固态发酵技术的研究进展_戴超
固态混菌发酵产纤维素酶的研究进展
固态混菌发酵产纤维素酶的研究进展罗永生;常春【摘要】纤维乙醇是目前可再生能源领域中的研究热点,而如何提高纤维素酶活性、降低生产成本是纤维乙醇发展的关键.介绍了固态混菌发酵的最新研究进展,并对纤维素酶混菌发酵存在的问题进行了分析和展望.【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2010(000)001【总页数】5页(P78-82)【关键词】燃料乙醇;纤维素酶;固态发酵;混菌发酵【作者】罗永生;常春【作者单位】郑州大学化工学院,河南,郑州,450001;郑州大学化工学院,河南,郑州,450001【正文语种】中文【中图分类】TS262.2;Q55;TQ925纤维素类物质是自然界中最廉价、最丰富的一类可再生资源。
全世界的植物体生成量每年高达1500亿t干物质, 其中全球的秸秆年产量超过20亿t。
如果将天然纤维素降解为可利用的糖类物质,再进一步转化为乙醇、菌体蛋白、气体燃料(如氢气)等物质,对解决当今世界所面临的环境污染、粮食短缺、饲料资源紧张和能源危机等问题具有重大现实意义[1]。
纤维素酶是降解纤维素最有效的生物催化剂，自然界存在很多产纤维素酶的生物。
多年以来，为了提高酶活、降低成本，人们在菌种选育、发酵工艺方面开展了大量的工作。
近年来，利用微生态原理，采用多菌种的混菌发酵工艺引起人们的重视，该方法被证明能够有效地提高纤维素酶活力,国内外学者加大了对其研究的力度[2-4]。
本文在此介绍固态混菌发酵技术生产纤维素酶方面的最新研究进展。
纤维素酶是能将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称，它是多酶组分的一个复杂酶体系。
根据各酶在功能上的差异可分为3类。
葡聚糖内切酶(endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.4)来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Len，又称为C1酶。
这类酶作用于纤维素分子非定形区，无规则水解β-1,4糖苷键，形成葡萄糖、纤维二糖和不同大小的纤维糊精，为纤维二糖水解酶提供更多的可供水解的末端，其分子量大小为23～146 KD。
固态发酵技术:从传统酿造到现代生物发酵产业的应用
固态发酵技术：从传统酿造到现代生物发酵产业的应用陈洪章;王岚【期刊名称】《生物产业技术》【年(卷),期】2018(000)003【总页数】1页(P封2)【作者】陈洪章;王岚【作者单位】中国科学院过程工程研究所;中国科学院过程工程研究所【正文语种】中文陈洪章中国科学院过程工程研究所研究员王岚中国科学院过程工程研究所研究员固态发酵是以气相为连续相，以液膜及其覆盖的固相为固定相的三相系统。
其因节水、节能、环境友好等独特优势而受到学术界和工业界的高度关注。
固态发酵在我国食品酿造中具有悠久的历史，其应用领域已逐步扩展到医药化工、能源等领域。
其大规模应用于现代工业生产中，使得经济、资源、环境更加协调，符合可持续发展的要求，将成为绿色生物制造的重要组成部分。
固态发酵含水量少的体系特征及固相基质复杂的理化特点造成了固态发酵难以满足现代生物发酵产业的要求，分析原因如下。
①微生物在固相基质中的生长受限于颗粒表面水分张力，主要集中在孔隙和边缘的液膜内。
大孔虽然能够保证充足的氧气供给，但较大的空间位阻也会阻碍菌体与营养物质的接触。
小颗粒基质具有较小的空间位阻，易于菌体与营养的充分接触，却影响氧气在孔隙中的扩散。
因此，固相基质的选择必须力求实现供氧和提供微生物生长间的平衡。
②固相基质只有溶解于水膜内的部分才能为微生物利用，导致固态发酵中营养的可及性劣于液态发酵。
③固态发酵底物多为复杂的天然生物质原料，基质本身颗粒尺寸、持水性、导热性等方面的不均一性，使得菌体的代谢产物浓度、温度、pH等参数难以在线检测。
因此，基质结构引起的传质传热困难是制约固态发酵发展的根本原因。
固相基质是微生物生长和代谢产物生成的物质基础并提供微生物生长的必要空间，明确固相基质物性将在极大程度上提高固态发酵效率。
固态发酵体系内低效的质热传递过程严重制约微生物生长代谢过程，建立相应的模型有助于了解固相体系下微生物生长代谢规律，从而针对性地强化质热传递过程，改善发酵效率。
餐厨垃圾干式厌氧发酵技术研究进展及展望
第贮卷第2期
2022年2
月
现代化工Modern (Chemical Industry
“生活垃圾处理及资源化”
专题报道导读
2000年住房和城乡建设部将北京、上海、广卅、深圳、杭州、南京
、厦门、桂林等8个城市选定为“
生活垃圾分
类收集试点城市”，以探索有关垃圾处理的政策、技术和方法。经过20年的发展，我国的生活■垃圾治理走过了一
条“从无到有”、从“末端处理”到“源头分类控制”到“综合治理”的道路a2021年5月6日，
国家发展改革委、
住房城乡建设部发布了《“十四五”城镇生活垃圾分类和处理设施发展
规划》，规划提出目标：到2025年底，全国城市生活垃圾资源化利用率达到60%左右；
全国生活■垃圾分类收运能
力达到70万t/d左右；全国城镇生活垃圾焚烧处理能力达到80万t/d左右，城市生活■垃圾焚烧处理能力占比
65%左右。国内垃圾处理产业发展方兴未艾，技术革新对于生活垃圾治理实现无害化、减量化、资源化和产业化
至关重要a
-----本刊编辑部
餐厨垃圾干式厌氧发酵技术研究进展及展望秦丞志J张 奇
2,赵建伟“，袁庆江J孙英杰'
(1.青岛市固体废物污染控制与资源化工程研究中心，青岛理工大学环境与市政工程学院，
山东青岛266033； 2.青岛市固体废弃物处置有限责任公司，山东青岛
266041)
摘要:总结了餐厨垃圾干式厌氧发酵的关键影响因素(温度、pH、含固率、有机负荷、含盐量和含油量
、
C/N、氨氮、挥发性脂
肪酸)，概述了强化餐厨垃圾干式厌氧发酵的主要策略(外源添加剂、预处理、接种物、共发酵)。对餐厨垃圾干式厌氧发酵的发 展方向提岀了展望及建议。关键词：餐厨垃圾;干式发酵;含固率;强化策略
中图分类号:X705 文献标志码:A
文章编号:0253-4320( 2022)02-0001-05
D01：10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2022.02.001
Research progress and prospect
纳豆激酶固态发酵工艺及纳豆冻干粉制备的研究
Supervisor: Researcher Shi Yanmao Senior Engineer Dong Chao
May 2013
This work is supported by Science and Technology Research and Development Program of Hebei Province. NO.11275508D.
分类号： UD C ：
密级： 编号：
河北工业大学硕士学位论文
纳豆激酶固态发酵工艺及纳豆 冻干粉制备的研究
论 文 作 者： 学 科 门 类： 指 导 教 师：
田智斌 工 学
学 生 类 别： 全 日 制 学 科 专 业： 生物化工 职 称： 研 究 员 高级工程师
史延茂 董 超
资助基金项目：河北省科技支撑计划资助项目（NO.11275508D）
关键词：纳豆激酶，固态发酵，工艺优化，纳豆冻干粉，储存稳定性
I
纳豆激酶固态发酵工艺及纳豆冻干粉制备的研究
ABSTRACT
Nattokinase is a fibrinolytic serine enzyme that is produced by Bacillus subtillis natto. It has safe and effective, long half- life in the body, no bleeding tendency and so on. So nattokinase can be developed as a new fibrinolytic medicine. However, the liquid fermentation mode and the downstream separation technology for production of nattokinase by most factories at present, and lower production capacity at the laboratory level. In recent years, the solid-state fermentation production mode in the development of enzyme preparation that make production of nattokinase has a realistic significance. Screening of high nattokinase yield for the solid-state fermentation strain. On the basis of single factor experiment, response surface methodology and artificial neural network coupling genetic algorithm were used for optimizing solid-state fermentation process parameters of nattokinase, and the optimization effects of the two methods were estimated. The results showed the best conditions were as following: inoculum size 4%, initial water amount 55%, soybean content 90g/250mL, fermentation temperature 36.09 ℃, sucrose concentration 1.5%, MgSO 4 · 7H2 O concentration 0.21%, CaCl2 concentration 0.27%, fermentation time 24h. Under these conditions, the maximum nattokinase activity was up to 7 631.28 U/g, which was 29.02% higher than that in single factor test. Adopt vacuum freeze drying technology for producing natto power, against natto power producing in the production of freeze drying and crushing methods. The influence of the research work was for optimizing producing natto power production process and development to provide the choice of dosage form technical support. At the same time, the changes of nattokinase were determined in simulated gastrointestinal environment, and its main components and bioactive substances were determined. It found that the two aspects of nutrition and bioactive substances content higher than soybean powder raw materials through the analysis, so the freeze-dried natto power producing can be used as a potential health care products for development. Freeze-dried natto power in pharmaceutical producing active substances of the storage stability was studied which used accelerated storage stability determination method. The results showed that the international degree of predicted value and experimental value was higher at 4℃ and room temperature, so the method had certain practicability and accuracy , at the same experimental time was shortened.
绿色发酵技术及其应用于酿造工业的研究进展
绿色发酵技术及其应用于酿造工业的研究进展随着全球环境保护意识的不断提高，绿色发酵技术逐渐得到人们的关注和认可。
绿色发酵技术是指在保持良好发酵效果的同时，尽可能减少或消除酿造过程中对环境的污染。
近年来，绿色发酵技术在酿造工业中的应用越来越广泛，本文将对其研究进展进行探讨。
一、绿色发酵技术的研究现状绿色发酵技术是酿造工艺绿色化的有效途径之一。
在绿色发酵技术中，选择合适的微生物菌种，运用优化发酵参数和新型发酵辅料等手段，可以提高酿造效率、提高工艺稳定性以及提高工艺产率。
目前，绿色发酵技术在酿造酸奶、酸豆腐等乳品以及啤酒、白酒、黄酒等酒类制造中的应用正在逐渐得到推广和普及。
（一）绿色发酵技术在酸奶制造中的应用酸奶是由乳酸菌发酵牛奶而成的乳制品，因其有利于消化和改善健康而备受消费者青睐。
在传统的酸奶酿造工艺中，常规使用的发酵剂为传统混合革兰氏阳性乳酸菌。
随着生态环境的变化和消费者对食品品质追求的提高，对于酸奶的绿色生产也提出了更高的要求。
目前，国内外大量研究人员已经开始采用生态菌的发酵技术，通过生态菌代替传统混合革兰氏阳性乳酸菌，进一步实现酸奶生产的绿色化。
同时，在酿造工艺中添加油酸钙、太空植物酪氨酸酶等成分，能够提高酸奶的营养价值和口感。
（二）绿色发酵技术在酿造黄酒中的应用黄酒是一种古老的传统发酵酒，因其微生物发酵过程对环境没有大量污染而备受青睐。
传统的黄酒生产中，常采用传统发酵工艺和传统菌种，而绿色发酵技术则引入新型发酵菌株和新型发酵辅料，从而实现在不影响其品质的情况下更加绿色化。
新型发酵菌株的应用可以提高黄酒的口感、风味和营养价值，同时新型发酵辅料的运用则可以对黄酒发酵过程进行控制，优化发酵条件。
例如，在黄酒的发酵中添加固态培养发酵粉料、糠床等，可以改善黄酒的品质和口感，并且减少污染物的排放。
二、绿色发酵技术在酿造工业中的应用前景绿色发酵技术的应用前景非常广阔，将成为酿造工业可持续发展的主要方向之一。
豆粕微生物固态发酵工艺优化及其营养物质含量变化
动物营养学报２０１８，３０（７）：２７４９⁃２７６２ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ㊀ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１８．０７．０３６豆粕微生物固态发酵工艺优化及其营养物质含量变化吝常华㊀刘国华㊀常文环㊀张㊀姝㊀郑爱娟㊀邓雪娟㊀蔡辉益∗（中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点开放实验室，生物饲料开发国家工程研究中心，北京１０００８１）摘㊀要：本试验以小肽含量为指标，对解淀粉芽孢杆菌单菌固态发酵豆粕以及解淀粉芽孢杆菌㊁植物乳杆菌和酿酒酵母菌３个菌种混菌固态发酵豆粕的工艺条件进行优化，并对其发酵前后的营养物质含量变化进行研究㊂通过解淀粉芽孢杆菌㊁植物乳杆菌和酿酒酵母３个试验菌的生长曲线确定其接种到固态培养基的最佳接种时间㊂采用单因素试验设计研究解淀粉芽孢杆菌接种量㊁温度㊁料水比㊁发酵时间４个因素对豆粕发酵产小肽的影响，并在此基础上采用四因素三水平的正交试验设计对单㊁混菌固态发酵豆粕的工艺条件进行优化㊂对豆粕发酵前后豆粕营养物质含量㊁大豆球蛋白含量㊁蛋白质分子质量㊁发酵产物ｐＨ进行测定㊂结果显示：３株试验菌接在各自种子培养基扩大培养至２１ｈ为其接种到固态培养基的最佳时间㊂解淀粉芽孢杆菌单菌固态发酵豆粕的最佳工艺条件为：接种量为１０％㊁温度为４０ħ㊁料水比为１．０ʒ１．２㊁发酵时间为７２ｈ；解淀粉芽孢杆菌㊁植物乳杆菌㊁酿酒酵母混菌固态发酵豆粕的最佳工艺条件为：接种量为１５％㊁温度为３１ħ㊁料水比为１．０ʒ１．０发酵时间为１２０ｈ，３个菌株的接种比例为：解淀粉芽孢杆菌ʒ植物乳杆菌ʒ酿酒酵母＝９ʒ３ʒ２㊂经微生物发酵后，发酵产物中小肽㊁粗蛋白质㊁粗灰分㊁粗脂肪含量较发酵前均得到显著提高（Ｐ＜０．０５），粗纤维含量则显著下降（Ｐ＜０．０５）；单菌发酵组和混菌发酵组发酵产物中大豆球蛋白含量均较未发酵组显著降低（Ｐ＜０．０５）；单菌发酵组和混菌发酵组发酵产物中蛋白质分子质量较未发酵组降低；混菌发酵组发酵产物的ｐＨ较未发酵组显著降低（Ｐ＜０．０５），而单菌发酵组发酵产物的ｐＨ则与未发酵组差异不显著（Ｐ＞０．０５）㊂综上所述，豆粕经微生物固态发酵后营养价值在一定程度上得到改善，大分子蛋白质被降解，ｐＨ也发生了变化，并且单菌发酵和混菌发酵的效果存在差异㊂关键词：豆粕；单菌；混菌；发酵；工艺优化；营养物质中图分类号：Ｓ６６５．４㊀㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０１８）０７⁃２７４９⁃１４收稿日期：２０１７－１２－１５基金项目：国家肉鸡产业技术体系（ＣＡＲＳ⁃４１）作者简介：吝常华（１９９０ ），女，河南安阳人，硕士研究生，从事家禽营养研究㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：１３５３３７１２８０＠ｑｑ．ｃｏｍ∗通信作者：蔡辉益，研究员，博士生导师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｃａｉｈｕｉｙｉ＠ｃａａｓ．ｃｎ㊀㊀豆粕作为我国重要的植物性蛋白质原料，与其他植物性蛋白质原料（棉籽粕㊁菜籽粕㊁花生粕等）相比具有氨基酸组成合理㊁消化利用率高㊁适口性好的特点［１］，与鱼粉等动物性蛋白质饲料相比具有资源较为充足㊁价格相对低廉㊁不易氧化腐败㊁安全系数高等优点［２］㊂但是，我国作为一个畜牧生产大国，豆粕资源的供需矛盾依然突出，同时豆粕中含有大豆球蛋白㊁胰蛋白酶抑制剂㊁植酸等抗营养因子［３］，其中大豆球蛋白占总蛋白质的４０％［４］，是大豆中含量最高的一种球蛋白，同时也是热稳定性最强的抗原蛋白之一，是引起动物过敏反应和腹泻的主要成分，其不仅限制了豆粕在饲粮中的使用，而且对畜禽危害较为严重㊂因此，充分利用现有豆粕资源，采取一定的技术途径提㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷高豆粕饲用价值具有重要意义㊂近年来，人们对微生物（主要是有益菌）发酵技术的关注度日益提高，并积极探索发掘菌种资源用于饲料的发酵生产，其中解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ⁃ｃｉｅｎｓ）作为一种益生菌，具有繁殖速度快，稳定性好，生命力强［５］，富含淀粉酶㊁蛋白酶㊁纤维素酶的特点［６－９］，在固态发酵豆粕的应用研究中取得了较好的效果［１０－１２］㊂有关微生物发酵豆粕工艺参数的研究报道虽然较多，但是目前对于菌种资源和发酵工艺依然有严格的衡量标准，且微生物单独发酵和混菌发酵豆粕对比研究较少㊂因此，本试验拟分别优化解淀粉芽孢杆菌单菌及其在植物乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）和酿酒酵母菌（Ｓａｃ⁃ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）的协同下混菌发酵豆粕的工艺参数，并对豆粕发酵前后的理化性质进行分析比较，为发酵豆粕菌种的选择和发酵工艺的优化提供科学依据㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验材料与菌种㊀㊀豆粕和麸皮：由中国农业科学院饲料研究所昌平南口基地提供，粉碎过４０目筛㊂㊀㊀无菌水：蒸馏水分装，１２１ħ灭菌２０ｍｉｎ㊂㊀㊀解淀粉芽孢杆菌：为本实验室分离筛选所得㊂㊀㊀植物乳杆菌：购自中国普通微生物菌种管理保藏中心，保藏编号为１．５５７㊂㊀㊀酿酒酵母菌：购自中国普通微生物菌种管理保藏中心，保藏编号为２．３８８㊂１．２㊀培养基１．２．１㊀液体种子培养基㊀㊀ＬＢ培养基：氯化钠１０．０ｇ㊁蛋白胨１０．０ｇ㊁酵母粉５．０ｇ，蒸馏水定容至１０００ｍＬ，调ｐＨ至７．４，１２１ħ灭菌２０ｍｉｎ㊂㊀㊀ＭＲＳ培养基：葡萄糖２０．０ｇ㊁蛋白胨１０．０ｇ㊁牛肉膏８．０ｇ㊁酵母膏４．０ｇ㊁硫酸镁０．５ｇ㊁硫酸锰０．３ｇ㊁柠檬酸铵２．０ｇ㊁乙酸钠５．０ｇ㊁吐温－８０１．０ｍＬ，蒸馏水定容至１０００ｍＬ，调ｐＨ至６．２ ６．６，１２１ħ灭菌２０ｍｉｎ㊂㊀㊀ＹＰＤ培养基：葡萄糖２０．０ｇ㊁蛋白胨１０．０ｇ㊁酵母粉５．０ｇ，蒸馏水定容至１０００ｍＬ，自然ｐＨ，１２１ħ灭菌２０ｍｉｎ㊂１．２．２㊀斜面培养基㊀㊀在各个液体种子培养基的基础上添加２０．０ｇ琼脂糖㊂１．２．３㊀固体发酵培养基㊀㊀豆粕４５．０ｇ㊁麸皮５．０ｇ，灭菌水适量，自然ｐＨ㊂１．３㊀试验方法１．３．１㊀发酵种子液的制备㊀㊀首先用接种环从解淀粉芽孢杆菌㊁植物乳杆菌和酿酒酵母菌斜面培养基上分别接１环于各菌种的液体种子培养基中，依次为ＬＢ培养基㊁ＭＲＳ培养基和ＹＰＤ培养基，将解淀粉芽孢杆菌置于３７ħ㊁１８０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养，酿酒酵母菌置于３０ħ㊁１８０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养，植物乳杆菌置于３０ħ静置培养，３个菌种均培养４８ｈ㊂然后，将上述培养好的菌液按１％的接种量接种到各菌种液体种子培养基中进行扩大培养２４ｈ，制成发酵种子液㊂１．３．２㊀各菌种生长曲线的测定及接种时间的确定㊀㊀采用分光光度计比浊法［１３］，用已经灭菌的未接种各菌种的液体种子培养基作为空白对照，取各自相应培养条件下培养０㊁３㊁６㊁９㊁１２㊁１５㊁１８㊁２１㊁２４㊁２７㊁３０㊁３３㊁３６㊁３９㊁４２㊁４５㊁４８ｈ时的３个菌种，分别测定６００ｎｍ处的吸光度值，以培养时间为横坐标，以相应菌液的吸光度值为纵坐标绘制生长曲线㊂选择各菌种处于对数生长期时的菌液接种到固体发酵培养基中，此时菌体活力最强，生长最旺盛［１４］㊂１．３．３㊀固态发酵方法㊀㊀将固体发酵培养基分装于２５０ｍＬ三角瓶中，将培养好的发酵种子液按一定的接种量接种到含豆粕的固态发酵培养基中，搅拌均匀，静置发酵㊂１．３．４㊀单菌发酵豆粕试验设计１．３．４．１㊀单因素试验㊀㊀以接种量（Ａ）㊁温度（Ｂ）㊁料水比（Ｃ）和发酵时间（Ｄ）这４个因素为研究对象进行单因素试验，以发酵产物中小肽含量为指标，研究单一因素对解淀粉芽孢杆菌发酵豆粕产小肽的影响㊂１．３．４．２㊀单菌发酵豆粕工艺条件的优化㊀㊀为了获得解淀粉芽孢杆菌单菌发酵豆粕的最佳发酵工艺，在单因素试验的基础上，以发酵产物小肽含量为指标，采用四因素三水平Ｌ９（３４）的正交试验对发酵工艺进行优化，每个水平设３个重复㊂优化单菌发酵豆粕工艺条件的正交试验设计见表１㊂０５７２７期吝常华等：豆粕微生物固态发酵工艺优化及其营养物质含量变化表１㊀优化单菌发酵豆粕工艺条件的正交试验设计Ｔａｂｌｅ１㊀Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｄｅｓｉｇｎｏｆｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ水平Ｌｅｖｅｌｓ因素Ｆａｃｔｏｒｓ接种量Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｙ（Ａ）／％温度Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）／ħ料水比Ｆｅｅｄʒｗａｔｅｒ（Ｃ）发酵时间Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ（Ｄ）／ｈ１５３０１．０ʒ０．８４８２１０３５１．０ʒ１．０７２３１５４０１．０ʒ１．２９６１．３．５㊀混菌发酵豆粕试验设计１．３．５．１㊀混菌发酵豆粕菌种比例优化㊀㊀采用Ｌ９（３４）正交试验设计，将３个菌种按３个接种量进行三因素三水平正交试验，每个水平设３个重复㊂在温度３４ħ㊁料水比１．０ʒ１．０㊁自然ｐＨ条件下发酵４８ｈ，以发酵产物小肽含量为指标，确定混菌发酵豆粕时３个菌种的最佳接种比例㊂优化混菌发酵豆粕菌种比例的正交试验设计如表２所示㊂表２㊀优化混菌发酵豆粕菌种比例的正交试验设计Ｔａｂｌｅ２㊀Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｄｅｓｉｇｎｏｆｓｔｒａｉｎｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｍｉｘｅｄｓｔｒａｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ％水平Ｌｅｖｅｌｓ因素Ｆａｃｔｏｒｓ解淀粉芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（Ａ）植物乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ（Ｂ）酿酒酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｃ）１３１１２６２２３９３３１．３．５．２㊀混菌发酵豆粕工艺条件的优化㊀㊀在确定３个菌种最佳接种比例的基础上，采用Ｌ１６（４４）正交试验设计，将混菌发酵豆粕的接种量（Ａ）㊁温度（Ｂ）㊁料水比（Ｃ）㊁时间（Ｄ）４个因素进行优化，每个因素设４个水平，每个水平设３个重复，进行四因素四水平的正交试验㊂优化混菌发酵豆粕工艺条件的正交试验设计如表３所示㊂表３㊀优化混菌发酵豆粕工艺条件的正交试验设计Ｔａｂｌｅ３㊀Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｄｅｓｉｇｎｏｆｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｍｉｘｅｄｓｔｒａｉｎｓｆｅｒｍｅｎｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ水平Ｌｅｖｅｌｓ因素Ｆａｃｔｏｒｓ接种量Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｙ（Ａ）／％温度Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）／ħ料水比ʒＦｅｅｄʒｗａｔｅｒ（Ｃ）发酵时间Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ（Ｄ）／ｈ１６３１１．０ʒ０．６４８２９３４１．０ʒ０．８７２３１２３７１．０ʒ１．０９６４１５４０１．０ʒ１．２１０８１．４㊀测定指标与方法㊀㊀发酵结束后，将产物置于５０ħ烘箱中烘至恒重，放于室内回潮２４ｈ，然后粉粹过６０目筛，进行指标的测定㊂１．４．１㊀小肽及常规营养成分含量的测定㊀㊀小肽含量：参照轻工行业标准‘大豆肽粉“（ＱＢ／Ｔ２６５３ ２００４）中方法进行测定㊂㊀㊀粗蛋白质含量：参照国家标准‘饲料中粗蛋白测定方法“（ＧＢ／Ｔ６４３２ １９９４）中方法进行测定㊂１５７２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷㊀㊀粗纤维含量：参照国家标准‘饲料中粗纤维的含量测定过滤法“（ＧＢ／Ｔ６４３４ ２００６）中方法进行测定㊂㊀㊀粗灰分含量：参照国家标准‘饲料中粗灰分的测定“（ＧＢ／Ｔ６４３８ ２００７）中方法进行测定㊂㊀㊀粗脂肪含量：参照国家标准‘饲料中粗脂肪的测定“（ＧＢ／Ｔ６４３３ ２００６）中方法进行测定㊂１．４．２㊀蛋白质分子质量的测定㊀㊀采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ）法［１５］测定蛋白质分子质量：称取粉碎过６０目筛的豆粕１．０００ｇ，用０．１ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ＝８．０）浸提１ｈ，３０００ˑｇ㊁４ħ离心１０ｍｉｎ，取上清液置于４ħ冰箱保存待用㊂电泳时采用５％浓缩胶㊁１５％的分离胶，每条泳道加２０μＬ上清液，２０ｍＡ㊁８０Ｖ恒流电泳２ｈ后，考马斯亮蓝染色观察㊂１．４．３㊀大豆球蛋白含量的测定㊀㊀采用大豆球蛋白检测试剂盒进行大豆球蛋白含量的测定，其主要是利用间接竞争的方法，样品中的大豆球蛋白与试剂盒中预包被的抗原竞争大豆球蛋白抗体，然后加入酶标二抗后，３，３ᶄ，５，５ᶄ－四甲基联苯胺（ＴＭＢ）底物显色，使得样品吸光度值与其所含大豆球蛋白的含量呈负相关，因此可通过酶标仪检测吸光度值，并与标准曲线比较得出样品中大豆球蛋白的含量㊂１．４．４㊀发酵豆粕产物干样ｐＨ的测定㊀㊀称取３．０００ｇ发酵豆粕干样，加入３０．０ｍＬ的蒸馏水，搅拌均匀，４ħ静置６ｈ，过滤，用ｐＨ计测定上清液的ｐＨ㊂１．５㊀数据统计与分析㊀㊀试验数据用Ｅｘｃｅｌ２０１６进行初步处理后，采用ＳＰＳＳ１９．０软件进行统计分析㊂其中正交试验数据采用一般线性模型单变量进行极差与方差分析，其他采用单因素方差分析，检验组间差异显著性，并采用Ｄｕｎｃａｎ氏法进行多重比较，结果以 平均值ʃ标准差 表示，显著性水平为Ｐ＜０．０５㊂２㊀结果与分析２．１㊀试验菌种生长曲线的测定结果及接种时间的确定２．１．１㊀解淀粉芽孢杆菌生长曲线㊀㊀由图１可以看出，解淀粉芽孢杆菌在３７ħ恒温培养３３ｈ时，生长达到最旺盛期，且在１８ ２４ｈ这个时间段快速增长，拟为对数生长期㊂图１㊀解淀粉芽孢杆菌生长曲线Ｆｉｇ．１㊀ＧｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ２．１．２㊀植物乳杆菌生长曲线㊀㊀由图２可以看出，植物乳杆菌在３０ħ恒温培养时，在３ ２１ｈ内快速生长繁殖，在２７ｈ时达到峰值，且于此后生长缓慢，在３０ｈ后生长速度开始下降㊂图２㊀植物乳杆菌生长曲线Ｆｉｇ．２㊀ＧｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ２．１．３㊀酿酒酵母菌生长曲线㊀㊀由图３可以看出，酿酒酵母菌在３０ħ恒温培养时，前２４ｈ生长速度较快，在２７ｈ时生长达到峰值，而此后生长进入相对稳定期㊂２．１．４㊀试验菌种接种时间的确定㊀㊀为便于比较发酵所用各菌种的生长周期，将各菌种生长曲线置于同一图（图４）中㊂由图４可以看出，植物乳杆菌生长较为迅速，在２１ｈ后即进入稳定期，而解淀粉芽孢杆菌和酿酒酵母菌的生长周期相对较长，分别在２７和２４ｈ后进入稳定期㊂为便于统一试验步骤㊁简化混菌发酵操作，选择培养２１ｈ时作为３个菌种的接种时间，且此时各菌种均处于生长对数期，菌株呈几何对数速度生长，菌体活力强，能保证其在接种到固体培养基２５７２７期吝常华等：豆粕微生物固态发酵工艺优化及其营养物质含量变化后迅速生长㊂图３㊀酿酒酵母菌生长曲线Ｆｉｇ．３㊀ＧｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ图４㊀３个试验菌种的生长曲线Ｆｉｇ．４㊀Ｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｓｏｆｔｈｒｅｅｔｅｓｔｓｔｒａｉｎｓ２．２㊀单因素试验结果２．２．１㊀接种量对小肽含量的影响㊀㊀由图５可知，在料水比为１．０ʒ１．０㊁温度为３５ħ㊁发酵时间为７２ｈ的条件下进行发酵时，不同接种量对发酵效果产生了不同的影响㊂菌种接种量为０时，产物中小肽含量为１．１１％，显著低于其他４个接种量（Ｐ＜０．０５）；随着接种量的增加，发酵产物中小肽含量先增加后降低，当接种量为１０％时，发酵产物中小肽含量达到最高值，为１１．１４％；当接种量为１５％和２０％时，发酵产物中小肽含量相同㊂２．２．２㊀料水比对小肽含量的影响㊀㊀由图６可知，在接种量为１０％㊁发酵温度为３５ħ㊁发酵时间为７２ｈ的条件下进行发酵时，不同料水比对发酵效果产生了不同的影响㊂料水比为１．０ʒ０．４时，发酵产物中小肽含量为５．７１％，显著低于其他４个料水比（Ｐ＜０．０５）；随着含水量的增加，发酵产物中小肽含量先逐渐增加，当料水比达到１．０ʒ０．８时，发酵产物中小肽含量达到最高，为１１．５７％；其后，随着含水量的继续增加，发酵产物中小肽含量开始呈现下降趋势㊂㊀㊀数据肩标不同小写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５），相同小写字母表示差异不显著（Ｐ＞０．０５）㊂图６至图８同㊂㊀㊀Ｖａｌｕｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｓｉｇ⁃ｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｌｅｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｓｍａｌｌｌｅｔ⁃ｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）．ＴｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．６ｔｏＦｉｇ．８．图５㊀接种量对小肽含量的影响Ｆｉｇ．５㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎａｍｏｕｎｔｏｎｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ图６㊀料水比对小肽含量的影响Ｆｉｇ．６㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆｅｅｄʒｗａｔｅｒｏｎｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ２．２．３㊀温度对小肽含量的影响㊀㊀由图７可知，接种量为１０％㊁料水比为１．０ʒ１．０㊁发酵时间为７２ｈ的条件下进行发酵时，不同发酵温度对发酵效果产生了不同的影响㊂温度为４５ħ时，发酵产物中小肽含量最低，为６．５４％，显著低于其他４个温度（Ｐ＜０．０５）；温度为３０ħ时，发酵产物中小肽含量达到最高值，为１１．０６％，但在２５㊁３０㊁３５㊁４０ħ条件下，发酵产物中小肽含量无显著差异（Ｐ＞０．０５）㊂２．２．４㊀发酵时间对小肽含量的影响㊀㊀由图８可知，在接种量为１０％㊁料水比为１ʒ１㊁温度为３５ħ的条件下进行发酵时，不同发酵时间对发酵效果产生了不同的影响㊂发酵时间为２４ｈ３５７２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷时，发酵产物中小肽含量为６．３０％，显著低于其他４个发酵时间（Ｐ＜０．０５）；发酵时间为７２ｈ时，发酵产物中多肽含量达到最高值，为１０．３７％，但与发酵时间为４８㊁９６㊁１２０ｈ时无显著差异（Ｐ＞０．０５）㊂图７㊀温度对小肽含量的影响Ｆｉｇ．７㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ图８㊀发酵时间对小肽含量的影响Ｆｉｇ．８㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ２．３㊀单菌发酵豆粕工艺条件优化的试验结果㊀㊀由表４中正交试验结果的极差（Ｒ）值分析可以看出，４个因素对发酵豆粕产小肽的影响程度为Ｂ＞Ｄ＞Ｃ＞Ａ，即温度对发酵效果的影响最大，发酵时间其次，料水比和接种量对发酵效果的影响较小㊂接种量对发酵产物中多肽含量的影响最小，所以将此项作为误差项进行方差分析㊂进一步的方差分析结果（表５）显示，温度和发酵时间对发酵产物中小肽含量有显著的影响（Ｐ＜０．０５）㊂结合ｋ值大小分析可得，解淀粉芽孢杆菌固态发酵豆粕工艺条件的最佳组合为Ａ２Ｂ３Ｃ３Ｄ２，即在接种量为１０％㊁温度为４０ħ㊁料水比为１．０ʒ１．２㊁发酵时间为７２ｈ时，发酵效果最优㊂２．４㊀混菌发酵豆粕的试验结果２．４．１㊀混菌发酵豆粕菌种比例优化结果㊀㊀由表６中正交试验结果的Ｒ值分析可以看出，３个菌种对发酵豆粕产小肽的影响程度为Ａ＞Ｂ＞Ｃ，即解淀粉芽孢杆菌对发酵效果影响最大，其次是植物乳杆菌，酿酒酵母菌对发酵效果的影响最小㊂进一步的方差分析结果（表７）显示，３个菌种对发酵产物中小肽含量均没有显著影响（Ｐ＞０．０５）㊂因此，此次试验中解淀粉芽孢杆菌㊁植物乳杆菌和酿酒酵母混合发酵豆粕接种比例的最佳组合为Ａ３Ｂ３Ｃ２，即解淀粉芽孢杆菌ʒ植物乳杆菌ʒ酿酒酵母菌＝９ʒ３ʒ２㊂表４㊀单菌发酵豆粕正交试验结果Ｔａｂｌｅ４㊀Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ试验号ＴｅｓｔＮｏ．因素Ｆａｃｔｏｒｓ接种量Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｙ（Ａ）／％温度Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）／ħ料水比Ｆｅｅｄʒｗａｔｅｒ（Ｃ）发酵时间Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ（Ｄ）／ｈ小肽含量Ｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ／％１５（１）３０（１）１．０ʒ０．８（１）４８（１）４．７０２５（１）３５（２）１．０ʒ１．０（２）７２（２）８．９８３５（１）４０（３）１．０ʒ１．２（３）９６（３）１１．４９４１０（２）３０（１）１．０ʒ１．０（２）９６（３）６．７４５１０（２）３５（２）１．０ʒ１．２（３）４８（１）８．４２６１０（２）４０（３）１．０ʒ０．８（１）７２（２）１１．３３７１５（３）３０（１）１．０ʒ１．２（３）７２（２）８．３９８１５（３）３５（２）１．０ʒ０．８（１）９６（３）８．６５９１５（３）４０（３）１．０ʒ１．０（２）４８（１）９．０３Ｋ１２５．１７１９．８３２４．６８２２．１５４５７２７期吝常华等：豆粕微生物固态发酵工艺优化及其营养物质含量变化续表４试验号ＴｅｓｔＮｏ．因素Ｆａｃｔｏｒｓ接种量Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｙ（Ａ）／％温度Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）／ħ料水比Ｆｅｅｄʒｗａｔｅｒ（Ｃ）发酵时间Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ（Ｄ）／ｈ小肽含量Ｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ／％Ｋ２２６．４９２６．０５２４．７５２８．７０Ｋ３２６．０７３１．８５２８．３２６．８８ｋ１８．３９６．６１８．２３７．３８ｋ２８．８３８．６８８．２５９．５７ｋ３８．６９１０．６２９．４３８．９６极差Ｒ０．４４４．０１１．２０２．１９因素主次ＰｒｉｍａｒｙａｎｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｆａｃｔｏｒｓＢ＞Ｄ＞Ｃ＞Ａ最佳组合ＢｅｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＡ２Ｂ３Ｃ３Ｄ２表５㊀方差分析结果Ｔａｂｌｅ５㊀Ｖａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔ方差来源Ｓｏｕｒｃｅｏｆｖａｒｉａｎｃｅ离差平方和Ｓｕｍｏｆｓｑｕａｒｅｓｏｆｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ自由度Ｆｒｅｅｄｏｍ方差ＶａｒｉａｎｃｅＦ值Ｆ⁃ｖａｌｕｅＰ值Ｐ⁃ｖａｌｕｅ温度Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）２４．０７２２１２．０３６７９．３１７０．０１２∗料水比Ｆｅｅｄʒｗａｔｅｒ（Ｃ）２．８４８２１．４２４９．３８４０．０９６发酵时间Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ（Ｄ）７．６２０２３．８１０２５．１０８０．０３８∗误差Ｅｒｒｏｒ０．３０３２０．１５２㊀㊀ ∗ 表示有显著性差异（Ｐ＜０．０５）㊂表７和表９同㊂㊀㊀ ∗ ｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｓａｍｅａｓＴａｂｌｅ７ａｎｄＴａｂｌｅ９．表６㊀混菌发酵豆粕菌种比例正交试验结果Ｔａｂｌｅ６㊀Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｔｒａｉｎｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｆｏｒｍｉｘｅｄｓｔｒａｉｎｓｆｅｒｍｅｎｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ试验号ＴｅｓｔＮｏ．因素Ｆａｃｔｏｒｓ解淀粉芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（Ａ）植物乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ（Ｂ）酿酒酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｃ）小肽含量Ｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ／％１３（１）１（１）１（１）６．３５２３（１）２（２）２（２）５．９３３３（１）３（３）３（３）６．８７４６（２）１（１）２（２）６．３８５６（２）２（２）３（３）６．４１６６（２）３（３）１（１）６．６９７９（３）１（１）３（３）７．４０８９（３）２（２）１（１）７．３５９９（３）３（３）２（２）８．３１５５７２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷续表６试验号ＴｅｓｔＮｏ．因素Ｆａｃｔｏｒｓ解淀粉芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（Ａ）植物乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ（Ｂ）酿酒酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｃ）小肽含量Ｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ／％Ｋ１１９．１５２０．１３２０．５７Ｋ２１９．４８１９．６９２０．６２Ｋ３２３．０６２１．８７２０．６８ｋ１６．３８６．７１６．８６ｋ２６．４９６．５６６．８７ｋ３７．６９７．２９６．８９极差Ｒ１．３１０．７３０．０３因素主次ＰｒｉｍａｒｙａｎｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｆａｃｔｏｒｓＡ＞Ｂ＞Ｃ最佳组合ＢｅｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＡ３Ｂ３Ｃ２表７㊀方差分析结果Ｔａｂｌｅ７㊀Ｖａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔ方差来源Ｓｏｕｒｃｅｏｆｖａｒｉａｎｃｅ离差平方和Ｓｕｍｏｆｓｑｕａｒｅｓｏｆｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ自由度Ｆｒｅｅｄｏｍ方差ＶａｒｉａｎｃｅＦ值Ｆ⁃ｖａｌｕｅＰ值Ｐ⁃ｖａｌｕｅ解淀粉芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（Ａ）３．１３５２１．５６７１６．９９８０．０５６植物乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ（Ｂ）０．８８６２０．４４３４．８０４０．１７２酿酒酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｃ）０．０１６２０．０８０．０８５０．９２２误差Ｅｒｒｏｒ０．１８４２０．０９２２．４．２㊀混菌发酵豆粕工艺条件优化的试验结果㊀㊀由表８中正交试验结果的Ｒ值分析可以看出，４个因素对发酵豆粕产小肽的影响程度为Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ，即接种量对发酵效果的影响最大，其次是发酵时间，料水比和温度对发酵效果的影响不大㊂进一步的方差分析结果（表９）显示，接种量和发酵时间对发酵产物中小肽含量有显著影响（Ｐ＜０．０５）㊂结合ｋ值大小分析可得，３个菌种混合发酵豆粕工艺条件的最佳组合为Ａ４Ｂ１Ｃ３Ｄ４，即在接种量为１５％㊁温度为３１ħ㊁料水比为１．０ʒ１．０㊁发酵时间为１２０ｈ的条件下，可以取得最优发酵效果㊂表８㊀混菌发酵豆粕正交试验结果Ｔａｂｌｅ８㊀Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｉｘｅｄｓｔａｉｎｓｆｅｒｍｅｎｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ试验号ＴｅｓｔＮｏ．因素Ｆａｃｔｏｒｓ接种量Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｙ（Ａ）／％温度Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）／ħ料水比Ｆｅｅｄʒｗａｔｅｒ（Ｃ）发酵时间Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ（Ｄ）／ｈ小肽含量Ｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ／％１６（１）３１（１）１．０ʒ０．６（１）４８（１）５．２８２６（１）３４（２）１．０ʒ１．２（４）１０８（４）８．２４３６（１）３７（３）１．０ʒ０．８（２）７２（２）６．８９４６（１）４０（４）１．０ʒ１．０（３）９６（３）６．９０５９（２）３１（１）１．０ʒ１．２（４）９６（３）７．１３６５７２７期吝常华等：豆粕微生物固态发酵工艺优化及其营养物质含量变化续表８试验号ＴｅｓｔＮｏ．因素Ｆａｃｔｏｒｓ接种量Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｙ（Ａ）／％温度Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）／ħ料水比Ｆｅｅｄʒｗａｔｅｒ（Ｃ）发酵时间Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ（Ｄ）／ｈ小肽含量Ｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔ／％６９（２）３４（２）１．０：０．６（１）７２（２）７．５４７９（２）３７（３）１．０ʒ１．０（３）１０８（４）８．８８８９（２）４０（４）１．０ʒ０．８（２）４８（１）４．９５９１２（３）３１（１）１．０ʒ０．８（２）１０８（４）８．８７１０１２（３）３４（２）１．０ʒ１．０（３）４８（１）５．８１１１１２（３）３７（３）１．０ʒ０．６（１）９６（３）７．２６１２１２（３）４０（４）１．０ʒ１．２（４）７２（２）７．３８１３１５（４）３１（１）１．０ʒ１．０（３）７２（２）８．３１１４１５（４）３４（２）１．０ʒ０．８（２）９６（３）７．９０１５１５（４）３７（３）１．０ʒ１．２（４）４８（１）６．５３１６１５（４）４０（４）１．０ʒ０．６（１）１０８（４）９．４１Ｋ１１７．３１２９．５９２９．４９２２．５７Ｋ２２８．５０２９．４９２８．６１３０．１２Ｋ３２９．３２２９．５６２９．９０２１．９３Ｋ４３２．１５２８．６４２９．２８３５．４０ｋ１４．３３７．４０７．３７５．６４ｋ２７．１３７．３７７．１５７．５３ｋ３７．３３７．３９７．４８５．４８ｋ４８．０４７．１６７．３２８．８５极差Ｒ３．７１０．２４０．３３３．２１因素主次ＰｒｉｍａｒｙａｎｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｆａｃｔｏｒｓＡ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ最佳组合ＢｅｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＡ４Ｂ１Ｃ３Ｄ４表９㊀方差分析结果Ｔａｂｌｅ９㊀Ｖａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔ方差来源Ｓｏｕｒｃｅｏｆｖａｒｉａｎｃｅ离差平方和Ｓｕｍｏｆｓｑｕａｒｅｓｏｆｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ自由度Ｆｒｅｅｄｏｍ方差ＶａｒｉａｎｃｅＦ值Ｆ⁃ｖａｌｕｅＰ值Ｐ⁃ｖａｌｕｅ接种量Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｙ（Ａ）３．１９７３１．０６６２１．０３３０．０１６∗温度Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）０．１５６３０．０５２１．０２８０．４９１料水比Ｆｅｅｄʒｗａｔｅｒ（Ｃ）０．２２２３０．０７４１．４５９０．３８２发酵时间Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ（Ｄ）２０．８１８３６．９３９１３６．９４２０．００１∗误差Ｅｒｒｏｒ０．１５２３０．０５１２．５㊀豆粕发酵前后理化性质的变化２．５．１㊀豆粕发酵前后营养物质含量㊀㊀最佳发酵条件下，豆粕发酵前后多肽㊁粗蛋白质㊁粗纤维㊁粗灰分和粗脂肪的含量的变化情况如表１０所示㊂豆粕经单菌（解淀粉芽孢杆菌）和混菌（解淀粉芽孢杆菌ʒ植物乳杆菌ʒ酿酒酵母菌＝９ʒ３ʒ２）发酵后，小肽含量分别为１２．７３％和１０．４２％，均显著高于未发酵组（Ｐ＜０．０５），而且单菌发酵组小肽含量要显著高于混菌发酵组（Ｐ＜０．０５）；豆粕经单菌和混菌发酵后，粗蛋白质含量由未发酵时的４６．７０％分别提高到５５．３１％（Ｐ＜０．０５）和５６．１４％（Ｐ＜０．０５），且混菌发酵组显著高于单菌发酵组（Ｐ＜０．０５）；与未发酵组相比，豆粕经单菌和混菌发酵后粗纤维含量显著降低（Ｐ＜７５７２㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷０．０５），但单菌发酵组和混菌发酵组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）；豆粕经单菌和混菌发酵后，粗灰分含量由未发酵时的７．５８％分别提高到９．６８％（Ｐ＜０．０５）和９．４８％（Ｐ＜０．０５），但单菌发酵组和混菌发酵组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）；同时，豆粕经单菌和混菌发酵后，粗脂肪含量由未发酵时的１．８９％分别提高到２．３４％（Ｐ＜０．０５）和２．１８％（Ｐ＜０．０５），但单菌发酵组和混菌发酵组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）㊂表１０㊀豆粕发酵前后营养物质含量的变化（干物质基础）Ｔａｂｌｅ１０㊀Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｎｕｔｒｉｅｎｔｓｕｂｓｔａｎｃｅｃｏｎｔｅｎｔｓｆｏｒｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＤＭｂａｓｉｓ）％项目Ｉｔｅｍｓ小肽Ｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅ粗蛋白质ＣＰ粗纤维ＣＦ粗灰分Ａｓｈ粗脂肪ＥＥ未发酵组Ｕｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｇｒｏｕｐ１．２０ʃ０．１８ｃ４６．７０ʃ０．２１ｃ７．６０ʃ０．４３ａ７．５８ʃ０．１３ｂ１．８９ʃ０．１６ｂ单菌发酵组Ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｇｒｏｕｐ１２．７３ʃ０．５０ａ５５．３１ʃ０．８３ｂ５．５６ʃ０．２９ｂ９．６８ʃ０．０７ａ２．３４ʃ０．１９ａ混菌发酵组Ｍｉｘｅｄｓｔｒａｉｎｓｆｅｒｍｅｎｔｅｄｇｒｏｕｐ１０．４２ʃ０．９３ｂ５６．１４ʃ１．０７ａ５．６２ʃ０．６９ｂ９．４８ʃ０．１６ａ２．１８ʃ０．２２ａ㊀㊀同列数据肩标无字母或字母相同表示差异不显著（Ｐ＞０．０５），不同小写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）㊂下表同㊂㊀㊀Ｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎ，ｖａｌｕｅｓｗｉｔｈｎｏｌｅｔｔｅｒｏｒｔｈｅｓａｍｅｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５），ｗｈｉｌｅｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ．２．５．２㊀豆粕发酵前后ｐＨ的变化㊀㊀由表１１可知，未发酵豆粕的ｐＨ为６．４２，豆粕经单菌发酵后，ｐＨ上升到６．７７，差异不显著（Ｐ＞０．０５）；而经混菌发酵后，ｐＨ下降到５．２１，差异显著（Ｐ＜０．０５）；此外，混菌发酵组的ｐＨ还显著低于单菌发酵组（Ｐ＜０．０５）㊂表１１㊀豆粕发酵前后ｐＨＴａｂｌｅ１１㊀ＣｈａｎｇｅｏｆｐＨｆｏｒｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ项目ＩｔｅｍｓｐＨ未发酵组Ｕｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｇｒｏｕｐ６．４２ʃ０．０９ａ单菌发酵组Ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｇｒｏｕｐ６．７７ʃ０．２０ａ混菌发酵组Ｍｉｘｅｄｓｔｒａｉｎｓｆｅｒｍｅｎｔｅｄｇｒｏｕｐ５．２１ʃ０．１３ｃ２．５．３㊀豆粕发酵前后大豆球蛋白含量的变化㊀㊀由表１２可知，豆粕经单菌和混菌发酵后大豆球蛋白含量均显著降低（Ｐ＜０．０５），其中单菌发酵组大豆球蛋白含量由原来未发酵时的１１８ｍｇ／ｇ下降到５６．１２ｍｇ／ｇ，混菌发酵组大豆球蛋白含量则下降到７０．２２ｍｇ／ｇ，且单菌发酵组要显著低于混菌发酵组（Ｐ＜０．０５）㊂２．５．４㊀蛋白质分子质量的测定结果㊀㊀由图９可以看出，未发酵豆粕中大分子的蛋白质占了一定比例，主要分布在３５和４５ｋｕ；豆粕经发酵后，样品中大于３５ｋｕ的大分子蛋白质明显减少，主要分布在小于２５ｋｕ部分，少数分布在２５ｋｕ；与混菌发酵组相比，单菌发酵组蛋白质分子质量小于１５ｋｕ的部分更多㊂表１２㊀豆粕发酵前后大豆球蛋白含量（干物质基础）Ｔａｂｌｅ１２㊀ＣｈａｎｇｅｏｆＳｏｙｂｅａｎｇｌｏｂｕｌｉｎｃｏｎｔｅｎｔｆｏｒｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＤＭｂａｓｉｓ）ｍｇ／ｇ项目Ｉｔｅｍｓ大豆球蛋白Ｓｏｙｂｅａｎｇｌｏｂｕｌｉｎ未发酵组Ｕｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｇｒｏｕｐ１１８．５１ʃ１２．３５ａ单菌发酵组Ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｇｒｏｕｐ５６．１２ʃ１．０５ｃ混菌发酵组Ｍｉｘｅｄｓｔｒａｉｎｓｆｅｒｍｅｎｔｅｄｇｒｏｕｐ７０．２２ʃ４．０４ｂ３㊀讨㊀论３．１㊀豆粕发酵前后营养物质含量的变化㊀㊀经微生物发酵处理后，豆粕中部分营养物质含量有所提高，抗营养因子得到有效降解㊂本试验中，豆粕经单菌和混菌发酵后，小肽含量较未发酵组分别提高了１０．６１和８．６８倍，并且单菌发酵组小肽含量要显著高于混菌发酵组㊂Ｈｏｎｇ等［１６］的研究显示，发酵提高了豆粕中＜１０ｋｕ小肽的含量，未发酵豆粕中有２２．２％的肽为大肽，而发酵豆粕中不含有＞６０ｋｕ的大肽，这与本试验结果具有一致性㊂小肽含量的升高是因为微生物发酵可以把豆粕中的蛋白质水解为氨基酸㊁多肽和氨等小分子物质［１７－１８］，本试验中单菌发酵组和混菌发酵８５７２组小肽含量存在显著差异可能是因为将豆粕中蛋白质降解为小肽的酶主要是由解淀粉芽孢杆菌产生的，而在进行混菌发酵时，解淀粉芽孢杆菌的接种量相对低于单菌发酵时的接种量㊂马文强等［１９］研究发现，豆粕经微生物发酵后，粗蛋白质含量相较发酵前提高了１３．４８％㊂刘剑飞［２０］选用１株厌氧型枯草芽孢杆菌在一定条件下对豆粕进行厌氧发酵，测得粗蛋白质含量提高了１３．０％，达到５３．２７％；经枯草芽孢杆菌㊁酵母菌㊁植物乳杆菌混菌发酵后，粗蛋白质含量提高了１３．５％，达到５３．５１％㊂王洪瑞［２１］在研究微生物发酵豆粕工艺时发现，豆粕经发酵后，粗蛋白质含量最高可达５９．５２％㊂本试验中，豆粕经单菌和混菌发酵后，粗蛋白质含量分别提高了１８．４４％和２０．２１％，并且混菌发酵组粗蛋白质含量要显著高于单菌发酵组㊂豆粕固态发酵后粗蛋白质含量都有不同程度提高，这主要是因为在发酵过程中微生物（主要是有益菌）的呼吸作用消耗了部分有机物料，从而释放出二氧化碳（ＣＯ２）和水（Ｈ２Ｏ），使产物总量减少，出现了蛋白质的 浓缩效应 ［２２］，还有部分增加的蛋白质是酵母菌体含有的菌体蛋白质和发酵过程中无机铵盐经由酵母菌转化而成的，这是发酵产物中粗蛋白质含量提高最有意义的部分［２３］㊂在发酵过程中，由于微生物大量繁殖，不仅提高了发酵豆粕蛋白质基料的蛋白质水平，而且在发酵过程中，豆粕中的植物性蛋白质被微生物代谢利用转化为菌体蛋白质，这样也改变了豆粕中蛋白质的品质㊂刘栩州［２４］研究发现，运用复合微生物发酵豆粕，产物中粗蛋白质含量略微上升，但粗纤维含量较发酵前下降了３３．７％，而本试验中豆粕经单菌和混菌发酵后粗纤维含量下降量分别为２６．８４％和２６．０５％，可能是因为菌种差异而对粗纤维的降解能力不同㊂经单菌和混菌发酵后，发酵产物中的粗灰分和粗脂肪含量都到了显著提高，这是由于发酵过程中豆粕中部分有机物被微生物生长所利用而造成干物质损失，使得它们的含量相对提高，这一结果与付亭亭［２５］和Ｃｈｉ等［１０］的研究结果一致㊂３．２㊀豆粕发酵前后ｐＨ的变化㊀㊀本试验中，单菌发酵组发酵产物的ｐＨ升高，而杨守凤［２６］在乳酸菌固态发酵豆粕的研究中则发现发酵产物ｐＨ显著降低，可能是因为解淀粉芽孢杆菌在发酵豆粕过程中产生蛋白酶，蛋白酶降解豆粕中蛋白质产生胺类物质，甚至产生一些氨气使得产物ｐＨ升高，而乳酸菌在发酵过程中可以产生一些乳酸等有机酸使发酵基质ｐＨ降低㊂本试验结果显示，豆粕经混菌发酵后ｐＨ显著降低，可能是因为在固态培养基中，解淀粉芽孢杆菌和酿酒酵母菌均为好氧菌，发酵前期它们的生长代谢为乳酸菌的生长繁殖创造了厌氧环境，后期乳酸菌大量繁殖代谢产生的乳酸中和掉了一部分胺类物质，降低了培养基ｐＨ，同时改善了发酵产物的风味，这就是发酵饲料成品具有酸香味的一个重要原因［２７］，这与刘剑飞［２０］㊁史玉宁等［２８］的研究结果一致㊂㊀㊀Ｍ：蛋白质Ｍａｒｋｅｒ；０：未发酵豆粕样品；１：单菌发酵豆粕样品；２：混菌发酵豆粕样品㊂㊀㊀Ｍ：ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；０：ｕｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌｓａｍ⁃ｐｌｅ；１：ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌｓａｍｐｌｅ；２：ｍｉｘｅｄｓｔｒａｉｎｓｆｅｒｍｅｎｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌｓａｍｐｌｅ．图９㊀豆粕发酵前后蛋白质分子电泳图Ｆｉｇ．９㊀Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍｏｆｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｏｒｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ３．３㊀豆粕发酵前后大豆球蛋白含量的变化㊀㊀大豆球蛋白是热稳定性最强的抗原蛋白之一，同时也是大豆引起动物过敏反应和腹泻的主要成分㊂付亭亭［２５］分别采用４种不同的微生物对豆粕进行适当的发酵，发酵产物中大豆球蛋白含量均有不同程度的降低，其中大豆球蛋白的含量最低减少６．８６％，最高可达２９．２５％；混菌发酵豆粕的结果表明不同的菌种组合表现出不同的降解能力，但是与单一菌种发酵结果相比，效果基本一致㊂而本试验中所用菌种对大豆球蛋白降解能力相对较高，豆粕经单菌㊁混菌发酵后，大豆球蛋白。
中药微生态发酵技术研究进展与展望
[30]Reid N.R.African horse sickness[J].Br.Vet.J,1961,118:137-142.[31]Zeleke A.,Sori T.,Powel K.,et al.Isolation and identification of cir-culating serotypes of African horse sickness virus in Ethiopia [J].Intern.J.Appl.Res.Vet.Med,2005,3:40-43.[32]Mildenberg Z.,Westcott D.,Bellaiche M.,et al.Equine encephalosisvirus in Israel[J].Transbound.Emerg.Dis,2009,56:291.[33]Yadin H.,Brenner J.,Brumbrov V,et al.Epizootic haemorrhag-icdisease virus type 7infection in cattle in Israel [J].Vet.Rec,2008,162:53-56.中药以其来自天然、多功能性、毒副作用低、不易产生耐药性等优势，在人类医学、动物医学、食品科学、日用化学等诸多领域得到了越来越广泛的应用，近年来尤其受到关注与重视。
由于中药多为仅经过简单物理加工的天然物质，其化学组分复杂，有效成分（部位）不完全清晰，简单的炮制与制剂工艺常使其难于得到充分的利用。
为了提高中药利用效率，增强药物效果或调整、修饰药物功能，人们对中药的加工工艺开展了多途径、深层次的研究，如中药有效成分提取、中药超微粉碎、中药微生态发酵等技术的研究都取得了长足的进展，部分技术已应用于中药制剂生产。
在中药现代加工工艺研究中，中药微生态发酵技术是相对新兴而活跃的领域。
其实，常用的中药神曲（又称六曲、六神曲）就是传统中药炮中药微生态发酵技术研究进展与展望汪洋1，汪德刚2，张世新3，邓贞怀3（1.山东大学生命科学学院山东济南250100；2.河南牧业经济学院河南郑州450011；3.北京中农劲腾生物技术有限公司北京102206）摘要：中药微生态发酵是将现代生物技术与传统中药炮制相结合形成的中药制药新技术。
微生态制剂发酵工艺研究进展
微生物的生长及所形成的产物均处于基质表面。固 态基质不仅起到一个提供碳源、氮源、水分、无机 物和其他营养物的作用，同时也为微生物的生长提
供了一个同定的位置，整个发酵过程跟微生物在自
然环境中所发生的微生物反应相似。 目前，微生态制剂生产企业大多在无菌间内采 用固态浅盘培养或堆积发酵。设备简单、投资少、 建厂期短、收效快、操作容易和便于推广；生产环 境要求不高；使用固体原料，在发酵过程中，糖化 和发酵过程同时进行，简化操作工序，节约能耗。 固态发酵工艺缺点也很明显：工艺生产周期长；营 养物质量浓度存在梯度，发酵不均匀，菌体的生长、 对营养物的吸收和代谢产物的分泌存在不均匀；生 产机械化程度较低，而且易染菌，难以实现纯种培 养，产品质量不稳定和应用效果差等，根本原因是： 固态发酵设备和检测手段不完善。这些不足制约了 固体发酵在工业生产中的应用。近年来，随着对固 态发酵技术研究的不断深入，现代固态发酵技术在 反应设备、参数控制和传质传热等领域的研究取得 了较大的进展。许多可用于大规模纯种培养的固态 发酵设备陆续被开发出来，如：转鼓式生物反应器、 填充床生物反应器和压力脉冲生物反应器等。
在发酵中加入的黄芪多糖是从内蒙黄芪根中分离出的多糖组分ap附分子的表达而促进淋巴细胞与内皮细胞的黏附从而促进淋巴细胞再循环而发挥的免疫增强作用
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微生态制剂发酵工艺砑究进展
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微生态制剂因其具有无不良反应、无残留污染、 不产生抗药性、抗病治病、增强免疫和促进生长等 优点，逐渐成为发酵工业领域生产和研究的热点。 现阶段微生态制剂的发酵工艺包括，液体发酵、固 体发酵和同液两相发酵。
江南大学科技成果——基于风味导向的固态发酵白酒生产新技术及应用
江南大学科技成果——基于风味导向的固态发酵白酒生产新技术及应用成果简介发明了白酒特征风味强化新技术，稳定了白酒中的特征风味。
首次鉴定出产生白酒不良风味的微生物，发明了不良风味消除新技术，降低白酒中不良风味物的浓度。
形成了发酵—风味微生物组合纯种制曲新技术。
实现了原酒品质鉴别与基酒组合过程的科学定量控制。
本项目获2013年度国家技术发明奖二等奖。
技术指标白酒特征风味强化新技术，优质品率提高5%以上。
不良风味消除新技术，清香型白酒中异味物土味素含量降低80%，杂醇油含量下降30%，优质品率提高5.8%以上。
发酵风味微生物组合纯种制曲新技术。
小曲清香型白酒优质品率提高70-80%，同时出酒率提高5.3%，年人均劳动生产率由28吨提高至100吨。
原酒品质鉴别与基酒组合过程的科学定量控制。
原酒分级准确率高于人工品评18%，白酒批次稳定性提高了5%。
应用情况本项目成果已经在贵州茅台酒股份有限公司、山西杏花村汾酒厂股份有限公司和江苏洋河酒厂股份有限公司应用，近三年累计新增销售收入19.53亿元、利润6.07亿元、税收6.55亿元；实现了小曲清香型劲酒的机械化生产，吨酒耗水、耗煤分别降低46.5%、38.8%，污水排放减少44.4%。
应用企业认为“这些技术在公司的生产、技术、科研、质量保证等方面发挥了重大作用”。
推广应用于宜宾五粮液股份有限公司、江苏今世缘酒业股份有限公司等9家大型白酒企业，新增销售收入11.26亿元、利润2.41亿元、税收3.17亿元。
授权专利一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法，200810235366.1；一种测定白酒中挥发性成分的方法，201010018156.4；一种中国白酒中非糠壳带来的土霉异味化合物土臭素的测定方法，201010206992.5；产土臭素的菌株及其筛选方法，201110087614.4；中国酱香型白酒生产中高产乙醇低产杂醇油的酵母的筛选与应用，201110122398.2；微生物脂肪酶酶法合成酯的方法，98111566.7；一种脂肪酶产生菌及其筛选方法和产业化应用，03113274.X；一种测定白酒中吡嗪类化合物的方法，200710019764.5；一种测定白酒中硫化物的方法，200710019763.0；一种测定白酒中挥发性苯酚类化合物的方法，201010018155.X；利用风味定向技术筛选中国白酒酿造中的β-大马酮产生菌株及其应用，201110122420.3。