真菌检测方法
真菌检测的质量控制的流程
真菌检测的质量控制的流程质量控制是任何实验室工作中至关重要的一环，对于真菌检测也不例外。
本文将详细介绍真菌检测的质量控制流程，包括样品准备、实验操作、数据分析和结果报告等方面。
一、样品准备1. 样品收集：根据检测要求，从不同来源收集真菌样品，例如土壤、空气、水体等。
确保样品采集的随机性和代表性。
2. 样品保存：将样品储存于适当的容器中，并按照规定的温度和湿度条件保存。
确保样品在运输和储存过程中不受污染和变质。
二、实验操作1. 实验室环境控制：确保实验室环境符合标准要求，包括温度、湿度、洁净度等方面。
避免外部污染对实验结果的影响。
2. 杂交试剂和仪器校准：使用经过验证的试剂和校准过的仪器进行实验操作，以确保结果的准确性和可重复性。
3. 样品处理：按照标准操作程序处理样品，包括样品的预处理、提取、纯化等步骤。
确保样品处理的一致性和高效性。
4. PCR扩增：采用特定引物进行PCR扩增，确保扩增反应的特异性和灵敏度。
同时设置阴性对照和阳性对照，验证扩增反应的可靠性。
5. 凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据目标基因的大小和特异性，判断样品中是否存在目标真菌。
同时使用分子量标准品确定PCR产物的大小。
6. 数据记录：准确记录实验操作的各项参数和结果数据，包括样品编号、扩增结果、电泳图像等。
确保数据的可追溯性和准确性。
三、数据分析1. 电泳图像分析：根据电泳图像，判断样品中是否存在目标真菌，并记录其相对强度和带型特征。
2. 数据统计和分析：对不同样品的检测结果进行统计和分析，包括目标真菌的检出率、数量分布、群落结构等。
使用适当的统计方法评估结果的可靠性和显著性。
四、结果报告1. 结果解读：根据数据分析的结果，解读样品中真菌的检测情况，包括目标真菌的存在与否、数量水平等。
2. 报告编写：将结果整理成报告形式，包括样品信息、实验方法、结果数据和解读等内容。
确保报告的准确性和清晰性。
3. 质量控制记录：记录实验操作中的质量控制措施和结果，包括样品处理、PCR扩增、电泳分析等各个环节的质量控制数据。
真菌检测方法
分离培养：无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中，置37℃恒温箱中培养24小时，长成绒毛样菌丝，未见其它细菌生长。
经48小时培养长成白色菌落。
72小时菌落呈纽扣状，由中心向外周逐渐变深，转变成灰白色、灰绿色。
取培养物镜检可见大量球形的分生孢子。
通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。
真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。
真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。
根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。
真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。
真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。
根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部真菌，包括皮肤癣菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌等。
而霉菌多为细胞真菌的一种，也为深部感染真菌，包括烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等，常发生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影响预后。
培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。
目前国标方法中使用的培养基有:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长,而CAO则适合于高渗性霉菌生长,酵母菌几乎不长。
在日常检测中我们发现,有些常见的耐高渗性霉菌,如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长,而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方:蔗糖400g,麦芽提取汁20g,酵母提取汁5g,琼脂20g,氯霉素50mg,蒸馏水1000ml;DG18琼脂配方:葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5g,氯霉素0.1g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH6.5)上则正常生长,孢子、形态特征发育良好,而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长,因此,若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌,将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。
第七章 真菌的分子生物学鉴定方法
RAPD是一种比较精细的分子标记技术，单个碱基的改 变有可能对扩增片断的多态性产生明显的影响。
国内有人利用RAPD对白色念珠菌、淋球菌、水稻白叶 枯病菌进行分型取得了很好的结果。 黄勃等人利用 RAPD 技术对拟青霉属菌株进行分类鉴定时，发现
RAPD 指纹图谱在拟青霉属不同种间具有明显的种的
特异性，可以区别所有形态近似的种类，但对比RAPD
（二）真菌线粒体DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析 限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP），将目标DNA序列经一定数目和种类的限 制性内切酶(RE)进行酶切,由于不同生物体的基因组DNA在限制性 内切酶的酶切位点的遗传信息有差异, 限制性内切酶在其上的识别
例——捕食线虫真菌的分类发展
粘球和 非收缩环
节丛孢
收缩环
单顶孢
菌网
隔指孢
粘性分枝
分子生物学鉴定方法包括DNA碱基组成 (G+C)mol%、限制性片段长度多态性（RFLP）、 随机扩增多态性 (RAPD) 、Southerm印迹分析 脉冲电场凝胶电泳（PFGE）以及小亚基rDNA(或 rRNA)序列测定等。 过去依赖形态和生理生化等表型特征描述逐 渐引入分子生物学鉴定方法，按其亲缘关系和 客观的反映系统发育的规律对真菌进行自然分 类，达到人们追求已久的自然分类目的，无疑 是分类学发展过鉴定等的很好的分子 标记，已经被成功地用于动物、植物、人和微生物的遗 传多样性检测、基因定位、品系鉴定、医学诊断、遗传 图谱构建和系统学研究等。 在分析生物间系统发育关系、分析突变以及亲缘关系鉴 定等方面显示出卓越的功能,一些表型上不能反映的遗传 物质的细微变化都可以通过RAPD技术显示出来。
丝状真菌生长的测定
菌体干重法：液体培养真菌的生长期完成后，过滤菌丝、洗涤、离心、烘
干、称量干重。这种测定法比较直接而可靠，但仅适用于菌体浓度较高的样品， 而且要求样品中不含有菌体以外的其它干物质。 菌体湿重法：也可以采用测定菌丝湿重法，把烘干步骤省去。但无论测定 干重或湿重，大都用于工业发酵过程的检测。 真菌的生长还可用间接的方法测定，如全氮量和核糖核酸的分析，一般干 的菌丝体含氮量是4.5-8.5%，核糖核酸是2.0-4.0%。另外，还可以分析培养基 中糖的消耗量、氧的吸收量等作为测定生长量的指标。这些方法大都是工业生 产中所采用的方法。
（三）直线生长速率的测定 这一方法使用并不广泛。它是在“Ｕ”形培养管中进行的。培养管长40厘
米，内径约1.3厘米，在两端5厘米处弯成45°角，如图所示。
在培养管中加入适量的溶化的琼脂培养基，达到培养管直径的一半，两端加 棉塞后灭菌。凝固后从一端接种，然后按时测定生长距离，并计算生验内容：菌丝顶端延长生长的测定 1．配制 PDA培养基，高压灭菌备用 2．制备PDA培养基平板，在平板中心点接黑根霉，于28℃培养15h左右。 3．用显微镜的镜台测微尺来校对目镜测微尺。镜台测微尺100格共长1mm，每
格为10μm，标定目镜测微尺上每小格表示多少μm。
4．将黑根霉平板放置于显微镜台上，在菌落边缘选择单根菌丝边缘，在低倍镜 下聚焦。 5．将目镜测微尺与菌丝平行，并选择菌丝开始出现侧枝的位置与目镜测微尺上
细胞质的泡囊起源于高尔基体，高尔基体、核、内质网一起存在于亚顶端部位。
1970年，Grove等人提出了菌丝顶端生长的泡囊假说：
二、菌丝顶端生长的机制 泡囊作用的三重性： 1. 运输细胞壁溶解酶去破坏原来壁 组成之间的键;
2. 运输新的壁物质，并在壁合成酶
真菌镜检 实验报告
真菌镜检实验报告实验目的1. 了解真菌镜检的原理和方法；2. 掌握真菌镜检的操作步骤；3. 熟练使用显微镜观察和识别真菌。
实验原理真菌镜检是通过显微镜观察和识别真菌的一种常见方法。
真菌是一类包括酵母菌、发酵菌和霉菌等多种生物的总称。
真菌广泛存在于自然界中的土壤、水源、植物和动物体内等环境中，对生态环境和人类健康都具有重要的影响。
在镜检过程中，我们需要将待观察的样品制备成薄片，然后利用显微镜放大观察。
真菌镜检主要通过观察真菌的形态特征、生长方式和产孢方式来进行鉴别和分类。
实验材料和设备- 真菌样品（包括酵母菌、发酵菌和霉菌等）- 显微镜- 盖玻片、载玻片和显微镜镜片- 物镜（包括10倍、40倍和100倍）- 碘溶液、甲苯、无水乙醇、硝酸和无菌水等试剂- 夹子和移液器等实验器材实验步骤1. 样品制备1. 取一小部分真菌样品，加入一滴无菌水，用移液器均匀混合。
2. 取一片盖玻片，用无菌吸棉球擦拭表面消毒。
3. 用无菌夹子将混合液滴在盖玻片上，待干燥后加盖载玻片。
2. 显微镜观察1. 打开显微镜，调节光源亮度，放置载玻片。
2. 先用10倍物镜观察整体样貌，再逐步增大倍数进行细节观察。
3. 观察真菌的形态特征，例如菌丝的细长与否、分支情况，孢子的形状和颜色等。
4. 如果需要更详细的观察，可将载玻片移到显微镜的移动平台上，进行特定区域的观察。
3. 真菌鉴定1. 根据观察到的形态特征，将真菌样品进行初步分类。
2. 如果需要进一步鉴定，可进行染色实验。
- 涂抹法：将盖玻片中的样品涂抹到另一片盖玻片上，然后加一滴碘溶液，在显微镜下观察颜色变化。
- 梅林蓝染色法：将盖玻片中的样品加一滴梅林蓝染液，用无菌夹子拌匀，待干燥后显微镜观察。
实验结果与分析通过显微镜观察，我们成功识别出了样品中的真菌，并初步鉴定了其类别。
在进一步的染色实验中，我们发现不同真菌对染料的反应不同，有的样品在加入碘溶液后呈现深蓝色，有的呈现紫色，还有的几乎没有变化。
真菌检测的质量控制的流程
真菌检测的质量控制的流程一、引言真菌检测的质量控制是确保检测结果准确可靠的关键步骤。
本文将介绍真菌检测的质量控制流程，包括样品采集、实验室操作、数据分析和报告编写等环节。
二、样品采集1. 样品选择：根据检测目的和要求，选择代表性的样品。
例如，如果是室内环境真菌检测，可以选择空气、尘埃或建筑材料等样品。
2. 采样方法：根据不同样品的特点，采用合适的采样方法。
例如，对于空气样品，可以使用活性气溶胶采样器进行采样；对于表面样品，可以使用刷子或粘贴式采样器进行采样。
3. 采样数量：根据标准要求，确定采样数量，确保样品的代表性和统计学可靠性。
4. 采样记录：在采样过程中，详细记录采样地点、时间、采样人员等信息，以便后续分析和质量控制。
三、实验室操作1. 样品接收和登记：在样品送达实验室后，及时进行接收和登记，确保样品信息的准确性和完整性。
2. 样品处理：根据检测要求，对样品进行预处理，如去除杂质、粉碎等。
3. 样品提取：采用适当的方法提取样品中的真菌，如液体培养、过滤、离心等。
4. PCR扩增：使用聚合酶链反应（PCR）技术对提取的样品进行扩增，以增加检测灵敏度和特异性。
5. 凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，检测真菌的存在和数量。
6. 阳性对照：同时进行阳性对照实验，以确保实验操作的准确性和可靠性。
7. 实验记录：详细记录实验操作过程、结果和观察，以便后续数据分析和质量控制。
四、数据分析1. 数据整理：对实验结果进行整理和统计，包括真菌种类、数量等信息。
2. 质控样品：在数据分析过程中，加入质控样品进行验证，确保实验结果的准确性和可靠性。
3. 数据验证：对数据进行验证，检查实验结果是否与质控样品和实验室标准符合。
4. 数据解读：根据数据分析结果，对样品中真菌的种类、数量等进行解读，并与相关标准进行比较。
五、报告编写1. 报告结构：按照标准的报告结构，包括摘要、引言、方法、结果、讨论和结论等部分。
2. 报告内容：在报告中详细描述样品采集、实验室操作和数据分析的过程和结果，以及相关的质量控制措施。
真菌检测的质量控制的流程
真菌检测的质量控制的流程一、引言真菌是广泛存在于自然界的微生物，对人类和动植物的健康产生重要影响。
由于真菌的多样性和复杂性，对其检测的质量控制显得尤为重要。
本文将详细阐述真菌检测的质量控制的整个流程，以确保结果的准确性和可靠性。
二、采集样本选择合适的采样方法：根据真菌种类和检测目的选择刮取、擦拭或采集等方法。
确定采样部位：针对不同的感染部位，如皮肤、呼吸道等进行采样。
确保采样设备无菌：确保采样工具在使用前已经彻底灭菌，避免交叉污染。
及时送检：采集后的样本应尽快送至实验室进行检测，以保持其活性。
记录完整信息：对采样时间、部位、患者信息等进行详细记录。
三、样本处理样本保存：选择适当的保存方式，如低温、干燥等，以保持真菌活性。
清洁与除杂：去除样本中的杂质，确保不影响检测结果。
样本粉碎与匀质化：将样本破碎至适宜大小，以便于后续的分离和提取。
DNA提取：采用合适的DNA提取方法，确保提取到高质量的DNA。
PCR 扩增：对提取的DNA进行扩增，提高检测的灵敏度。
四、培养与观察选择适宜的培养基：根据真菌种类选择适合的培养基。
培养条件控制：确保培养温度、湿度等条件符合真菌生长需求。
定期观察：对培养中的真菌进行定期观察，记录生长情况。
纯化培养：对疑似阳性样本进行纯化培养，确保真菌的纯度。
菌落特征观察：观察菌落的形状、颜色等特征，初步判断真菌种类。
五、镜检与初步鉴定显微镜观察：通过显微镜观察真菌的形态、结构等特征。
形态学鉴定：根据观察到的特征，初步确定真菌种类。
生理生化试验：进行一些生化试验，如糖发酵试验等，辅助鉴定。
药敏试验：了解真菌对各种药物的敏感程度，为后续治疗提供参考。
分子生物学鉴定：对不能通过形态学鉴定的真菌，采用分子生物学方法进行鉴定。
六、分子生物学检测DNA提取与PCR扩增：采用适当的DNA提取方法，并进行PCR扩增以提高检测的灵敏度。
测序分析：对PCR产物进行测序，得到基因序列信息。
数据库比对：将测序结果与已知的基因数据库进行比对，确定真菌的种类。
真菌检测的临床意义(呼吸科)
汇报人：XX
目录
CONTENTS
真菌感染症状：皮肤、指甲、呼吸道等部位可能出现症状
真菌检测方法：显微镜检查、培养法、分子生物学方法等
真菌检测意义：早期发现真菌感染，及时治疗，防止病情恶化 真菌检测在临床中的应用：诊断真菌感染，指导治疗，评估疗效， 预防复发
真菌检测可以帮助医生评估患者疾病的严重程度，以便制定合适的治疗方案。 真菌检测还可以帮助医生判断患者是否需要接受抗真菌治疗，以及治疗效果如何。 真菌检测还可以帮助医生判断患者是否患有其他疾病，如免疫系统疾病等。 真菌检测还可以帮助医生判断患者是否患有真菌感染，以便采取相应的预防措施。
研究新型检测方 法，提高检测灵 敏度和准确性
开发快速检术，提 高检测效率
研究无创检测方 法，减少患者痛 苦和感染风险
提高医生对真菌感染的认识，加强诊断能力 推广真菌检测技术在临床中的应用 加强医生对真菌感染治疗方案的了解和掌握 提高医生对真菌感染预防措施的认识和执行能力
原理：通过检测血清中的抗 体来诊断真菌感染
局限性：不能确定感染的时 间和地点，需要与其他检测
方法结合使用
应用：主要用于诊断隐球菌 病、曲霉病等真菌感染
真菌感染的症状和体征 真菌检测在呼吸科中的应用
真菌检测的方法和原理
真菌检测的结果解读和临床 意义
检测方法：痰液培养、血清学检测、分子生物学检测等 评估指标：真菌负荷、炎症反应、肺功能等 临床意义：早期发现、早期治疗，降低死亡率和并发症发生率 治疗方案：抗真菌药物、免疫调节剂、支持治疗等
缺点：耗时较 长，操作复杂， 对实验环境要
求较高
组织切片：取病 变组织进行切片， 观察其形态和结 构
染色：使用特殊 染色剂对组织切 片进行染色，以 便更清楚地观察 真菌形态
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分离培养：无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中，置 37℃恒温箱中培养 24 小时，长成绒毛样菌丝，未见其它细菌生长。
经 48 小时培养长成白色菌落。
72 小时菌落呈纽扣状，由中心向外周逐渐变深，转变成灰白色、灰绿色。
取培养物镜检可见大量球形的分生孢子。
通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。
真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。
真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。
根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。
真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。
真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。
根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部真菌，包括皮肤癣菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌等。
而霉菌多为细胞真菌的一种，也为深部感染真菌，包括烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等，常发生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影响预后。
培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。
目前国标方法中使用的培养基有 :马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA), 孟加拉培养基 (RBC) 、高盐察氏培养基 (CAO), 其中 PDA 和 RBC 适合于一般的霉菌和酵母菌生长 ,而 CAO 则适合于高渗性霉菌生长 ,酵母菌几乎不长。
在日常检测中我们发现 ,有些常见的耐高渗性霉菌,如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia 等在 PDA、RBC 上生长非常缓慢或不长, 而这些菌在高渗培养基如M40Y 、 DG18(M40Y 琼脂配方 : 蔗糖400g, 麦芽提取汁20g, 酵母提取汁5g, 琼脂 20g, 氯霉素 50mg, 蒸馏水 1000ml;DG18琼脂配方:葡萄糖 10g, 蛋白胨 5g,KH2PO41g,MgSO4· 7H2O 0.5g, 氯霉素 0.1g,0.2% 二氯硝基苯胺1.0mL, 琼脂 15g, 蒸馏水 1000mL,PH6.5) 上则正常生长,孢子、形态特征发育良好,而且酵母菌也能在 M40Y 、 DG18 上生长 ,因此 , 若能同时采用 PDA 和 M40Y( 或 DG18) 分离培养各类样品中的霉菌 ,将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。
特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等, 更有必要同时采用 M40Y 或 DG18 。
由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素,危害较小, 而有的菌株即使污染数量不多, 但其产生的霉菌毒素却危害较大,因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度,重要的是要知道污染菌的菌相,才能更好地判断被污染食品的安全程度。
为此,国外有些研究者设计出各类选择性培养基 ,可以识别产毒的霉菌。
如 AFPA 培养基 ( 配方 :酵母提取汁 20g, 蛋白胨10g, 柠檬酸铁铵0.5g,0.2% 二氯硝基苯胺 1.0mL, 琼脂 15g, 蒸馏水 1000mL,PH5.6) 用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。
产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA 上30 ℃培养 2~3 天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落,非常容易识别。
有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等 ,取得了满意的结果。
因此 ,针对不同样品 ,有目的地设计出相应的选择性培养基 , 以筛选污染菌中的危险菌群 ,将是一个值得探索的方向。
2接种方式接种方式主要有倾注法和涂布法两种。
目前国际方法中采用倾注法,但近来国际上有不少学者认为霉菌计数采用涂布法更合适。
Beuchat 和 Matsuda 等人分别对这两种方法作了大量比较试验后发现,对霉菌计数来说,涂抹法有以下几方面优越于倾注法: ①培养出的霉菌菌落数较多;②培养所需的时间较短;③霉菌孢子、菌落形态特征发育完全, 便于鉴定。
这是因为绝大多数霉菌是好氧的,在培养基表面生长快,发育好 , 而混在培养基中发育就受影响,而且在培养基倾注时霉菌孢子易受热损伤。
我们在自己的实验室也做了类似的比较试验, 通过对 30种常见霉菌的试验证实了上述的结论。
因此,我们认为 ,霉菌计数采用涂布法既准确又省时,值得推广。
3培养温度经对多种常见霉菌的最适生长温度作了调查发现,大部分菌种的最适温度为25~30℃ 。
但一些产曲霉毒素的菌株或动物致病菌则需要更高的温度,如黄曲霉35 ℃、构巢曲霉33℃、烟曲霉37℃、小孢子菌35 ℃。
因此,培养温度也应根据培养目的而定,一般情况下都采用25~28℃培养 ,若有特殊培养目的,则应适当调节培养温度。
4培养时间我们对 30 种常见霉菌的生长速度作了调查,正常培养条件下, 培养 3~4 天的菌落数与5~7 天的基本相同 ,但菌种的特征不明显, 因此 ,如果只要作霉菌计数,培养 3~4 天已基本达到目的 ,但如果还要进一步分类鉴定,则需要培养更长的时间 (7~14 天) 。
必须特别注意的是,有几类生长特别快、菌丝很多的菌, 则必需在 48 小时以内计数 ,否则菌丝就会覆盖整个平皿,无法准确计数。
这类菌主要有 : 毛霉、根霉、犁头霉、共头霉、木霉等湿度较大的样品,这类菌污染较多 ,检测这类样品,应提早观察记录。
5最适计数范围霉菌菌落由孢子和菌丝组成, 相当扩散 , 在直径 9cm 的平皿里 , 菌落数稍多就相互交叉重叠,影响计数 , 但数量太少又会产生较大的误差,因此选择适当的稀释度计数是保证结果准确的关键环节之一。
我们对这方面作了一些观察研究,首先是将实验菌株的斜面培养物制成含有约 106 个 /ml 的孢子悬液 ,并用血球计数器在显微镜下准确计数,然后将饱子悬液作10-1~10-6倍稀释 , 吸取不同稀释度的稀释液接种于PDA,25 ℃培养 5 天后计数。
30 种常见霉菌的两种不同计数方法所得结果比较显示,大部分菌株每平板含有10~50 个菌落的稀释度时的计,数与显微镜计数结果最接近 ;有近一半的菌株 ,每个平板含 50~100 个菌落已较难计数而大部分菌株 ,超过 100 个 / 平皿或小于 10 个 / 平皿的计数结果就与显微计数结果存在较大差别,因此 ,应尽量选择 10~50 个 / 平皿的稀释度进行霉菌计数。
而对上述提及的菌丝很丰富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株,则应在更少的范围内计数 (30 个 /平皿以内 )。
为控制霉菌的生长速度和菌落的生长范围,可在培养基中添加少量抗生素 ,如氯霉素(50~100mg/L), 金霉素 (20~100mg/L),庆大霉素(50mg/L),土霉素(100mg/L)等。
6霉菌检测过程中应特别注意的事项6.1 由于霉菌检测所需的时间较长 ,中间又需要多次观察 ,因此实验前一定要作好实验计划 ,明确观察记录的时间。
6.2 霉菌孢子通过空气传播 ,所以实验时应保持实验室平静 ,减少空气流通 ; 操作时手脚要快 ,动作要轻 ,特别是培养过程中 ,如果观察时动作过大 ,早期生长出的霉菌孢子就会在培养基内扩散 ,形成新的菌落 ,导致结果不准确。
6.3实验前应认真做好全面的消毒工作,包括操作人员手指、实验室空间、实验台等,实验后应第一时间将有霉菌的培养物高压灭菌, 防止进一步扩散。
6.4对使用的菌株的生理、生态、形态、毒理、致病性必需有充分的了解,并作好相应的防扩措施 ,防止污染其它物品。
3.2.1 涂片镜检分别取l5 羽鸡肺部或气囊有结节的病料，将结节用 2 片载玻片压碎后分开，再用镊子调匀，革兰氏染色后盖上盖玻片，置高倍镜下观察。
结果在暗视野下可见到大量的分隔菌丝，气囊上的结节除可见到菌丝外，还可以见到散在的蓝色球状孢子。
3.2.2 分离培养挑取典型病变结节接种于血液琼脂平板培养基上，置于37 ℃温箱中培养。
24 h 后可见到小米粒大小的白色绒毛状菌落，48 h 后菌落增大， 60 h 后转为淡绿色，72 h 后菌落转为暗绿色，一个星期后呈黑褐色[4]。
用接种环挑取菌落涂片镜检，可见到曲霉菌的形态结构（菌丝有隔，末端膨大成球状，球上有小梗，有的梗上有孢子存在，状如花冠），符合曲霉菌的特点。
根据实验室检查结果再结合病史调查、现场观察、临床症状及剖检变化，可确诊为禽曲霉菌病。
（一）直接检查是最简单而重要方法，浅部感染真菌的病变标本如毛发、皮屑、甲屑置玻片上，滴加 10%KOH ，覆盖玻片微热熔化角质层，再将玻片压紧，用吸水纸吸去周围多余碱液，在显微镜下观察，见皮屑甲屑中有菌丝，或毛发内部或外部有成串孢子，即可初步诊断为癣菌感染，但不能确定菌种。
深部感染真菌标本如痰，脑脊液亦可做涂片用革兰氏染色（白色念珠菌）或愚汁负染色（隐球菌）观察形态特征。
（二）培养检查本法可确定菌种，辅助直接检查不足，通常用沙保氏培养基（22～ 28℃），深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂 37℃培养，或根据不同菌种运用不同培养基，如孢子丝菌可用胱氨酸血液葡萄糖琼脂，必要时运用鉴别培养基和生化反应，同化试验等进行鉴定。
（三）免疫学试验近年来有许多方法用于检测深部感染真菌的抗体，作辅助诊断荚膜组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。
但系统性感染患者常因免疫功能降低不出现抗体；而且许多真菌间抗原性有交叉反应；有的产生抗体后维护时间较长，正常人群中有一定比例的阳性率，则必须结合临床情况分析结果才能作出恰当的诊断。
由于上述检测抗体受到许多因素的限制，及深部真菌感染时，早期培养阳性率甚低，晚期则多于失去治疗时机，因此用免疫学方法从血清或其他部位检测真菌抗原，对早期诊断具有重要意义。
如乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原，ELISA 法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原及免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原等，均为早期，快速、特异的诊断方法。
（四）动物试验其些真菌对实验动物有致病性，如皮炎芽生菌，球孢子菌可在小白鼠，豚鼠体内生长，白色念珠接种家兔小白鼠可发生肾脏脓肿致死。
四、防治原则真菌感染尚无特异预防，主要注意公共卫生和个人卫生，碘化物治疗孢子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效。
制霉素、灰黄霉素、克霉唑（三苯甲霉唑）等外用或内服过癣症和白色念珠菌病等有较好疗效。
近年服道5-氟胞嘧啶（ 5-FC ）治疗单细胞真菌感染疗效显著。
二性霉素 B 可用于深部全身真菌感染。
玻片培养又称小培养，小培养法可以随时观察真菌的生长形态（如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等），还可以随时观察其生长发育的全部情况，有利于菌种的鉴定。
1、钢环法（1）材料：白假丝酵母菌、沙保弱培养基、玻片培养又称小培养，小培养法可以随时观察真菌的生长形态（如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等），还可以随时观察其生长发育的全部情况，有利于菌种的鉴定。
1、钢环法（ 1）材料：白假丝酵母菌、沙保弱培养基、无菌玻片、盖玻片、钢环（带有缺口）、石蜡。