碱法提取质粒DNA
1 碱法提取质粒DNA
一、目的
掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用
掌握碱法提取质粒DNA的原理和方法。
二、原理
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。首先用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，再加入溶液II（NaOH、SDS）后，碱性环境下菌体的细胞壁裂解，而使质粒缓慢释放出来，并且碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主染色体DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在上清液中。然后用酚、氯仿多次抽提进一步纯化质粒 DNA 。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以去除残留的氯仿。最后用75％乙醇溶液洗涤沉淀，以去除残留的盐离子。最后获得的质粒DNA储存在TE溶液中，-20℃保存。用于下一步凝胶电泳鉴定。
三、仪器设备、材料与试剂
仪器设备
恒温培养箱 恒温摇床 台式离心机 高压灭菌锅 制冰机 电子天平pH计
量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL） 烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL） 一次性手套 无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码）
玻璃棒 称量勺 微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）酒精灯 灭菌的1.5 mL离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL），相应的吸头盒 吸水纸 2 250mL三角瓶
材料：
含pKS质粒或pUC系列质粒的大肠杆菌。
四、试剂配制：
2M 葡萄糖：36g葡萄糖，溶于60ml 蒸馏水中，在加蒸馏水至100ml，然后用0.22μm滤器除菌过滤，-20℃保存。
10％SDS(十二烷基硫酸纳)：1gSDS，溶于60mL蒸馏水中（加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2）再加蒸馏水至100ml，无需灭菌。因SDS微粉易扩散，称量需戴面具。称后要及时清洁称量区。
2M NaOH：NaOH 8g，溶于10ml 蒸馏水中，再加蒸馏水至100ml。
1M Tris·HCl (pH 8.0)：蒸馏水600ml，Tris 121.2g；HCl 35ml；用HCl将pH调至8.0，再加蒸馏水至1000ml。
2M Tris –HCl (pH7.4)：蒸馏水300ml；Tris 121.2g；HCl 35ml；用HCl将pH调至7.4，再加蒸馏水至500ml。
0.1M EDTA (pH8.0)：18.7g EDTA-Na2-2H2O,溶于300ml蒸馏水中，用10N
NaOH将pH调至8.0，加蒸馏水至500ml，室温保存。
去离子灭菌水
70%乙醇：用新开装的无水乙醇35mL，加去离子灭菌水定容至50mL配成，储存于4℃冰箱，用后即放回。
氨苄青霉素（Amp）：100mg/mL
卡那霉素（Kan）：50 mg/mL
培养基：LB液体培养基(pH 7.0)200ml分装在6个100mL体积的三角瓶内，灭菌。
母液 加入体积 终浓度
蛋白胨 2g 10g/L
酵母提取物 1g 5 g/L
NaCl 2g 10 g/L
2M NaOH 0.1ml 1ml/L
蒸馏水 至200ml
TE缓冲液，pH7.4，配制10ml： 3 母液 加入体积 终浓度
2M Tris·HCl (pH7.4) 0.05ml 10mM
0.1M EDTA (pH8.0) 0.10ml 1mM
加蒸馏水 至10ml
溶液I 配制50ml，灭菌，０～４℃保存：
母液 加入体积 终浓度
2M葡萄糖 1.25ml 50mmol/L
1M Tris·HCl (pH 8.0) 1.25ml 25mmol/L (pH 8.0)
0.1M EDTA (pH8.0) 5.0ml 10mmol/L (pH 8.0)
灭菌水 42.5ml
溶液Ⅱ (现配现用) 配制100ml：
母液 加入体积 终浓度
2M NaOH 10ml 0.2mol/L
10％ SDS 10ml 1％
灭菌水 80ml
溶液Ⅲ 配制100ml，灭菌，储存于4℃冰箱，用后即放回。
29.4g 乙酸钾，加50ml蒸馏水，用冰乙酸将pH 调至4.8，再加蒸馏水至100ml。
Tris饱和酚（pH7.0）：苯酚需要重蒸后加Tris·HCl (pH7.4)制成饱和酚。
Tris饱和酚（pH7.0）: 氯仿 : 异戊醇=25 : 24 : 1(Ｖ／Ｖ／Ｖ)
五、实验步骤及注意事项
步骤 注意事项
1. 在含50-100μg/mL Amp, 50mL LB液体培养基中,接入已长到1-3mm的转化子菌落，37℃，220r/min，振荡培养16-18h。
2. 吸取1.5mL培养液，12 000r/min离心30s，弃上清液，收集菌体。 收集菌体时要尽量除尽水分。
3. 加入150μL溶液Ⅰ，在快速混匀器上使菌体均匀悬浮，冰上放置3min左右。 菌体在溶液I和溶液Ⅱ中悬浮要尽量均匀。整个过程动作轻柔，防止提取的DNA链断开。
如果想去掉RNA，可以在溶液I中加入100μg/mL的RNase, 一般来说RNA对操作过程影响不大，且 4 易在放置过程中分解。
4. 加入200μL溶液II，轻柔颠倒混匀，放置冰上不能超过5min。 悬浮要尽量均匀。整个过程动作轻柔，防止提取的DNA链断开。
5. 加入150μL溶液III，颠倒混匀，冰上放置10min左右，使细胞壁和蛋白质等杂质沉淀。
6. 12 000r/min离心10min, 0~4℃。
7. 吸上清液移到另一管中，得到上清液400μl，则加入400μl 25:24: 1体积混合的饱和酚、氯仿、异戊醇溶液振荡混匀，12000r/min 离心2min，取上清液。 为了得到高纯度的质粒DNA，可以在乙醇沉淀之前，再用苯酚氯仿抽提一次。
8. 仔细吸取上清液350μL左右，加两倍体积的预冷无水乙醇混合均匀，冰上放置10min。 注意不要吸入沉淀和液面上漂浮的杂质。
9. 12000r/min 离心15min。 得质粒沉淀。
10. 弃上清液，用70％乙醇洗涤两次，步骤同8。 加两倍体积的无水乙醇离心如果得不到质粒沉淀，可以放入-20℃ 1h
以后再离心。
11. 真空抽干或自然风干，加20μl TE缓冲液或无菌超纯水溶解质粒DNA。
12. 再放入-20℃备用。
六、实验结果：
肉眼观察：是否有白色絮状沉淀？量多还是少？
下一步实验：琼脂糖凝胶电泳进一步检测、鉴定。
七、结果分析及讨论
大肠杆菌质粒DNA的提取
大肠杆菌质粒DNA的提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取
质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法:
碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下:
1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37?振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1,葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1, SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管
8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0?静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70,乙醇0(5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0(05mlTE缓冲液中
煮沸法
1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4?下12000,离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量离心机4?下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
质粒提取的原理及步骤
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性 而呈絮状，离心时可沉淀下来。
一、试剂准备
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl[t1] (pH
8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0
葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去
2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置[t2] 。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱 性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复 性的描述所导致。
大肠杆菌质粒DNA的提取 2
一、大肠杆菌质粒DNA的提取
质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：
碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：
1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管
8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中
煮沸法
1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
质粒提取注意事项及DNA纯化浓缩
质粒DNA需要注意的问题(采用碱法提取)
○1离心收集菌体时的上清液一定要去除干净，不得混入到裂解液中。离心完毕倒出上清液后，离心管口应一直向下，倒扣在吸水纸上，放置一段时间，让管壁上的液体都流干。因上清液中含有一些细胞培养过程中产生的代谢物及细胞壁脱落成分，这些物质严重影响限制酶的切割作用
○2掌握好变形的时间及温度。加入溶液II后，要迅速但又十分温和地混匀，以颠倒离心管5次为宜，千万不能剧烈震荡。混匀后立即放入冰浴中，低温条件
下可以减少质粒的变性程度。
○3用平衡酚抽提时不能剧烈震荡，以颠倒离心管3-5次为好。实验表明，用Tris-HCl饱和的酚抽提细菌质粒DNA时，剧烈震荡20次和轻轻地上下颠倒离心管3次，被提取的内含物成分区别很大，前者包括染色体DNA，蛋白质和RNA，这些杂质全部被抽提，颠倒离心管3次，抽提物中只有质粒DNA及一些小分子的杂质
DNA/质粒纯化浓缩
1.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）和氯仿/异戊醇（24:1）分别抽提
2.加入1/10体积3M NaAc/乙酸铵 ph5.2和2倍体积冰冻无水乙醇，-20℃沉淀2h
3. 4℃，12000rpm 离心10min，70％乙醇（＜200ul）洗涤沉淀，吹干
4. 加入20-50ul DDH2O回溶沉淀（亦可用TE回溶，适合长期保存，但不知是否影响下一步Southern酶切效果）
注：第一步视情况而定，可以省略不做
质粒DNA的提取实验
实验六 质粒DNA的提取
一、实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒
二、实验原理
质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS（十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
三、实验材料与试剂
1、实验材料 大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T）
2、实验试剂
(1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；
(2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；
(3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；
(4) 氯仿－异戊醇（24：1）；
(5) 异丙醇、70%乙醇；
四、实验步骤
（一）提取质粒
1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。（由老师完成）
2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。
3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm离心1min。
4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。 6. 加200μl新配制的溶液Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物,注意动作一定要轻柔缓和，切勿振荡!将离心管放置于冰上(2min)。
质粒提取原理
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制， 并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀 等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
试剂准备
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）
1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
(完整版)碱裂解法提取质粒-配方,最好的说明
(完整版)碱裂解法提取质粒-配方,最好的说明
1 碱裂解法提取质粒
一、基本概念
1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸（DNA）分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒（plasmid)。质粒上常有抗生素的抗性基因,例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome）,这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子.
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0。5％～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次，每个细胞内只有1~2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101.pBR322含有抗四环素基因（Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr),并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的(完整版)碱裂解法提取质粒-配方,最好的说明
碱裂解法抽提质粒的原理
精选范本,供参考！ 碱裂解法抽提质粒的原理
SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。
1．试剂
（1）溶液Ⅰ：Tris-HCL（pH8.0）25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L,溶菌酶（临用时加）5mg/ml
（2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH 0.2mol/L,SDS 1﹪(W/V)
（3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml
（4）酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）
（5）无水乙醇和70﹪乙醇
（6）无DNA酶的胰RNA酶
（7）TE
2．实验流程
（1）挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈震摇下培养过夜。
（2）将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5分钟（两次），将剩余的培养物贮存于4℃。
（3）吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（4）将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
注：溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。溶菌酶对反应液的pH有很大的依赖关系，当其低于8.0时，细胞裂解的效果就大为逊色。因此，溶液Ⅰ不仅使用了Tris-HCL缓冲体系，同时好加入了适量的葡萄糖而有利于pH的调节。乙二胺四乙酸（EDTA）因其是二价金属离子（如Mg2＋等）的螯合剂，故少量地存在便可抑制核酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。
（5）加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。注意不要振荡。将离心管放置于冰上5分钟。
碱裂解法提取质粒-配方,操作说明
1 碱裂解法提取质粒
一、基本概念
1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄 2 青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10kb(kb表示为千碱基对)。
质粒提取原理和方法
质粒DNA提取的原理及方法
碱裂解法质粒DNA提取原理
质粒DNA提取主要包括以下几个方面:如何将细胞裂解释放质粒DNA，如何将质粒DNA和基因组DNA分离开来，如何去除RNA污染，如何去除蛋白质和其它杂质。
质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法,它具有得率高,适用面广，快速，纯度高等特点.其原理是：
强碱性条件下,质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性.在pH中性,并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性,仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构,在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。
BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA，而蛋白质不被吸附，最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来,方法简单，快速，质量好,收获量高。
影响质粒提取的因素
影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数,宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。
质粒拷贝数
质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。BIOMIGA 公司质粒DNA提取系列试剂盒,操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。
下表给出一些常用质粒载体的拷贝数：
质粒种类
复制起点
拷贝数
1 mL菌液质粒DNA收获量（µg）
pSC101
pSC101
5
0。1-0。2
pACYC
P15A
10-12
0。4—0.6
pSuperCos
pMB1
10—20
0。4-1
pBR322
pMB1
15-20
0.6—1
pGEMR
Muted pMB1
300-400
6—7
pBluescriptR
ColE1