常用样品分析方法--可溶性糖、淀粉、酚类和叶绿素含量的测定

常用样品分析方法——可溶性糖、淀粉、酚类和叶绿素含量测定

一、可溶性糖和淀粉含量的测定方法

可溶性糖和淀粉含量的测定方法为硫酸---蒽酮比色法。

测定原理为：淀粉是由葡萄糖残基组成的一类多糖物质，在酸性条件下加热可使其水解成单糖葡萄糖，然后在浓硫酸的作用下，单糖葡萄糖可以脱水生成糠醛或羟甲基糠醛类化合物，然后利用蒽酮试剂与糠醛化合物反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，即可比色进行定量测定。

测定步骤如下:

1. 标准曲线的制作

1.1 100ug/ml葡萄糖标准液的配制

将分析纯葡萄糖在80℃下烘干，用0.0001g分析天平精确称取1g葡萄糖，转入50ml烧杯中，然后加入少量蒸馏水搅拌溶解，接着将溶解液转入100ml容量瓶，然后再往烧杯中加入少量蒸馏水润洗，最后将润洗液转入上述100ml容量瓶，重复上述润洗操作三次(注意溶解液和三次润洗液的体积总和控制在80ml 以内，以免超过容量瓶量程)，然后定容至容量瓶刻度线，塞上塞子，上下颠倒5次以，得到10mg/ml的葡萄糖溶液｡用移液枪吸取1ml葡萄糖标准液转入100ml 容量瓶，定容至刻度线，所得溶液即为100ug/ml的葡萄糖标准溶液。

1.2蒽酮乙酸乙酯试剂的配制

用0.0001g分析天平精确称取分析纯蒽酮1g溶于50ml乙酸乙酯试剂中，贮藏于棕色瓶中，置于黑暗中保存｡

1.3标准曲线制作

编号0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

12

100ug/ml葡萄糖溶液(ml) 0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

蒸馏水ml 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8

稀释液葡萄糖浓度（ug/ml）0

10 20 30 40 50 60

注:1 2为一个重复，以此类推｡

取13支20ml试管并分别编号为0-12，按照上表加好相应体积的葡萄糖溶液与蒸馏水并混匀后，再依次向每支试管中分别加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，加入浓硫酸时要缓慢以免反应过快液体飞溅，然后小心震荡，将试管放入沸水浴(100℃)1min，取出后自然冷却至室温，以编号为0的试管为空白对照，于620nm波长处测定吸光值，然后以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值（OD 值）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，并拟合出方程（R2=0.99）。本研究所有指标测量所用分光光度计均为岛津UV2600（SHIMADZU UV2600）。

2. 样品可溶性糖及淀粉含量测定

a．可溶性糖的提取：用0.0001g分析天平准确称取20mg干燥待测样品粉末于10ml离心管中，加入80%乙醇5ml，然后于80℃水浴锅中提取30min 后取出，冷却至室温后放入离心机中（2000r，10min），然后吸取上清液至另一干净的10ml离心管中，并加蒸馏水容至10ml，此溶液即为可溶性糖提取液。

b．淀粉的提取：向a中10ml离心管的残渣中加入1ml蒸馏水，摇匀后置于沸水中15min进行糊化，取出冷却至室温，再加入3ml 9.2mol/L高氯酸(约取78ml高氯酸，加蒸馏水定容至100ml)，搅拌均匀，提取15min后吸出提取液加蒸馏水定容至10ml，此溶液即为淀粉提取液。

c．显色反应：分别吸取上述a, b步骤中样品提取液0.5ml于20ml具塞玻璃试管中，再加入蒸馏水1.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂0.5ml、浓硫酸5ml，塞上塞子后充分摇匀，将试管放入沸水浴1min。空白对照用2ml 蒸馏水和

0.5ml 蒽酮试剂反应液，再缓缓加入5ml浓硫酸，然后一起置于沸水浴1

min。取出自然冷却到室温，然后于620nm波长下测定吸光值｡

3. 样品可溶性糖及淀粉含量的计算

可溶性糖含量(%)=

（步骤2a所测吸光值可用于计算样品中可溶性糖含量）

淀粉含量（ug）=还原糖(ug)×0.9

(步骤2b所测吸光值可用于计算由淀粉还原而来的可溶性糖含量) 样品中淀粉含量百分比（%）=

二、总酚含量的测定

福林酚法测定植物叶片中总酚含量。

此方法的化学原理是：多酚与FoLin-CiocaLteu试剂发生特异性反应，反应产物对特定波长的有最大吸收，且吸光值与多酚的量在一定浓度范围内成线性关系。先以标准酚类物质建立标准曲线，再测定待测样品吸光值，据此可求出待测样品中多酚的含量。测定步骤如下：

1、标准曲线的制作

1.1 1mg/ml单宁酸标准液的配制

用0.0001g分析天平准确称取0.1g单宁酸（Sigma公司，美国）放入烧杯中并加入约30ml纯水，充分搅拌使单宁酸溶解，然后把溶液转移到100ml容量瓶，再将烧杯用纯水润洗三次（润洗液体积总和注意不要高于50ml以免超出容量瓶量程），并把全部润洗液转入上述容量瓶中，定容，塞上塞子并上下颠倒五次摇匀，所得溶液即1mg/ml的单宁酸标准液，备用。

1.2 7.5%碳酸钠溶液的配制

用0.0001g分析天平准确称取7.5g碳酸钠粉末放入烧杯中，并加入30ml左右的蒸馏水，然后用玻璃棒充分搅拌使其溶解，将溶解液转入100ml容量瓶内，然后再用蒸馏水将烧杯润洗三次（注意控制三次润洗液体积总和在50ml以内，以免超出容量瓶量程），并将全部润洗液转入上述100ml容量瓶，充分震荡后定容，塞上塞子并上下颠倒五次使其均匀，备用。

1.3标准曲线制作

编号 1 2 3 4 5 6 7

单宁酸标准液（ml）0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

蒸馏水（ml） 2 1.99 1.98 1.97 1.96 1.95 1.94

0 5 10 15 20 25 30

稀释液单宁酸浓度

（ug/ml）

取7支具塞玻璃试管分别编号1-7，按照上表依次加入对应体积的单宁酸标准液和蒸馏水，摇匀后立即往每支试管中加入0.5ml福林酚试剂和1.5ml 7.5%碳酸钠溶液。塞上塞子摇匀后放置于80℃水浴锅中水浴十分钟，以编号为0的试管为空白对照，在750nm波长下测定吸光值，并以单宁酸浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制单宁酸标准曲线，并拟合出方程（R2=0.99）。

2 样品总酚含量的测定

2.1 植物叶片中总酚的提取

将植物叶片放置于40℃烘箱中三天至恒重，然后置于-20℃冰箱中冷冻保存。测定总酚前再于40℃下烘干半天，然后在研钵中研磨成粉末。用0.0001g分析天平准确称取8-10 mg样品粉末放于2ml Eppendorf管中，加入1.5 ml 80%的丙酮，然后将Eppendorf管平放在纸盒内，黑暗提取6小时后，3500r/min离心10分钟，将上清液转入另一个2ml Eppendorf管，保存于4℃冰箱。残余物再次加入1ml 80%丙酮，黑暗提取6小时，3500r/min离心10min后合并两次的上清液，即为提取液（该提取液包含总酚类及其他一些在750nm波长下能够显色的物质）。

2.2 PVPP空白的制作

取上述提取液1 ml于已经加入35mg PVPP（polyvinylpolypyrrolidone）(Sigma