同时进行切割，以确保所需的DNA序列片段能够有效地被切割并分离出来，避免产生假阳性结果。
一般情况下，需要确保两种限制性内切酶不会相互重叠的切割同一段DNA序列，以避免影响实验结果的准确性。
二、实验材料1、DNA样本：需要纯度较高的DNA样本。
2、限制性内切酶：需要两种或多种不同的限制性内切酶。
3、相应的缓冲液和相关酶切盒。
4、电泳仪：实验完成后需要进行电泳检测。
5、夹心式电泳胶：用于制备凝胶板。
6、DNA分子量标准：用于校准电泳结果。
7、琼脂糖：用于制备凝胶板。
8、蒸馏水、乙醇、氯仿等：用于实验样本的获取和处理。
三、实验步骤1、制备DNA样本：需要先采集样本，并通过DNA提取试剂盒等方式获得纯度较高的DNA样本。
2、准备酶切反应体系：根据限制性内切酶的不同特性和酶切反应的需要，分别配置不同的酶切体系，并在冰箱中保存以备实验使用。
3、将DNA溶液与酶切反应体系混合：将DNA溶液与所需的酶切反应体系按比例混合，并进行酶切反应，一般需要保持恒定的温度和酶切时间来确保切割效果。
4、制备凝胶板：通过加热琼脂糖、混合等操作，制备夹心式电泳凝胶板，并在凝胶板中插入电极。
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双酶切连接反应之全攻略
一、实验原理：
1.首先，将待连接的两个DNA片段通过限制性内切酶酶切，产生两个
具有互补末端的DNA片段。
2.再利用DNA连接酶，以这些互补末端为引导，将两个DNA片段连接
在一起。
3.最后，通过热激励反应，将连接酶不活性化。
二、实验步骤：
1.设计引物：根据待连接的两个DNA片段的序列，设计合适的引物，
使得限制性内切酶切割后的末端具有互补性。
2.DNA酶切：将待连接的两个DNA片段与限制性内切酶一同反应，根
据内切酶的适宜反应条件进行酶切反应。
3.酶切产物纯化：将酶切产物进行电泳分离，通过切胶取带的方式将
目标片段分离出来，然后进行片段纯化。
4.连接反应：将纯化后的两个DNA片段与DNA连接酶一同反应，根据
连接酶的适宜条件进行连接反应。
一般而言，反应体系中还需要包含ATP
供能和缓冲液等。
5.连接产物纯化：对连接反应的产物进行纯化，一般选择柱层析法
（如凝胶过滤法、离心柱法等）或酸酶消化法（如酚氯仿法）等方法。
6.验证连接效果：通过DNA测序等方法验证连接效果，确保连接成功。
三、实验注意事项：
1.引物设计要合理：引物的设计要充分考虑到限制性内切酶的切割位
点和连接效率。
合理选择引物长度和碱基组成，避免引物之间产生非特异
性连接。
2.内切酶酶切条件的选择：根据所使用的内切酶的反应条件和切割位点，合理选择反应温度和反应时间，确保内切酶可以有效切割DNA片段。
3.DNA连接酶的选择和反应条件：根据实验需要，选择合适的DNA连
接酶，考虑到连接效率和连接酶的活性等因素。
同时需要注意反应缓冲液
的pH和温度等条件。
4.连接产物纯化：选择合适的纯化方法，确保连接产物的纯度和浓度。
同时注意纯化过程中的温度和pH等条件，避免产物降解或损失。
5.连接效果的验证：通过DNA测序方法验证连接效果，并且需要对连
接的序列进行分析，确保连接正确。
四、实验应用：
1.基因克隆：用于将外源基因克隆到载体上，以便于大规模扩增和表达。
2.DNA片段重组：用于DNA片段的重组、插入或删除等操作，如建立
基因敲除、基因定点突变等模型。
3.生物传感器：用于构建生物传感器，将靶分子与信号输出模块连接
起来，实现靶分子的检测。
4.基因组工程：用于将多个DNA片段连接在一起，构建人工基因组等。
5.蛋白工程：用于构建融合蛋白、修饰蛋白等。