实验一微生物拮抗作用
实验动物微生物控制及疾病预防-专题
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实验动物微生物控制分级—无菌动物
形态学特点
➢ 消化系统：盲肠膨大；肠道肌层薄，肠绒毛变细变短 ➢ 循环系统：心脏变小；白细胞数变少、数量波动范围小 ➢ 免疫系统：胸腺、淋巴组织、网状内皮系统发育不良；
实验动物常见感染性疾病-病毒性疾病
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎
传 染 源: 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。带病毒野小鼠或实 验小鼠为传染源。
传播途径: 带病毒小鼠的分泌物、排泄物污染，吸血昆虫传 播，胎盘垂直传播。
易 感 者: 人，小鼠、猴、豚鼠、大鼠、地鼠、兔、狗、鸡等。 症 状: 人感染后表现类似流感样症状， 临床表现：大脑型、内脏型、迟发型。
微生物学特点
要求不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性传染病的病原。
饲养管理
饲养于开放系统。但仍然对温度，湿度，饲料，垫料，饮水，卫 生等有一定控制。
生理学特点
外观健康，饮食排泄正常，无异常分泌物，无临床症状，脏器无 眼观病灶。
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实验动物微生物控制分级—普通动物
普通实验动物的应用
仅可作为生物医学中教学示教之用 作为某些科学研究为探索方法而从事的预试验之用 不可供科研、生产和检定之用。
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实验动物微生物控制分级—悉生动物
悉生动物的特点 微生物特点：体内携带有已知微生物
饲养管理：必须饲养在温湿度恒定的空气净化的隔离系统中，实行严
格的微生物控制。 与无菌动物比较，悉生动物肠道内存在细菌可以合成维生素，不会 像无菌动物一样发生维生素缺乏症。抵抗力、生活力较强，易于饲养理。
微生物实训心得体会
竭诚为您提供优质文档/双击可除微生物实训心得体会篇一：微生物实验心得微生物实验心得体会这学期的微生物实验已经结束，这是我第一次接触到微生物的世界中，以前也只是在书本中学习，但是真正走进它们的世界中是通过这个课程开始的。
在开始微生物实验之前我是以为这个实验不会很难，但是通过本学期的学习发现这个课程真的很难。
你不仅需要理论知识作为铺垫，你还需要有严谨的实验精神。
第一节课老师给我们介绍了我们本学期微生物实验的几个实验和报告的要求，也让我们了解了微生物实验和以往其他实验的不同。
实验步骤虽然很简单，但是往往一个微小的细节处理不当也会导致你整个实验结果的失败。
这个我真的深有体会，我们小组的实验结果都很不理想。
实验步骤说难也不难，其实无非是先对配置培养液，然后对清洗干净的试管、培养皿以及配置好的培养液进行灭菌，等灭菌完了就放入无菌室进行细菌的接种，最后将接种好细菌和培养液的培养皿放进恒温培养箱进行培养。
看似很简单的操作过程我却状况百出。
我总结了几点导致这么多次实验失败的地方。
第一是操作不够规范，在培养皿中倒入培养液后没有摇匀导致培养基边缘开裂，未等琼脂培养液凝固就倒置导致培养基分布不均匀。
第二是理论知识欠缺，没有等培养液冷却至40到50摄氏度就倒入培养基然后马上就接种了细菌，导致细菌已经被烫死。
好在值得欣慰的是最后一个自主实验还是比较成功的。
试验以环境对微生物生长的影响为题设计实验，我们小组通过ph值，温度，紫外线照射三个方面进行研究，结果很满意，很明显。
大肠杆菌在ph值为7时生长最适，在温度为37℃时生长最佳，紫外线会抑制其生长。
不得不承认，通过这次实验的学习，我们学到了很多，得到了很多，有些是书本上学不到的，只有自己参与了，操作了，才会知道。
也要感谢老师对我们的照顾。
篇二：微生物实验心得体会微生物实验心得姓名：关琦琦学号：09070401048班级：生物科学09-2班指导老师：吾尔恩微生物实验心得本学期已临近尾声，我们即将告别微生物实验这门课程，在这一学期，八个微生物实验中，我们学到了许多知识，这些知识将会陪伴我们一生，下面我们就来通过一些实验来回顾一下本学期的微生物实验。
医学微生物 第五版 陆德源
使用教材：《医学微生物学》陆德源主编，第5版（国家21世纪规划教材）学时分配：理论授课52学时；实验：28学时。
第1篇细菌学第1、2章细菌的形态结构与生理一、学习目的和要求：1.掌握细菌形态大小、结构和种类及其生物学意义。
2.熟悉细菌营养的类型、生长繁殖的条件、方式与速度和细菌生物氧化代谢的特点。
二、学习要点：（一）细菌的大小、形态与结构辨别和记忆：1.微生物的概念：必须用显微镜才能观察到，测量单位是微米（μm）.2.形态：3种：球菌（1μm）:如葡萄球菌、链球菌双球菌、四联球菌和叠球菌等；（2）杆菌（1-5×0.3-1μm）：如大肠杆菌、结核杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌等；（3）螺形菌：包括弧菌、螺菌和螺形菌，如霍乱弧菌、鼠咬热螺菌、空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等。
理解：1.革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁结构的差异及细胞壁的功能。
（容易出大题）2.细菌特殊结构的种类及生物学意义。
应用：细菌形态结构特征在细菌鉴定中的应用。
（二）细菌的营养与生长繁殖辨别和记忆：1.厌氧菌：必须在无氧环境中才能生长繁殖的细菌。
如破伤风梭菌。
2.细菌的繁殖方式：一般是简单的二分裂，个别以分枝，如结核菌。
3.细菌生长曲线：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期理解：1.细菌生长繁殖的条件：（1）充足的营养；（2）适宜的酸碱度；（3）合适的温度；（4）适意的气体。
2.厌氧菌厌氧原理：第4、5章噬菌体细菌的遗传变异一、学习目的和要求：1.熟悉细菌遗传变异的机制。
2.熟悉细菌遗传变异的实际意义，明确细菌耐药性的形成原因二、学习要点：（一）细菌遗传变异的机制：辨别和记忆：细菌遗传变异的类型1.基因突变、2.基因转移与重组：转化、转导、溶原性转换和接合。
3.表现型变异：毒力变异、抗原变异和耐药性变异。
4.基本概念:转化、转导、溶原性转换、接合、噬菌体、F+、F-菌、F质粒的概念：理解：1.F质粒转移特点：可经性菌毛结合转移，可形成高频重组转移2.噬菌体与宿主细菌的相互关系。
微生物相互作用的研究和方法
微生物相互作用的研究和方法微生物是指大小在微米尺度范围内的微小生命体，包括细菌、病毒、真菌和单细胞生物等。
微生物广泛存在于地球的各个角落，不仅占据着地表和海洋的绝大部分生物量，而且在生态系统和人类社会中都起着重要的作用。
随着科技的不断进步，我们对微生物的认识越来越深入，特别是微生物之间的相互作用，成为了生物学、生态学和医学等领域的热门研究方向。
一、微生物相互作用的研究意义微生物之间的相互作用，包括竞争、协同、共生、拮抗等，是微生物世界中存在的基本规律。
例如，在土壤微生物群落中，各种微生物之间通过分泌代谢产物、互相抑制或利用等方式相互作用，形成复杂的生态系统。
这些微生物之间的相互作用不仅可以影响土壤中营养元素的循环和物质转化，而且对植物生长、生态稳定性等方面也有着重要的作用。
另外，微生物之间的相互作用还可以应用于不同领域的研究中。
例如，利用微生物的协同作用可以生产出生物柴油、酒精等化学物质，这不仅可以缓解化石能源的短缺问题，而且以生物为原材料的产品具有更环保和可持续的特点。
同时，微生物之间的拮抗作用也可以用于抗菌剂的研究中，拮抗微生物的代谢产物或酶等可以用于抑制某些病菌的生长和繁殖。
二、微生物相互作用的研究方法为了深入研究微生物之间的相互作用，科学家们提出了许多研究方法。
1. 比较微生物的基因组: 通过基因组测序等方法研究微生物之间的差异，不仅可以了解它们之间的亲缘关系，而且可以揭示它们之间的相互作用模式。
2. 检测微生物代谢产物: 微生物生长代谢产物是微生物相互作用的重要标志，例如某些微生物可以分泌抑菌物质、提供生长因子等，这些代谢产物可以通过生物分析、气相色谱质谱等技术进行检测。
3. 采用分子技术: 例如PCR技术可以扩增微生物的DNA序列，可以将微生物DNA序列与数据库比对获得微生物亲缘关系、生境特征、谷类等。
4. 批量培养技术: 批量培养技术可以模拟微生物之间的生态环境，如在同一培养基上培养多种微生物，观察它们的生长速度、形态等，可以揭示微生物之间的相互影响关系。
化学药物对微生物生长的影响实验报告
化学药物对微生物生长的影响实验报告化学药剂对微生物生长的影响化学药剂对微生物生长的影响化学药剂对微生物的作用取决于药剂浓度、作用时间和微生物对药物的敏感性。
1．重金属及其化合物重金属离子尤其是Hg+、Ag+和CU2+具有很强的杀菌力。
重金属离子进入细胞后主要与酶或蛋白质上的-SH基结合而使之失活或变性。
微量的重金属离子还能在细胞内不断累积并最终对生物发生毒害作用，此即微动作用。
2．卤化物杀菌力高低顺序是：F＞CL＞Br＞I，最常用的是碘和氯。
碘碘不可逆地与菌体蛋白质（或酶）的酪氨酸结合，生成二碘酪氨酸，使菌体失活。
常用于皮肤消毒。
氯氯与水结合成次氯酸，后者易分解产生新生态氧，为强氧化剂。
Cl2+H2O→HCl+HClO HClO→HCl+[O]常用于饮水和游泳池水消毒。
3．有机化合物常用作杀菌剂的有机化合物是酚、醇、醛和有机酸等。
酚及其衍生物酚类化合物的作用主要是损伤微生物的细胞膜，钝化酶和使蛋白质变性。
酚系数①被广泛用作比较化学药剂杀菌效力的标准。
甲酚是酚的衍生物，杀菌力比酚强几倍。
乳化的甲酚溶液即煤酚皂液（俗称来苏尔）。
醇类通过溶解细胞壁和膜中的类脂，破坏膜结构及使蛋白质脱水变性，而起杀菌作用。
醇类的杀菌力，随分子量增大而增强，但丙醇以上的醇不易与水相混，所以一般不作消毒剂。
甲醇杀菌力较乙醇差，且对人尤其对眼有害，也不适于作消毒剂。
70％的乙醇，杀菌效果最好。
醛类能与蛋白质氨基酸中的多种基团共价结合而使其变性，是常用的杀细菌与杀真菌剂。
福尔马林溶液即37％～40％的甲醛水溶液。
10％的甲醛溶液熏蒸厂房、无菌室以及传染病患者的住房等，消毒效果较好。
酸类有机酸能抑制微生物（尤其是霉菌）的酶和代谢活性，常加在食品、饮料或化妆品中以防止霉菌等微生物的生长。
新型气态有机化学杀菌剂环氧乙烷是目前广泛应用的一种新型空气及器械表面消毒剂，通过用—CH2CH2OH基团取代氨基酸中的—SH、—COOH或—OH基团而使蛋白质变性。
各种微生物生化试验方法原理
各种微生物生化试验方法原理通常利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为细菌的生化反应，常用于细菌的鉴别。
1、糖类分解产物（1）糖发酵试验（carbohydrate fermentation test）不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，一般以能否分解某种糖，是否产酸产气等现象来鉴别。
例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸且产气；而伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产气，且不分解乳糖。
这是因为大肠杆菌分解葡萄糖等产生甲酸，经甲酸解氢酶的作用生成H2和CO2。
而伤寒杆菌无此酶，故分解葡萄糖只产酸不产气。
（2）VP试验（V oges-Proskauer test）产气杆菌将分解葡萄糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，生成二乙酰，二乙酰可与培养液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反应，生成红色的化合物，此为VP试验阳性。
大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性。
（3）甲基红试验（methyl red test）大肠杆菌和产气杆菌均属G-短杆菌，且都能分解葡萄糖、乳糖产酸产气，二者不易区别。
但两者所产生的酸类和总酸量不一：大肠杆菌可产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而产气杆菌只产生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。
故大肠杆菌培养液PH在4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为甲基红试验阳性；产气杆菌培养液PH在5.4以上，加入甲基红后呈桔黄色，为甲基红试验阴性。
（4）枸橼酸盐利用试验(citrate utilization test）产气杆菌在以枸橼酸盐为唯一碳源的培养基上生长，分解枸橼酸盐产生CO2，并转变为碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，含溴麝香草酚蓝（BTB）指示剂的培养基由淡绿色变为深兰色，此为枸橼酸盐利用试验阳性。
大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色。
2、蛋白质及氨基酸的分解产物（1）硫化氢试验（hydrogen sulfide test）有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产生H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢试验阳性。
实验动物的微生物学及寄生虫学控制
第四节 清洁动物（Clean animal，简称CL动物）
定义：除普通动物应排除的病原外，不携带对动物危害大和 对科学研究干扰大的病原。
饲养条件：屏障系统大规模生产 来源：SPF动物扩群 应用：各种科研、教学用大小鼠
清洁级动物特点：
1、微生物特点 清洁级动物比普通级动物要求排除的微生
物和寄生虫多，但比SPF动物少。清洁级动 物除肉眼观察无病外，尸体解剖时，主要 脏器、组织无论是肉眼观看还是病理组织 切片均应无病变。
(1)盲肠肥大，比普通动物要大5-6倍。 (2)肠道肌层薄，肠绒毛变细变短。 (3)肝脏重量下降。
无菌动物特点
• 循环系统
(1)心脏变小 (2)白细胞数变少，且数量波动范围小
• 免疫系统 免疫机能基本处于原始状态。
(1)胸腺，淋巴组织，网状内皮系统发育不良
(2)脾脏小，无二级滤泡，网状内皮细胞功能下降
• 3、免疫学研究中的应用
无菌动物体内既无抗原也无特异性抗体，处于 一种“原始状态”，很适合用于各种免疫功能 的研究。 如，无菌动物暴露于微生物，先产生α球蛋白，
再产生β球蛋白，最后产生γ球蛋白。
常用无菌动物进行免疫抑制剂试验研究。
4、肿瘤学研究 （1）制备人体肿瘤模型需要免疫抑制
动物，而普通动物给予免疫抑制剂后常 继发感染死亡，所以可以应用无菌动物。
SPF动物 屏障系统 确知不带有的微生物
清洁动物 屏障系统 确知不带有的微生物
普通动物 开放系统 微生物情况不明确
二、对科染病 无
无
无 未知
寄生虫 无
无
无 未知
试验结果 明确 明确 明确 有疑问
用动物数 少 少
较少 多或大量
统计价值 很好 可能好 较好 不准确
微生物实训心得体会
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在开始微生物实验之前我是以为这个实验不会很难，但是通过本学期的学习发现这个课程真的很难。
你不仅需要理论知识作为铺垫，你还需要有严谨的实验精神。
第一节课老师给我们介绍了我们本学期微生物实验的几个实验和报告的要求，也让我们了解了微生物实验和以往其他实验的不同。
实验步骤虽然很简单，但是往往一个微小的细节处理不当也会导致你整个实验结果的失败。
这个我真的深有体会，我们小组的实验结果都很不理想。
实验步骤说难也不难，其实无非是先对配置培养液，然后对清洗干净的试管、培养皿以及配置好的培养液进行灭菌，等灭菌完了就放入无菌室进行细菌的接种，最后将接种好细菌和培养液的培养皿放进恒温培养箱进行培养。
看似很简单的操作过程我却状况百出。
我总结了几点导致这么多次实验失败的地方。
第一是操作不够规范，在培养皿中倒入培养液后没有摇匀导致培养基边缘开裂，未等琼脂培养液凝固就倒置导致培养基分布不均匀。
第二是理论知识欠缺，没有等培养液冷却至40到50摄氏度就倒入培养基然后马上就接种了细菌，导致细菌已经被烫死。
好在值得欣慰的是最后一个自主实验还是比较成功的。
试验以环境对微生物生长的影响为题设计实验，我们小组通过ph值，温度，紫外线照射三个方面进行研究，结果很满意，很明显。
大肠杆菌在ph值为7时生长最适，在温度为37℃时生长最佳，紫外线会抑制其生长。
不得不承认，通过这次实验的学习，我们学到了很多，得到了很多，有些是书本上学不到的，只有自己参与了，操作了，才会知道。
也要感谢老师对我们的照顾。
篇二：微生物实验心得体会微生物实验心得姓名：关琦琦学号：09070401048班级：生物科学09-2班指导老师：吾尔恩微生物实验心得本学期已临近尾声，我们即将告别微生物实验这门课程，在这一学期，八个微生物实验中，我们学到了许多知识，这些知识将会陪伴我们一生，下面我们就来通过一些实验来回顾一下本学期的微生物实验。
棉花黄萎病拮抗菌的筛选及定殖效果初步研究
棉花黄萎病拮抗菌的筛选及定殖效果初步研究摘要:对120株棉花内生菌对棉花黄萎病菌(Verticillium dahilae)的抑制作用进行了研究,筛选出能够对病原菌产生抑制或拮抗作用的菌株｡发现15.8%的菌株对病原真菌有一定拮抗作用,具有强拮抗作用的菌株有3株,选取拮抗作用最强的S11菌株进行棉苗入侵定殖效果研究,结果显示,采用菌液浇灌的方式,能从棉苗的根､上胚轴､下胚轴和子叶中分离发现菌株,在4种接种方式中菌株定殖效果最好｡关键词:拮抗菌;棉花黄萎病;筛选;定殖Screening for Antagonistic Strains Against Verticillium dahilae and Preliminary Study on the Colonization EffectAbstract: Antagonistic bacterium were screened out of 120 entophyte strains from cotton. It was showed that 15.8% of these strains had antagonistic activity, among which three strains had good antagonistic activity. Antagonistic bacteria S11 with the best antagonistic activity was studied in cotton invasion and colonization. The results indicated that the method of bacteria liquid irrigation showed the best colonization effect in cotton. The isolates could be separated from roots, epicotyl, hypocotyl and cotyledon of cotton. Among the 4 inoculation mehtod, fix planting has bdst efficiency. Key words: antagonist; Verticillium dahilae; screening; colonization自1898年V ogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来,植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注,从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点｡近年来,该领域的研究已取得一定进展,发现了一些有医用､农用价值的菌株和化合物[1]｡棉花黄萎病属于土传病害,防治极为困难｡目前防治棉花黄萎病的物理､化学方法的效果都不理想,采用生物防治棉花黄萎病逐步取得较好的效果,且对环境无污染｡利用生防菌的拮抗作用可以有效地抑制致病菌的生长,内生拮抗菌定殖于植物体内,作为生防菌有极大的优势[2]｡从棉花组织中分离筛选到一株具有强拮抗作用的菌株S11,用不同的方法将其接种到棉苗上,研究不同入侵途径的定殖效果,以期为棉花黄萎病的生物防治提供有效参考｡1材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株供试内生菌菌株:采用表面消毒后稀释磨平板的方法从湖北荆州棉株样品中分离出120株内生菌株(表1)｡病原真菌:棉花黄萎病菌(Verticillium dahilae)菌株由南京农业大学实验室提供｡1.1.2仪器与药品仪器:千分尺,移液枪,打孔器,药匙,高压蒸汽灭菌锅,电热恒温鼓风干燥箱,水浴锅,隔水式恒温培养箱,生化培养箱,恒温摇床,离心机,育苗盘等;培养基:PDA培养基､PD液体培养基､NA培养基;灭菌无土育苗混配基质(专利号200710053583.4);棉花种子:鄂杂棉10号棉子｡1.2方法1.2.1平皿对峙法采用平皿对峙培养法进行内生菌和病原真菌间的皿内拮抗试验[3]｡在PDA平板上以原点为中心划垂直的十字,分别将病原真菌和内生菌沿一条直线等距离接种于平板两侧,以中央只接种病原真菌的平板为对照(CK)｡放于培养箱中28 ℃培养,2~7 d后观察菌落生长情况｡并测定抑菌带宽度｡将抑菌带宽度大于10 mm作为强抑菌作用菌株(+++),抑菌带宽度为5~10 mm作为中强抑菌作用菌株(++),抑菌带宽度小于5 mm作为弱抑菌作用菌株(+)｡1.2.2生长速率法将初选拮抗菌株接种于NA培养液中,25 ℃条件下置转速140 r/min的摇床上培养3~6 d,将培养液10 000 r/min离心30 min,取上清发酵液｡将发酵液以体积比1∶10加入PDA培养基中制成平板(直径90 mm),以加等量无菌水的平板为对照,用打孔器在平板中央接种病原菌菌饼,菌饼直径5 mm,25 ℃下培养4 d,测量各处理菌落直径,计算各菌株发酵液对病原菌的抑制率[4]｡内生菌对病原菌的生长抑制率=(对照菌落半径Rc-处理菌落半径Rp)/对照菌落半径Rc×100%1.2.3菌株的接种方法将筛选出的拮抗作用最强的菌株,移至NA培养液中,30 ℃下振荡培养2 d,用无菌水配成108 CFU/mL的菌体悬浮液,备用[5]｡①浸种接种:将棉花种子浸入30 ℃的菌体悬浮液中6 h,播种在灭菌的棉花无土育苗基质中;②浇灌接种:用菌体悬浮液按30 mL/株的量淋到苗根部和育苗基质中;③喷雾接种:棉种出苗后,用喷雾器将菌体悬浮液按2 mL/株的量均匀喷洒到棉苗叶面上;④针刺接种:分别用大头针将棉苗植株的茎和叶部刺伤,蘸上筛选出的菌体悬浮液｡按以上接种方法接种后均放置在温光培养箱内30 ℃环境中生长｡每处理3次重复,各试验均以灭菌水作为相应对照｡1.2.4接种菌的回收分别剪取以不同接种方法接种的棉苗植株4个部位各5 g,灭菌水冲洗干净,剪成5 mm × 5 mm的组织块,在体积分数为75%的酒精中浸泡1 min,然后用质量分数为0.1%的升汞消毒3 min,灭菌水冲洗3次,取消毒后最后一次冲洗液1 mL置于灭菌培养皿中,倒入45 ℃的NA培养基,充分摇匀｡28 ℃下培养3 d,观察有无菌落产生,验证消毒是否将供试材料表面的微生物全部杀死｡将供试材料于灭菌的研钵中研磨,用无菌水稀释成10-2､10-3和10-4的浓度,分别移取1 mL,倒入45 ℃含有200 μg/mL链霉素的NA培养基,充分摇匀后在28 ℃下培养3 d,经生理生化测定和棉花黄萎病的拮抗测定以确定其是否接种的目标菌株｡2结果与分析2.1棉花内生菌对病原菌的抑制效果通过对120株内生菌与病原菌的对峙培养,其中有19株内生菌表现出一定的抑制作用,占到供试菌株的15.8%｡其中抑菌带宽度最小的为 1.5mm,抑制作用最小;产生抑制作用的菌株中大多为中等抑菌强度;抑菌带宽度较大的菌株有S3､S11和R20,分别达到了11.5､10.5和10.0 mm,抑菌作用较强(表2)｡其他菌株因没有明显的抑菌带,故未列入表2中｡2.2内生菌对病原菌的抑制率对初选出的19个内生菌发酵液的抑菌活性测定结果表明,所有发酵液处理的病原菌菌落直径均小于空白对照,说明其对棉花黄萎病菌都有明显的抑制作用｡各菌株抑制率在21.1%~91.0%｡试验菌株L9发酵液抑菌率为21.1%,抑菌活性较差;菌株S3和R20抑菌活性较强,抑菌率分别达到89.6%和88.2%;菌株S11､R27抑菌活性都达到了90%以上,对病菌的抑制作用明显强于其他菌株,其中S11的抑菌活性最佳(表3)｡2.3菌株的定殖效果结果表明,S11菌株均可通过这4种接种方法入侵定殖于棉苗｡经浸种､浇灌和针刺处理的棉苗植株,其根部､上下胚轴均发现有S11菌株存在,其中,根部菌量较多,上胚轴和下胚轴菌量较少,叶片(包括子叶)没有发现S11菌株;喷雾处理的棉苗除了叶上存在少量菌株外,其他部位没有发现菌株的存在｡浇灌处理根部菌量较大,浸种处理的根部菌量中等,说明根部是容易被内生拮抗菌入侵定殖的部位｡试验结果表明,S11菌株可以通过浸种的方式定殖,也可以通过棉苗的根､上下胚轴､叶表皮进入植株内(表4)｡3结论与讨论3.1结论经过皿内拮抗试验,从棉株样品中所分离的120株菌株中有19株对棉花黄萎病菌有拮抗能力｡即有15.8%的菌株对病原真菌有一定拮抗作用,有强拮抗作用的菌株有3株,其中菌株S11对棉花黄萎病菌的抑制率达到91.0%｡对菌株S11进行入侵棉株定殖效果试验,发现用浸种､浇灌､喷雾､针刺等方法把菌株接种到棉苗,均能从棉苗的根､上胚轴､下胚轴和叶中发现菌株,其中浇灌的效果最佳,其次是浸种以及针刺效果｡用喷雾处理只在叶中有少量菌株,效果较差｡3.2讨论本研究只是初步在数量上测定了对棉花黄萎病有抑制作用的内生菌株,所分离出的内生菌生理生化特征未进行测定,且内生真菌对病原菌产生拮抗作用的化学物质也需进一步分离分析｡试验用浸种､浇灌处理的棉花植株,不但从根部分离到目标菌株,从棉苗植株的上下胚轴和叶部也分离到该菌;而用针刺接种的植株可以从根部分离到S11菌株,说明该菌能在棉苗植株的不同部位相互转移,但是转移的方式及原因有待进一步探讨;一般认为,内生菌只有在植株发生创伤时,才能入侵定殖[6],但本试验所用无土基质经过灭菌处理,排除了基质中病虫害造成的外伤所致内生菌入侵,棉花苗期取样时并未发现创伤,而检测结果却显示内生菌已入侵定殖,具体原因需进一步研究｡参考文献:[1]TJAMOS E C G, PAPA VIZAS RJC.Biological control of plant disease:Progressand challenges for the future[M]. New York:Plenum,1992.[2]石晶盈,陈维信,刘爱媛.植物内生菌及其防治植物病害的研究进展[J].生态学报,2006,26(7):2395-2401.[3]LEMANCEAU P,LANTOUR X.Effects of the plant on the soil-borne microflofta:Application tothe fluorescent pseudomonas[A]. The 7thInternational Congress of Plant Pathology(ICPP)2-47.[4]黎起秦,叶云峰,蒙显英,等.内生细菌B47菌株的鉴定及其对番茄青枯病的防效测定[J].中国生物防治,2005,21(3):178-182.[5]叶云峰,黎起秦,何洪鸿,等.芽孢杆菌B47菌株对番茄青枯病的防治作用[J].广西植保, 2005,18(3):1-4.[6] PETRINI O. Fungal endophytes of tree leaves [A]. ANDREWS J H, HIRANO S S. Microbial ecology of leaves[M]. New York: Springr-Verlag,1991.179-197.。
四种芽孢杆菌生防功能初探
铁载体的功能，筛选培养基由三部分组成：MSA培养基、CAS （chromeazurol S）染液和0.1 mol/L的磷酸缓冲溶液。这三部分在 配制过程中必须分开并单独灭菌后，在1.0 L的MSA培养基中先后 加入50 mL CAS染液和50 mL的磷酸缓冲溶液（0.1 mol/L）混匀制 成MSA-CAS检测培养基[9]。
4）CAS（chromeazurol S）染液配方（100 mL）：三氯化铁 0.003 g，十六烷基三甲基溴化铵0.15 g，铬天青0.0653 g，用无菌 水定容至100 mL。
5）0.1 mol/L的磷酸缓冲溶液（1.0 L）：磷酸二氢钠0.5 g，磷 酸氢二钠2.0 g，氯化铵0.25 g，磷酸二氢钾0.075 g，氯化钠0.2 g， 无菌水100 mL。 1.3 室内平板对峙试验
植物病原菌：保存于本实验室的香蕉枯萎病的致病菌尖孢镰 刀菌（Fusarium oxysporum）古巴生理4号小种和水稻纹枯病的致病 菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）。
供试菌株：西姆芽孢杆菌（Bacillus siamensis）H1401、地 衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）H2202、解淀粉芽孢杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens）H4112、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis strain）H4309均为芽孢杆菌属，由华南农业大学分子遗 传实验室保存提供。 1.2 试剂及培养基
将试验菌株用平板划线接种至LB培养基进行活化，放置于 35℃培养箱培养24 h，制备成OD600值为0.6的菌悬液。将两种植物 病原菌分别活化至PDA培养基，28℃恒温培养箱培养5天后，用直 径为7 mm 的无菌打孔器打取病原菌饼接种至PDA培养基的一侧， 用无菌接种环取菌悬液在已接种植物病原菌PDA培养基的另一侧 划线，每个供试验菌株设三次重复，以不接种供试菌的PDA培养 基为对照，放置于28℃培养箱中培养5天后观察结果并测量抑制距 离和试验菌株的生长宽度，计算具有抗病功能菌株的抑制力，计 算公式为：
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实验一微生物拮抗作用 《生物技术大实验》讲义 实验一 枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病的拮抗作用 实验目的： 进一步掌握无菌操作技术，加深对微生物之间互作的进一步认识 实验原理： 枯草芽孢杆菌分泌到体外的带谢产物能够抑制棉花黄萎病的生长 供试菌株 (1) 拮抗菌株: 枯草芽孢杆菌（冰箱保存） (2) 病原菌株: 棉花黄萎病菌（冰箱保存） 实验步骤 1. 培养基的制作 (1) PD培养液：(2) PDA培养基：查氏培养液：按上述配方配制查氏液体50 ml及固体胶培养基125 ml分别装在250的三角瓶中，121℃ 条件下灭菌30分钟。 2. 接种培养 (1) 在无菌操作条件下，将棉花黄萎病菌接种在查氏培养液中，28℃振荡培养4天。 (2) 将枯草芽孢杆菌在PD培养液中28℃培养24小时 3. 抑菌试验 (1) 平板制备：将固体PDA培养基溶化后倒入培养皿中，制成平板 (2) 棉花黄萎病菌液涂皿：将棉花黄萎病菌液用玻棒均匀的涂布在查氏平板培养基上 (3) 枯草芽孢菌的接种：将圆滤纸片放置在平板培养基上，用吸管吸取少许枯草芽孢杆菌菌悬液滴到滤纸片上 (4) 培养：28 ℃培养箱中培养4天 (5) 观察结果
实验二 酶联免疫法测ABA含量 仪器： 酶联免疫仪 酶标板 752分光光度计 实验原理 本方法是一种固相抗原型酶联免疫法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA),先将ABA蛋白质复合物与固相载体(聚苯乙烯微量滴定板)结合,然后将待测的ABA(样品或标准品)和兔抗ABA抗体加入微量滴定板的孔中,进行竞争反应,接着弃去上清液,洗涤固相表面,加入酶标二抗使其与结合在固相ABA上的抗体反应,最后去除多余的未反应的酶标二抗,测定与固相结合的酶活性,酶活性和待测ABA含量呈负函数关系,即固相ABA结合的抗体与酶标二抗量(OD或B%)随待测ABA含量增加而减少,以一系列已知浓度的ABA的OD值制图而获得标准竞争性抑制曲线, 对于未知样品B,只要在同样条件下测定反应后的OD值,就可以从标准曲线上查到ABA的量。 测定方法 1、 包被：在微量滴定板内准确加入100μLABA包被液，37℃湿盒过夜。 2、 标样稀释?：取8支试管每管加150μLDB，第一管中加入50μL（2000ng／50μL）标准液，充分涡旋后，取50μL至第二号管中，同样涡旋后，取50μL到第三管；依次稀释到第六管，稀释后的标准ABA依次为1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng／50μL。 3、 洗板：从37℃湿盒中取出滴定板，恢复到室温后，弃去包被液，用WB（洗涤缓冲液）洗涤三次，甩干（吸水纸）。 4、 加样：1～8孔对应加入ABA标样50μL，10号孔相应加入最浓ABA标样，9号孔加50μLDB，三排重复；然后每孔加50μL抗体，37℃ 45分钟。 5、 洗板： 6、 加酶标二抗：每孔加100μL，37℃反应1小时。 7、 洗板： 8、 显色：各孔加10μLOPD显色液，37℃ 20分钟。 9、 终止反应：各孔加50μL 6NH2SO4。 10、 读数：490nm读取OD值。其中10号孔调零,而 9号孔为最大值(B0),1~8号孔的OD值为B。 11、 结果计算：以In（B/B0）∕（1－B/B0）为纵坐标，以标准ABA浓度的常用对数（lg［ABA］）为横坐标,绘制曲线。
实验三 质粒DNA的提取及其酶切 实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA 。 实验原理 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 实验步骤 （一） 提取质粒 1. 将2 ml 含相应抗生素的LB液体培养基加入试管 中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌单菌落，37℃振荡培养过夜。 2. 取培养物倒入微量1.5ml离心管中，4000 r/min 离心 2 min。 3. 弃上清，吸尽残液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4. 加入100ul溶液Ⅰ，充分混匀，室温放置10 min。
5. 加200 ul溶液 Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，轻轻颠倒数次混匀，将离心管放冰上 5 min 。 6. 加入150 ul 溶液 Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 15 min 。 7. 12000 r/min ,离心15 min ，将上清转至另一离心管中。 8. 加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000 r/min，离心5 min，将上清转移到另一离心管中。 9. 加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10 min。12000r/min离心 5 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 10. 用1 ml 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。 11. 加50 ul TE缓冲液，其中含有20 ug/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，－20℃保存。 （二）酶切 取DNA溶液，加酶切缓冲液，EcoRI酶1 ul，无菌水补至总体积10 ul，37℃保温3h,加终止液，准备下个实验电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。
实验四 琼脂糖凝胶电泳技术 ［实验目的］通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 ［实验原理］DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系.。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称 CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，（open circular DNA, 简称OCDNA）,线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，开环质粒DNA。 [实验步骤] (一) 制备琼脂糖凝胶 电泳槽及用胶量 将琼脂糖按比例溶入1X TAE缓冲液中，微波炉加热至完全溶化， 冷却至60℃, 加入适量EB, 混匀。 （二）胶板的制备 1. 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻
璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。 2. 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。梳子调整齐 3. 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面
（注意不要形成气泡）。 4. 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，将胶槽放在电泳槽内。 5. 加入电泳缓冲液至电泳槽中。 （三）加样, 用移液器将已加入上样缓冲液的DNA样品加入样品孔（记录点样顺序及点样量）。 （四）电泳 1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V/cm。 2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。 （五）染色 将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色以观察在琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作）。
实验五 真核生物高分子量DNA制备 实验原理 利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。 实验材料: 新鲜植物叶片 [实验步骤] 1. 取4g新鲜叶片，在液氮中研磨成粉末状（越细越好）。 2. 转移至50ml离心管中，加入16ml TENbf，充分混匀。65℃水浴保温20min。 3. 从水浴中取出离心管，加入5ml 5 mol/L KCl溶液，混匀，水浴20min。 4. 4000r/min 离心 20 min。 5. 将上清液转移到另一50ml离心管中。 6. 加等体积酚／氯仿混匀，12000r／min 离心5min，取上清。 7. 加等体积氯仿，混匀，12000r／min 离心5min，取上清。
8. 加入0.6－1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。放置时间 9. 离心获得沉淀，70％乙醇洗3次。风干沉淀。 10. 加入500μLTE缓冲液，溶解DNA。 11. 取3μL上清液,琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、质量。
实验六 PCR基因扩增 实验目的：掌握PCR反应的基本原理与实验技术 实验原理：PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，