枯草芽孢杆菌发酵探讨
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枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，已被越来越多地研制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力。这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率、防病和促进生长起到重要作用。鉴于此，国内外专家学者对研究开发枯草芽孢杆菌制剂用于畜禽养殖日趋关注，从而也促进了这一产业的迅猛发展，但在现阶段的工业化生产中，存在着制约枯草芽孢杆菌发酵的诸多因素。
1、枯草芽孢杆菌的生物学特点
杆菌：一般（0.7～0.8）×（2.0～3.0）μm，电子显微镜测量为（0.5～0.6）×（1.1～3.5）μm，革兰氏阳性，运动，有长而又丰富的周生鞭毛。
芽孢：椭圆形，中生或偏中生，即使孢囊膨大也不显著。
生长温度：最高温度45～55℃；最低温度5～20℃。
阳性反应：接触酶；V-P反应；在7％的氯化钠中生长；pH5.7生长；分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸；水解淀粉；利用柠檬酸作为碳源；还原硝酸盐为亚硝酸盐；分解酪素；石蕊牛奶产碱胨化。
阴性反应：厌氧生长；
卵黄反应：在葡萄糖洋菜上或酪氨酸洋菜上形成可溶性黑色素；28℃4星期水解马尿酸盐；利用丙酸盐并分解酪氨酸。在55℃生长的菌株被0.02％的叠氮化合物抑制。
变化的性质：在V-P液中产酸(pH5.0～8.0)；对溶菌酶的抗性；在10％的氯化钠中生长。2、芽孢杆菌制剂的作用机理
2.1可产生酶类和营养物质
研究表明芽孢杆菌能够分泌大量的胞外酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，有助动物对饲料的降解、消化，提高饲料利用率。饲料中未被消化的蛋白质和一些含氮物质在肠道中被大肠杆菌和其他细菌脱梭生成具有潜在的毒性的腐胺、吲哚、酚类等物质。一些芽孢杆菌可产生氨基氧化、SOD酶、分解硫化氢的酶以及其他抗菌物质如过氧化氢，起到杀菌作用，从而减少动物体内有害物质的产生。研究表明一些芽孢杆菌产生SOD酶，SOD可以清除生物体内活性氧自由基，减少其对细胞的毒害作用，使生物 体免受伤害。芽孢杆菌在生长繁殖过程中可以产生挥发性脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，一些脂肪酸可降低动物肠道的pH，从而为乳酸菌的生长创造条件，并且抑制病菌的生长。其中丙酸还可以参与三梭酸循环，为动物的新陈代谢提供能量。同时，能够产生很高的维生素B和维生素C，为动物提供维生素营养。1996年Ozols对106株肠道菌进行研究发现芽孢杆菌是维生素Bl和维生素B6的主要生产者；1998年倪学勤等研究表明芽孢杆菌产生有机酸为机体提供能量营养的同时，还促进动物对钙、磷、铁的吸收利用。
2.2生物夺氧与生物拮抗作用
肠道原籍菌群是肠道的优势菌，大多厌氧，而致病菌多为需氧菌。人为引入的益生芽孢杆菌在肠道定植后，消耗大量的游离氧，造成厌氧环境，可减少需氧菌对肠道的定植，并有利于乳酸杆菌和双歧杆菌等厌氧菌的生长，致使体内的有益菌增加而致病菌减少，保持肠道微生态系统平衡。芽孢杆菌与有害菌竞争基本营养物质和肠道等黏膜结合位点，抑制有害菌从而减少肠道疾病，提高机体抗病能力。
2.3提高机体的免疫能力
近年来研究表明，芽孢杆菌能分泌活性抗菌物质，使肠道相关淋巴组织处于高度反应状态。同时T、B淋巴细胞的数量增多，动物体液和细胞免疫水平提高。1992年Jonsson等报道，芽孢杆菌分泌胞外酶系的同时还产生抗生素。
3芽孢杆菌饲料添加剂的应用优势
乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌作为益生菌的3种主要菌种来源，各自具有不同的生物学特性，在生产上也是各有不同。相对于另外两种微生物，尤其是应用最为广泛的乳酸杆菌，芽孢杆菌具有独特的优势，主要体现在以下三个方面。
3.1安全性
很多种类芽孢杆菌及其代谢产物已广泛应用于食品、饲料中，目前尚未发现毒副作用，是一种安全的菌种。许多芽孢杆菌及其代谢物很早就被人们有意无意地在食品、医药和饲料中使用，一些芽孢杆菌属于“公认安全(GRAs)”的菌种，芽孢杆菌代谢产生的多种酶，如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶已在食品与饲料中广泛应用。芽孢杆菌作为益生菌对动物无毒害，生产出的肉蛋类食品也是安全的。
3.2代谢速度快
芽孢杆菌易于分离、培养与保存，一般对营养要求比较简单，代谢速度比较快，对于工业生产的要求不高。另外芽孢对热、紫外线、电离辐射和某些化学药品有很强的抗性，可忍受不良环境，比如可以在pH酸性环境生存，也可以在温度高达80℃甚至更高的环境中生长。
3.3分子加工操作简便
目前芽孢杆菌的分子生物学研究已比较深入，可以利用分子生物学工具和知识研发高产性能的菌种，提高微生态制剂的饲喂效果，比如可以把蛋白酶、木聚糖酶的基因转移到芽孢杆菌中进行表达等，更大程度地发挥芽孢杆菌的益生作用。
4枯草芽孢杆菌发酵研究
所谓发酵，是借助微生物大量生成积累特定的代谢产物的现象。发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制。灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。
早在1975年，美国用苏云金杆菌(Bacillus
thuringiensisBerliner)发酵制各种杀虫剂，以后各种芽孢杆菌被应用进行发酵生产各种产物。如应用地衣芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶；利用耐碱性芽孢杆菌制备碱性淀粉酶；以枯草芽孢杆菌为出发菌株发酵生产中性蛋白酶、木聚糖酶、D-核糖、A-乙酰乳酸脱羧酶、B2甘露聚糖酶、肌苷、碱性果胶裂解酶。枯草芽孢杆菌可以以内生芽孢的形式发挥其功能。当前，研究人员已经开始对以芽孢作为发酵产物的发酵体系进行摸索和优化。张根伟等对发酵培养基的组分和其他发酵条件进行研究构建了枯草芽孢杆菌BS-6的液体发酵体系，使该菌的最后发酵水平为1.66×109CFU/mL。考虑到发酵培养基原料成本及获得途径便利等因素，麸皮、玉米粉、豆米粉等材料已经用于该类细菌的发酵生产，并获得较高的芽孢产量。 4.1影响芽孢杆菌发酵的因素
芽孢杆菌产生的对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有强抗性的芽孢，可忍受各种不良环境，能防治多种植物病害，易定殖在植物表面。其芽孢可以制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型的生防制剂而应用于农业生产，此制剂具有与化学农药混用而不失活的特性。因此，有必要对芽孢杆菌的产孢特性进行研究，以期获得最佳产孢条件，最终获得商品化芽孢制剂。微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要提供合适的发酵条件，才能使它的生产能力充分发挥出来。优化发酵工艺可以充分发挥菌种的潜在能力，提高发酵过程的生产效率，降低生产成本。因此，工艺优化的研究尤其重要。
发酵工艺的研究可从以下两方面入手：
(1)培养基组分的影响：包括碳源、氮源、维生素和辅酶、无机盐及微量元素等。
(2)发酵条件的影响：包括温度、初始pH、初始接种量、装液量、转速等。
4.1.1 培养基对发酵的影响
培养基是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基的组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重要影响。发酵工艺可分为斜面种子培养、种子扩大培养、发酵罐内菌体培养、和产物合成等几个培养过程。种子培养基是供菌体生长繁殖用的，营养成分应是易被菌体吸收利用，比较丰富和完整，其中氮源和维生素的含量应略高些，但总浓度略低为宜，以便菌体的生长繁殖。发酵培养基是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。发酵培养基的组成要考虑菌体在发酵过程中的各种生化代谢的协调，在产物合成期，使发酵液的pH不出现大的波动。采用的原材料质量相对稳定，同时不影响产品的分离精制，不影响产品的质量。每个过程都有其培养基组成和制备工艺条件的要求。因此必须按照不同培养阶段的微生物生理学特性提供适宜的培养基配方。
4.1.1.1 碳源对发酵的影响
碳源是组成培养基的主要成分之一，其主要作用是供给菌种生命活动所需要的能量和构成菌体细胞成分和代谢产物中的碳素来源。一般的微生物可以在含各种碳水化合物的培养基上良好生长，但它们产物的生产能力和碳源的种类有很大关系。碳源的种类及浓度，主要是由菌种耐渗透压高低和调节细胞膜渗透性的方法来决定，所以枯草芽孢杆菌发酵采用的碳源主要有葡萄糖、糖蜜、淀粉、玉米粉等。目前，国内外主要选用玉米粉。
4.1.1.2 氮源对发酵的影晌 氮源的主要作用是微生物细胞物质和含氮代谢物的氮素来源的营养物质。氮源作为枯草芽孢杆菌发酵培养基的另一个主要因素，在芽孢的形成上也发挥着重要作用。枯草芽孢杆菌在生产中常用豆饼粉、鱼粉以及(NH4)2S04等一些试剂作氮源。C/N直接影响菌体的生长和代谢，碳源转化为微生物自身的细胞物质和代谢产物，并且是能源物质。氮源是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸是微生物原生质的主要组成部分。如果C/N偏小，会导致菌体生长过剩，易造成菌体提前衰老自溶；C/N过大，菌体繁殖数量少，发酵密度低，细菌代谢不平衡，不利于产物的积累；C/N合适，但C、N源浓度过低，则会影响菌体的繁殖，C、N浓度过高，则发酵起始导致菌体大量繁殖，代谢废物过多而增加发酵液的黏度，使溶解氧降低，引起菌体代谢异常，最终也影响产物的合成。
4.1.1.3 无机盐对发酵的影响
工业发酵中应用微生物的生长繁殖和产物合成中都需要无机盐和微量元素，如磷、硫、铁、锰、钙、镁等。许多金属离子对微生物生理活性的作用与其浓度相关，低浓度往往呈现刺激作用，高浓度却表现出抑制作用。锰是枯草芽孢杆菌生长的必需元素，当培养基中缺少Mn2+时，不适合枯草芽孢杆菌的生长，促进芽孢的生成。提高Mn2+浓度将会导致培养基成分比例失调，渗透压升高等一系列变化，从而诱导芽孢生成。
磷在菌体生长、繁殖和代谢活动中起着极其重要的作用。一方面，磷是构成核酸、磷脂、许多辅酶或辅基(辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ、辅酶A、NAD和NADP等)以及高能磷酸化合物的重要原料，另一方面，磷在代谢调节方面也起着重要的作用，磷能促进糖代谢的进行，促进微生物的生长。因此，磷源是枯草芽孢杆菌发酵培养基中另一个重要的组成成分，它的浓度直接影响着枯草芽孢杆菌菌体的生长和芽孢的形成。
钾虽不参与细胞结构成分，但它是许多酶作用的激活剂，钾还对细胞原生质的胶体状态和细胞膜的透性起调控作用。
钙主要参与调节细胞的生理状态，如：维持细胞的胶体状态，降低细胞膜的通透性，调节pH等。
4.1.2 其他发酵参数对发酵的影响
4.1.2.1初始pH对发酵的影响
pH是微生物生长和产物合成的非常重要的状态参数，是代谢活动的综合指标。为了达到微生物的充分繁殖，培养基必须保持适当的pH。初始pH的变化对于枯草芽孢杆菌的生产发酵过程影响是非常显著的。因此，决定最佳初始pH对于细菌发酵液含菌量就显得尤为重要。
pH影响菌量的原因：1）pH会影响微生物的细胞原生质膜
枯草芽孢杆菌的发酵培养基优化研究
第
21期
收稿日期
院圆园员愿原园愿原员源
基金项目
院湖北省技术创新专项重大项目
渊圆园员远粤月粤员园猿冤曰湖北省农科院重大研发成果培育专项
渊圆园员苑悦郧孕再园员冤曰国家重点研发计划项目
渊圆园员苑再云阅园圆园园怨园园冤
作者简介
院饶犇
渊员怨愿猿原冤袁男
袁湖北孝感人
袁助理研究员
袁博士
袁主要从事发酵工程研究
袁渊电话
冤员缘远圆猿园苑远怨远愿渊电子信箱
冤远圆猿圆缘猿缘员圆岳择择援糟燥皂遥饶犇
袁周荣华
袁闵勇
袁等
.枯草芽孢杆菌的发酵培养基优化研究
咱J暂.湖北农业科学
袁2018袁57渊21冤院127-129.第
57卷第
21期
圆园18年
11月湖北农业科学
匀ubei粤gricultural杂ciences灾燥造援57No.21
Nov.袁圆园18
枯草芽孢杆菌
渊月葬糟蚤造造怎泽泽怎遭贼蚤造蚤泽冤是一种常用的
微生物源生物农药
遥枯草芽孢杆菌在防治水稻
尧小
麦
尧花生
尧番茄
尧辣椒
尧大豆
尧玉米等作物的病害上有
较好的效果
袁特别是针对小麦白粉病
尧赤霉病
尧纹枯
病等病害的防治效果更佳
袁田间增产率达到了
员园豫
耀缘园豫
咱1-4暂遥
枯草芽孢杆菌具有很强的营养物质竞争能力以
及氧气竞争优势
曰定殖
尧繁殖速度很快
袁迅速抑制其
他病原微生物生存
袁起到保护植物
尧确保植物健康生
长的作用
遥此外
袁枯草芽孢杆菌对人畜无毒无害
尧不污染环境
尧对作物安全
曰能产生多种抗菌素和酶
袁具
有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力
曰还能分泌促进
作物生长的活性物质
袁使植株叶片浓绿肥厚
袁提高作
物免疫力
袁增产提质效果显著
袁发酵过程中产生多种
氨基酸
袁对作物有生长调节的作用咱5-9暂遥
枯草芽孢杆菌主要是以
猿种方式起作用
袁一是
竞争作用
院拌种或灌根后
袁枯草芽孢杆菌能够在作物
周围
尧根表面
尧根内部以及通过植物导管传导到地上
部分而在作物根表
尧根内
尧茎部
尧叶部等位点定殖和
繁殖
袁保护作物根部不受病菌侵染和抑制作物体内枯草芽孢杆菌的发酵培养基优化研究
饶犇
袁周荣华
袁闵勇
袁廖先清
袁刘芳
袁陈伟
袁张光阳
渊湖北省生物农药工程研究中心
袁武汉
发酵条件对枯草芽孢杆菌发酵豆粕中的蛋白酶活力的影响
现代食品科技 Ｍｏｄｅｒｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００８，Ｖｏｌ・２４，Ｎｏ・１０
发酵条件对枯草芽孢杆菌发酵豆粕中的
蛋白酶活力的影响
吴晖’，卓林霞’，解检清 ，刘冬梅。
（１．华南理工大学轻工与食品学院，广东广州５１０６４０）（２．湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙４１０１２８）
摘要：以每克发酵豆粕中的蛋白酶活力和发酵豆粕的感官为指标，研究了枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕的不同发酵条件对发酵豆
粕中蛋白酶活力的影响。实验表明在３０ｏＣ、发酵７２ｈ、料水比１：１（ｍ／ｅ）、ｐＨ７．０、接种量４％（Ｖ／ｍ）条件下对豆粕进行枯草芽孢杆
菌发酵，发酵豆粕中的蛋白酶活力最高，每克发酵豆粕的蛋白酶活力ｉ 到６３０Ｕ。
关键字：固态发酵；枯草芽孢杆菌；发酵豆粕；蛋白酶活力
中图分类号：ＴＱ９２５；文献标识码：Ａ；文章篇号：１６７３．９０７８（２００８）１０．０９７３－０４
Ｅｆｆｅｃｔ ０ｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ０ｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ０ｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ０ｎ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｍｅａｌ
、ｖＵ Ｈｕｉ ，ＺＨＵＯ Ｌｉｎ－ｘｉａ ，ＸＩＥ Ｊｉａｎ－ｑｉｎｇ ，ＬＩＵ Ｄｏｎｇ－ｍｅｉ
（１￣Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＬｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅ￣ｉｔｙ ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５ １０６４０，Ｃｈｉｎａ）
（２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｇａｒｄｅｎｉｎｇ，ＨｕｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｎｓｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｎ ｌｇ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ
不同浓度枯草芽孢杆菌对体外瘤胃发酵特性的影响
不同浓度枯草芽孢杆菌对体外瘤胃发酵特性的影响
李月明;栾嘉明;张敏;金英海;夏广军;耿春银
【摘 要】本研究利用体外产气量法,以生产中较为常见的TMR(精粗比60:40)为发酵底物,通过单因素试验设计,研究了低、高剂量(1.14×1010、2.27×1010 CFU/kg)枯草芽孢杆菌对体外发酵12、48 h瘤胃产气动力学参数、瘤胃发酵参数等指标的影响;同时根据24 h产气量预测枯草芽孢杆菌对底物代谢能值(M E)、有机物消化率(OMD)及微生物蛋白(MCP)产量的影响,旨在为其合理应用提供理论依据.结果显示:在产气动力学方面,与对照组(CON)相比,低剂量组(T1)和高剂量组(T2)均显著提高了24、48 h的产气量(P<0.05),且T2组显著高于T1组(P<0.05);与对照组相比,T1组发酵12 h甲烷(CH4)含量显著增加(P<0.05),T2组无明显变化(P>0.05).在瘤胃发酵参数方面,与对照组相比,T1组12 h各发酵参数均无显著变化(P>0.05),T2组氨氮(NH3-N)浓度显著增加(P<0.05),但其他发酵指标均无显著变化(P>0.05);T1组发酵48 h丁酸及戊酸含量显著降低(P<0.05),T2组pH显著降低(P<0.05)、总挥发性脂肪酸含量显著升高(P<0.05);T1及T2组其他48 h瘤胃发酵指标均无显著变化(P>0.05).T1、T2组OMD、ME及MCP产量均显著高于对照组(P<0.05);T2组OMD和ME均显著高于T1组(P<0.05).综合上述结果,不同浓度的枯草芽孢杆菌对精粗比为60:40的TMR发酵参数均有一定程度的改善,但其效果存在一定的差异,高添加量(2.27×1010 CFU/kg)的效果更好.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2019(046)004
【总页数】7页(P1031-1037) 【关键词】芽孢杆菌;体外产气法;瘤胃发酵
枯草芽孢杆菌固体发酵条件优化
枯草芽孢杆菌固体发酵条件优化
杨婷;廖美德;贺玉广;刘偲嘉
【摘 要】为研究初始pH、蛋白胨浓度和不同发酵底物对枯草芽孢杆菌生长的影响,对不同发酵底物进行液态和固态发酵试验,结果发现,pH为6.5～7.0时,细菌生长最快,pH为7.5～8.0时,蛋白酶的活性最强;蛋白胨1.6 g·L-1的LB培养基,枯草芽孢杆菌的生长状况最好,蛋白酶的活力也最强;豆粕是优质氮源,能显著促进枯草芽孢杆菌的生长和蛋白酶活性,豆粕20％、豆渣10％、麸皮60％和玉米粉30％作为固态发酵底物,枯草芽孢杆菌的生长速度最快,豆粕10％、豆渣10％、麸皮50％和玉米粉10％为固态发酵底物,枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶活力最强.
【期刊名称】《饲料博览》
【年(卷),期】2015(000)003
【总页数】4页(P5-8)
【关键词】枯草芽孢杆菌;发酵;正交实验
【作 者】杨婷;廖美德;贺玉广;刘偲嘉
【作者单位】华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州
510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642
【正文语种】中 文
【中图分类】S816.6 枯草芽孢杆菌是一类广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性好氧型细菌，常作为益生菌添加在幼小动物日粮中，能够起到改善动物肠道菌群结构、提高消化酶活性、改善机体免疫功能以及提高生产性能的作用，对人畜无毒害作用，不污染环境[1-2]。枯草芽孢杆菌可产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等，对提高动物的饲料转化率、促进营养的消化吸收和预防疾病起到重要作用[3-5]。目前，在工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题。本文在前人的研究基础上，以玉米粉、麸皮、豆粕、豆渣为原料，旨在寻找出一种高效经济的发酵底物，获得较高的枯草芽孢杆菌产量和酸性蛋白酶活力。
枯草芽孢杆菌菌株发酵生产工艺优化
・２５８・ 农林科研
枯草芽孢杆菌菌株发酵生产工艺优化
张欣
（黑龙江省科学院生物肥料研究中心，黑龙江哈尔滨１５００８６）
摘要：本研究在枯草芽孢杆菌茵剂发酵通用培养基中添加了不同比例的豆饼粉和麸子粉，根据发酵过程中菌体数量的变化，对几种配
方进行多次筛选试验，最终确定了通用培养基＋１．５％豆饼粉＋１．０％麸皮为最佳的枯草芽孢杆菌菌剂发酵培养基配方，即改良的培养基。 关键词：枯草芽孢杆菌；发酵；培养基
化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用，但长期连
续不合理的使用化学农药，产生了诸多问题，不但污染环境，有些还直
接危害农作物的健康，引致各种急性或慢ｌ生生理幽青害，甚至危及人和 动物的健康。利用有益微生物防治植物病害始于１９２１年Ｈａｒｔｅｌｙ利用
真菌防治猝倒病，１９７３年Ｋｅｒｒ利用放射土壤杆菌成功地防治了植物根 癌病，８Ｏ多年来植物病害生防微生物己涉及真菌、放线菌、细菌乃至病
毒（ｆｌ筮菌体垮很多种群。枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｍｕｓ ｓｕｂｔｉ［ｉｓ）是一种好氧产芽
孢的革兰氏阳性细菌，其生理特征丰富多样，分布广泛，极易分离培养。
该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种 抗菌素和酶，具有广谱抗菌潘陛和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌不仅
可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，同时还是植物体内
常见的植物内生细菌，尤其是在植物的根部和低茎部位，目前该菌已经 在白菜、黄瓜、辣椒、水稻、小麦、玉米等农作物上显出很好的病害防治
效果 。枯草芽孢杆菌最突出的特征是生长陕、营养简单、能产生耐热 抗逆的芽孢，这也有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存
活、定殖与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存 期长，是一种比较理想的生防微生物目。本文研究了枯草芽孢杆菌菌株
的发酵生产工艺，对原有发酵培养基进行改良，显著提高了发酵产物的
产量，对发酵产物的获得具有十分重要的意义。
黄瓜内生枯草芽孢杆菌B504发酵配方优化研究
北方园艺２０１０（４）：１５７￣１６ｏ ・植物保护・
黄瓜内生枯草芽孢杆菌Ｂ５０４发酵配方优化研究
苗则彦 ，赵奎华 ，刘长远 ，梁春浩 ，王 辉 ，吕国忠
（１．辽宁省农业科学院，辽宁沈阳ｌ１０１６１；２．大连民族学院，辽宁大连１１６６００）
摘要：利用ＳＡＳ软件对黄瓜内生枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｔ３５０４发酵培养基进行优 化。首先用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ法筛选出３个重要因素，通过最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域，
最后采用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ设计及响应面分析确定主要影响因子的最佳浓度。结果表明：当葡萄糖、
ＫＨ Ｐ 、玉米粉、黄豆粉、ＭｎＳ（） 、Ｋ２ ＨＰ（ 的最佳用量分别为０．７２、１．０７、３．６７、３．０、２．０、３．０ ｇ时，
发酵培养基产生的芽孢数量达到最大值２．２２×１０ ｃｆｕ／ｍＩ ，较优化前的１．８１×１０ ｃｆｕ／ｍＬ提高了
２２．７ 。 关键词：黄瓜内生枯草芽孢杆菌；响应面法；优化
中图分类号：Ｓ ６４２．２文献标识码：Ａ文章编号：１００１—０００９（２０１０）０４－－０１５７…０４
植物内生枯草芽孢杆菌具有一般植物内生细菌特
有的生存优势，它避开了温度、紫外线、营养贫乏等不利
因素的影响，具有相对安全稳定的生存环境，营养来源 丰富，因而更利于其发挥生物防治潜能［１］。试验所用的
枯草芽孢杆菌Ｂ５０４为黄瓜内 细菌，通过催芽过程在 植物发育早期进入且不根，并随着植株的生长发育在根、
摹、叶中定殖。在催芽及苗期阶段对植株促生作用明显。
催芽时生防菌进入植株体内，通过吸收植物中的营养完
成定殖、转移过程， 现出内生细菌独特的优势，对黄瓜
帖萎病具有一定的防治作用 ］。
ＳＡＳ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）软件可方便地定量
分析各因素对试验结果的影响，使优化后的工艺科学性 强、重现性好、可信度高。Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法可在
枯草芽孢杆菌的发酵培养基优化研究 2
枯草芽孢杆菌的发酵培养基优化研究
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由t检验结果可知，玉米淀粉和豆粕对枯草芽孢杆菌的生长和芽孢形成具有显著影响，可信度在95%以上，且两者对枯草芽孢杆菌的生长影响是正效应。
由上述Plackett-Burman试验得到的回归方程为Y=75+5.67X1+0.83X2+0.5X3-X4+11X5，方程拟合的相关性为R2=98.01%，表明此多项式方程很好地模拟和解释了Plackett-Burman的试验结果。
2.2 最速爬坡试验结果
找到对产物发酵影响最大的因素后，需要进一步对这些因素进行分析。最速上升法以前述Plackett-Burman设计试验得到的一次方程为基础，以相应因素的系数比为基准进行步移，直到步移至最高点，然后以最高点附近的范围作为响应面优化的相应范围。从Plackett-Burman设计试验得到方程中玉米淀粉和豆粕的系数（X1=5.67，X2=11），可以得到这两个因素步移的步长比为1.00∶1.94，即当玉米淀粉步移1.00个单位（0.20 g/L）时，豆粕也步移1.94个单位（0.38 g/L）。以Plackett-Burman设计中的中心点作为步移的起点，试验设计与试验结果如表2所示。从试验结果（表2）可以看出，枯草芽孢杆菌芽孢的产量在步移进行至第三步时达到最高点，之后芽孢产量开始下降。步移最高点时，玉米淀粉和豆粕的浓度分别为2.40、4.76 g/mL，这一点被用作下一步响应面分析的中心点。
一种枯草芽孢杆菌发酵繁育方法与流程
一种枯草芽孢杆菌发酵繁育方法与流程
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枯草芽孢杆菌的发酵繁育方法与流程解析
枯草芽孢杆菌选育及发酵大豆粕工艺条件研究
２０１０年第６期 粮食与油脂 ２３ 枯草芽孢杆菌选育及发酵大豆粕工艺条件研究 姚小飞’。叶璐 ，赵世敏 （１．武汉生物工程学院， 湖北武汉４３０４１５； ２．武汉市汉铁高级中学， 湖北武汉４３００１０） 、 摘要：以紫外诱变所得枯草芽孢杆菌Ｂ１－２发酵大豆粕生产大豆多肽，通过单因子及正交试验确 定最佳发酵条件，结果表明：发酵培养基中含９％大豆粕、２％麸皮，利用培养２４ ｈ枯草芽孢杆菌 Ｂ１—２菌株作为茵种，在初始ｐＨ ７．５，温度３５￣Ｃ￣４０￣Ｃ，接种量８％条件下发酵６４ ｈ，大豆粕水解度 可从初始条件１７．８０％提高至２１．０６％，相比条件优化前水解度提高１８％。 关键词：大豆粕；枯草芽孢杆茵；大豆粕发酵 Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｓ０Ｙ ｍｅａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＹＡｏ Ｘｉａｏ—ｆｌｅｉ。ＹＥ ｌｕ。ＺＨＡＯ Ｓｈｉ－ｍｉｎ （１．Ｗｕｈａｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ。Ｗｕｈａｎ ４３０５１５。Ｃｈｉｎａ； ２．Ｗｕｈａｎ Ｈａｎ Ｔｉｅ Ｍｉｄｄｌｅ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｗｕｈａｎ ４３００１０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｅｐｆｉｄｅ ｗａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ １—２ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＵＶ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｄｄ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｏ￣ｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔｓ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｒｅ ９％ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ，２％ｗｈｅａｔ ｂｒａｎ，８％ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ２４ ｈ ａｔ ｐＨ７．５ ａｎｄ ３５￣Ｃ￣４０￣Ｃ．Ａｆｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ６４ ｈ．ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｆｒｏｍ １ ７．８０％ｔ０ ２ １．０６％．Ｗｉｔｈ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｐｒｅ－ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ １８％． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ；ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ 中图分类号：ＴＱ６４５．９＋９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８～９５７８（２０１０）０６－－００２３—０４ 大豆粕是畜牧饲养业和水产养殖业最重要饲料 原料之一，占蛋白饲料８０％－－－９０％。然而大豆蛋白质 分子结构复杂，相对分子质量高…，使大豆蛋白消化 率和生物效价不如牛奶等动物性蛋白；同时大豆蛋白 溶解度较低，无法直接作为功能性成分在食品和饲料 中加以利用汜 。 大豆蛋白水解后产物即大豆多肽，通 常由２～９个氨基酸组成ｂ ，大豆肽相比大豆蛋白具 有独特加工性能。据大量研究表明，动物对小肽吸收 比蛋白质及氨基酸更加快捷，且小肽吸收利用可促进 动物对其它营养吸收，从而大幅减少动物疾病，因此 具有十分广阔开发利用前景 。 本试验针对大豆粕组成，利用产蛋白酶为主兼产 纤维素酶为辅枯草芽孢杆菌将大豆粕大分子蛋白转 化为易被动物利用小分子量蛋白质和肽类，试验以蛋 白质水解度作为标准，确立可靠酶解条件，期望能为 工业化生产提供理论依据和参考。 １试验材料 １．１菌株 枯草芽孢杆菌ＢｌａＢ７：武汉生物工程学院微生 物实验室。 １．２培养基 种子培养基：牛肉膏３ｇ，蛋白胨１０ ｇ，ＮａＣ１ ５ ｇ， 琼脂２ ｇ，水１０００ｍｌ，ｐＨ７．０．－￣７．２； 酪素培养基：牛肉膏２ ｇ，酪素４ ｇ，ＮａＣ１ Ｏ．１６ｇ， ＫＨ２ＰＯ４Ｏ．３６ｇ，ＭｇＳＯ４Ｏ．５ｇ，ＺｎＣｌ２０．１４ｇ，ＮａｚＩ－｛ＰＯ４．・７Ｈ２Ｏ １．ｏ７ｇ，ＦｅＳＯ４０．００２ｇ，琼脂ｌ７ｇ，水１０００ｍｌ，ｐＨ７．０～７．２。 发酵初始培养基：大豆粕ｌＯｇ，水１００ｍｌ，ｐＨ自然。 １．３主要试验仪器 ７２２Ｓ型分光光度计：上海棱光技术有限公司；电 子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；ＰＨＳ－２５Ｃ 数显酸度计：上海宇隆仪器有限公司；ＨＱ４５Ｚ恒温摇 床：武汉中科科仪技术有限责任公司；８０－２Ｂ离心机： 常州国华电器有限公司。 ２试验方法 ２．１枯草芽孢杆菌生长曲线制备 按文献［５］方法。 ２．２枯草芽孢杆菌产酶及发酵大豆粕能力筛选 枯草芽孢杆菌ＢｌａＢ７菌株经活化后，分别点种 在酪素平板上，初步检测其产蛋白酶特性，根据结果 分别测定其蛋白酶活力大小，按文献［６］方法测定。 ２．３紫外线诱变 菌种经种子培养基培养２４ ｈ后，调节单细胞菌 悬液活细胞数至１０ ｃｆｕ／ｍＬ，分别取１０ ｍｌ菌液于培 养皿中加磁力棒，将平皿放置于诱变箱内磁力搅拌器 上，分别打开培养皿盖，边搅拌边进行紫外辐照诱变， 辐照时间分别确定为１５ｓ、３０ｓ、４５ｓ、６０ｓ、７５ｓ、９０ｓ，照射 收稿日期：２０１０－０３－２５ 作者简介：姚小飞（１９７９￣），女，硕士，讲师，从事应用微生物学教学和研究。
枯草芽孢杆菌的代谢特性与生物活性成分探究
枯草芽孢杆菌的代谢特性与生物活性成分探究
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，被广泛应用于食品工业、农业以及生物药物研发等领域。本文将探究枯草芽孢杆菌的代谢特性和生物活性成分，以及它们在不同领域中的应用。
枯草芽孢杆菌具有多样化的代谢途径和生理活动。首先，它是一种革兰氏阳性细菌，具有氧化代谢和发酵代谢的能力。通过氧化代谢，枯草芽孢杆菌可以利用底物产生能量和二氧化碳。而在发酵过程中，它可以将底物转化为有机酸、醇类和气体等产物。这种多样的代谢特性使得枯草芽孢杆菌能够适应各种不同的环境条件。
枯草芽孢杆菌还具有丰富的生物活性成分。首先，它产生一种称为枯草芽孢杆菌素（Bacillomycin）的抗生素。这种抗生素具有广谱的抗菌活性，可以抑制多种细菌、真菌和病毒的生长。此外，枯草芽孢杆菌还可以产生抗氧化物质、生物活性肽和酶等生物活性成分。这些成分可以具有抗氧化、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等活性，对人类健康具有潜在的益处。
枯草芽孢杆菌在食品工业中的应用主要体现在食品保鲜和防腐方面。由于它具有广谱的抗菌活性，可以抑制食品中的病原菌和腐败菌的生长，延长食品的保质期。同时，枯草芽孢杆菌也可以提高食品的营养价值，例如通过发酵作用将底物转化为有益的代谢产物，如有机酸和酶等。这种应用可以提高食品的品质和市场竞争力。
此外，枯草芽孢杆菌还在农业领域中发挥着重要的作用。它可以作为一种生物农药，用于防治农作物病虫害。通过喷施或根际处理，枯草芽孢杆菌可以抑制病原菌和昆虫的生长，减少农药的使用，降低对环境的污染，同时保护农作物的生长和产量。此外，枯草芽孢杆菌还可以促进植物的生长和养分吸收，提高农作物的产量和品质。 在生物药物研发领域，枯草芽孢杆菌被广泛应用于产蛋白和合成药物等方面。它可以用作一种重要的工具菌，通过转基因技术将目标基因导入枯草芽孢杆菌中，使其表达目标蛋白或合成目标药物。由于枯草芽孢杆菌具有较高的细胞密度和生长速度，能够快速产生大量的目标蛋白或药物，因此被广泛应用于生物药物产业中。