药物毒理学实验方法与技术
细胞毒理学实验技术-MTT
DMSO需要避光加入，加入前将孔内液体吸除干 净，注意不要把结晶吸除
铺细胞一定要均匀，减小实验误差
③ MTT实验应用
大规模抗肿瘤 药物及其适宜 浓度的筛选
体外肿瘤细胞 的临床药物敏 感性实验
检测细胞活 性、细胞增殖 力和细胞毒性
生物活性因子 的活性检测、 肿瘤放射敏感 性测定等
因死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原，故成为验材料
MTT溶液 (PBS溶解，5mg/ml。小剂量分装，4℃避光保存，两周内有效。或-20 摄氏度冻存，避免反复冻融)、DMSO
需测定的细胞、中 高 低浓度药物 酶标仪、超净台、显微镜 培养皿、离心管、96孔板、细胞计数板、移液枪等
② 实验方法
接种细胞
培养细胞
呈色
比色
消化细胞，用细胞计数板计数， 调整细胞浓度至104个/ml，接种 至96孔板100μl/孔
A
培养24h后，吸除孔内原培养液， 加入培养液配置的不同浓度药物， 每孔100μl(空白组不做处理)
B
药物反应完成后，配制MTT(培养 液:MTT=5:1)并加入，反应4h
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细胞毒理学实验技术
MTT法检测细胞活性
报告人：
CONTENTS
1 实验原理 2 实验材料与方法 3 实验结果与分析 4 实验应用
① 实验原理
• MTT是一种黄色粉末状化学试剂 • 商品名为：噻唑蓝 • 全称为：3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide
MTT是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥 珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下被还原，生成蓝色的甲瓒(formazan)结晶，结 晶的生成量仅与活细胞数目成正比。还原生成的结晶可在二甲基亚砜(DMSO) 中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。 OD值越大细胞活性越强(或药物毒性越小)。
毒理学研究方法
毒理学研究方法毒理学研究方法是指应用于研究化学物质对生物体产生毒性效应的方法。
毒理学研究方法主要分为体外实验和体内实验两种。
体外实验是指在离体条件下进行的实验研究。
常用的体外实验方法包括荧光标记法、细胞毒性实验和酶活性测定等。
荧光标记法是利用荧光染料将物质与细胞或分子结合，通过观察荧光信号的强弱来判断物质对生物体的毒性。
细胞毒性实验是将物质直接加入细胞培养基中，观察细胞形态和数量的变化来评估物质的毒性。
酶活性测定是通过测定酶的活性来判断物质对生物体酶系统的影响，常用的测定指标包括丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽过氧化物酶活性等。
体内实验是指在整个生物体内进行的实验研究。
常用的体内实验方法包括农药和药物的急性毒性实验、慢性毒性实验和基因毒性实验等。
急性毒性实验主要是通过给实验动物灌胃或皮下注射等方式给予一定剂量的物质，观察动物的死亡率来评估物质的急性毒性。
慢性毒性实验是将一定剂量的物质连续给予实验动物一定时间，观察动物的生长、繁殖和行为等指标的变化来评估物质的慢性毒性。
基因毒性实验是通过观察物质对动物或细胞的遗传物质的影响来评估物质的遗传毒性，常用的方法包括微核实验和突变基因检测等。
除了以上常用的体外和体内实验方法，还有一些辅助的研究方法用于辅助毒理学研究。
比如，系统毒理学研究方法是通过系统化的研究物质在生物体内的吸收、分布、代谢和排泄等过程来评估物质的毒性。
组织工程学是利用体外培养技术建立人工组织模型，通过观察物质对人工组织的影响来评估物质的毒性。
计算毒理学是利用计算机模拟和统计分析等方法对毒理学数据进行处理和分析，评估物质的毒性。
总之，毒理学研究方法可以在体外和体内条件下开展实验研究，通过观察实验结果来评估化学物质的毒性。
不同的实验方法可以相互印证，全面评估物质的毒性效应。
药理毒理学实验
药理毒理学实验
药理毒理学实验是指研究药物对机体生理和病理过程的影响以及药物的毒性和安全性的实验研究。
这些实验常用于药物的开发、评价和监管。
药理学实验常包括以下方面的研究：
1. 药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程；
2. 药物对生理系统和器官的作用机制和效应；
3. 药物对生理参数（如血压、心率、血糖等）的影响；
4. 药物的药效学研究，如测定最小有效剂量、最大耐受剂量等。
毒理学实验主要研究药物对机体引起的毒性反应，包括急性毒性、慢性毒性和亚慢性毒性等。
常用的毒理学实验包括：
1. 急性毒性实验：用于确定药物对动物的一次性剂量引起的毒性反应；
2. 慢性毒性实验：用于评估长期接触药物对动物的毒性效应；
3. 亚慢性毒性实验：用于评估中长期接触药物对动物的毒性效应；
4. 各种毒性指标的测定，如致死剂量、半数致死剂量、致畸性、致癌性等。
药理毒理学实验通常在动物模型中进行，常用的动物包括小鼠、大鼠、猴等。
实验设计需要符合伦理规范，并进行必要的安全措施，以确保实验过程安全且可靠。
值得注意的是，药理毒理学实验虽然可以提供药物效果和毒性的初步评估信息，但实验结果在转化到人类临床应用方面仍需要进行更进一步的研究和验证。
中药毒理学研究1
皮肤吸收定量试验
脱毛并罩上玻璃钟罩——加入定量药物——药 物与皮肤接触2~6小时——观察 脱毛：化学法和机械法
二、局部刺激性试验
血管
肌肉
红肿、充血、渗出、变性或坏死
皮肤
粘膜
注意：不宜进行局部刺激性试验的情况
pH≤ 2
pH≥ 11.2
血管刺激性试验
家兔——耳背血管注射药物——观察局部血管 及周围组织反应（48-96小时） 肉眼观察、显微镜检查、组织病理学检查。
急性毒性试验 长期毒性试验 局部毒性试验
致畸试验 致癌试验 致突变试验 药物依赖试验
研究方法
体内试验——利用整体动物进行的试验。
体外试验——利用离体脏器、培养细胞
进行的试验。
中
中药毒理学 药政管理学 中药药动学 分子生物学
药 安 全
细胞生物学
性
统计学
评
价
药理学 生理学 病理学 遗传学 动物学 组胚学 临床医学
定义
溶血性试验:考察中药注射剂是否具有溶血和 红细胞凝聚等反应。
分类
免疫性溶血——免疫反应——抗体——溶血 非免疫性溶血——药物诱导——溶血
必要性
中药 1、含有溶血成分 2、含有杂质成分 3、免疫性溶血
常见方法
一、常规体外试管法（肉眼观察法） 红细胞悬液——加入受试物——温育——观察 溶血或凝集反应情况。
急性毒性试验
概念
急性毒性试验：中药一次或24小时内多次给予 试验动物，观察在短时间内对动物所引起的快 速而剧烈的中毒效应的试验方法。
意义
1.了解中药急性毒性的强弱 2.为长期毒性试验及特殊毒性试验选择
剂量提供依据 3.获取毒性反应信息
实验设计
《药物毒理学》课件
药物剂量和个体差异：药物 剂量和个体差异可能导致毒 性反应不同
药物代谢和排泄：药物代谢 和排泄可能导致毒性反应不 同
药物耐药性：长期使用药物 可能导致耐药性，需要不断 更新药物和治疗方案
药物安全性评估：需要建立 完善的药物安全性评估体系， 确保药物的安全性和有效性
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汇报人：
汇报时间：20XX/01/01
实验结果：观察药物对实 验对象的影响，包括生理、 生化、病理等方面的变化
实验分析：对实验结果进 行统计分析，评估药物的 毒性和副作用
实验报告：撰写实验报告， 包括实验目的、方法、结 果、分析和结论等内容
药物毒性评价的指标和标准
• 急性毒性：评价药物在短时间内对机体产生的毒性反应 • 慢性毒性：评价药物在长期使用过程中对机体产生的毒性反应 • 遗传毒性：评价药物对遗传物质和生殖细胞的影响 • 致癌性：评价药物对肿瘤发生的影响 • 生殖毒性：评价药物对生殖系统、胚胎发育和后代健康的影响 • 免疫毒性：评价药物对免疫系统的影响 • 神经毒性：评价药物对神经系统的影响 • 心血管毒性：评价药物对心血管系统的影响 • 呼吸毒性：评价药物对呼吸系统的影响 • 肝毒性：评价药物对肝脏的影响 • 肾毒性：评价药物对肾脏的影响 • 皮肤毒性：评价药物对皮肤的影响 • 眼毒性：评价药物对眼睛的影响 • 胃肠道毒性：评价药物对胃肠道的影响 • 骨骼毒性：评价药物对骨骼的影响 • 内分泌毒性：评价药物对内分泌系统的影响 • 代谢毒性：评价药物对代谢系统的影响
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药物毒理学
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毒理学实验
药物筛选：确定药 物的安全性和有效 性
药物代谢：研究药 物在体内的吸收、 分布、代谢和排泄 过程
药物毒性：评估药 物对机体的毒性作 用和剂量-反应关系
药物安全性评价： 对新药进行全面的 安全性和有效性评 估，确保药物在上 市前的安全性和有 效性
毒理学实验在环境监测和评价中的应用
监测环境污染：毒理学实验可以检测 环境中存在的有害物质，为环境监测 和评价提供科学依据。
样本量计算：根据预期效应大小、显著性水平、检验效能等参数，利用统计学公式计算每 组所需的样本数量。
实验操作流程的设计
确定实验目的和 目标
选择实验动物和 染毒途径
设计实验分组和 剂量
确定实验周期和 观察指标
毒理学实验结果分 析
数据整理与统计
对实验数据进行分类、筛选和整理，确保数据准确性和完整性。 采用统计学方法对实验数据进行处理和分析，以揭示数据内在规律和趋势。 制作图表、表格等可视化工具，帮助更好地理解和解释数据。 对比不同实验组之间的数据，分析差异和原因，为实验结论提供有力支持。
实验动物的种类：选择与人类生理、 代谢等方面相似的动物，如小鼠、 大鼠、兔、狗等。
实验动物的年龄和性别：根据实验 目的和要求，选择不同年龄和性别 的动物。
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实验动物的数量：根据统计学原则， 确定足够的样本量以获得可靠的结 果。
实验动物的处理：确保动物在实验 过程中得到人道关怀，遵循伦理原 则。
毒理学实验方法
急性毒性实验
实验目的：评估受试物在短期内的毒性作用 实验动物：常用小鼠、大鼠、兔子等 给药方式：一般为口服、注射等途径 结果评价：通过观察实验动物的中毒症状和死亡情况，计算半数致死量等指标
毒理学指标及试验操作汇总
.药物毒性试验指标1.急性毒性试验一、半数致死量（LD50）的测定(一)目的:观察受试物一次给予动物后，所产生的毒性反应和死亡情况。
(二)动物分组和剂量1.动物:一般用小白鼠8周龄，体重18---22g(同次试验体重相差不超过2g)大白鼠6~8周龄，体重120--150g，同次试验体重相差不超过10g。
2.受试物:溶于水的做成溶液，不溶于水的做成混悬液.(三)试验方法1.剂量:一般选用3一5个剂量，各剂量间剂距根据受试物情况和预试结果而定。
2.给药途径和容积:给药途径:应与临床试验的途径相一致。
口服药物应灌胃给药，一、二类新药应采用两种途径给药，其中一种应为推荐临床研究的给药途径。
水溶性好的药物还应测定静脉给药的急性毒性。
给药容积:小白鼠禁食(12~16小时)，不禁水，按体重计算:灌胃(ig)不超过0. 4ml/ 10g体重。
大白鼠禁食(12~16小时)，不禁水、灌胃(ig)，不超过3ml/只。
3.测定LD:将动物按体重随机分组，每组至少10只(雌雄各半)。
给受试物后立即观察50动物反应情况，每天观察一次连续观察七天。
详细逐天记录动物毒性反应情况及死亡分布，并用适当的统计学方法(申报时应说明方法名称)计算出LD值及95%可信限。
504.观察毒性反应:给受试物后应严密观察反应情况，并记录动物的外观、行为活动、精神状态、食欲(饲料消耗量)、大、小便及其颜色、被毛、肤色、呼吸、鼻、眼、口腔有无异常分泌物，体重变化以及死亡等情况。
死亡动物应及时进行尸检，发现病变器官应做病理组织学检查。
若发现中毒反应或死亡率一与动物的性别有明显相关时，则应选择性别敏感的动物进行复试。
(四)试验报告和结果评价应详细具体，包括试验日期、动物的规格、性别、数量、受试物来源及含量、试验方法。
LD 值及其95%可信限，以及各剂量组的死亡率，或最大耐受量的值及其相当于临床剂量的50倍数.详细报告实验过程中动物出现的中毒表现及致死症状，综合评价受试物毒性大小。
新药研发中药理毒理研究的技术要求
毒理- 致癌性
致癌试验
• 检测受试药物对动物的潜在致瘤性 • 药物是否进行该试验应在获得一定的相关信息后才能确定
人群最长用药的时间及遗传毒理学、重复给药毒性等相关结果 重复给药毒性试验可能显示受试药物具有免疫抑制特性、激素活性或 考虑对人类是一种危险因子时，都应慎重考虑进行有关的致癌试验。 如：- 药物拟用于非肿瘤病人的辅助治疗或非癌症疾病的重复给药使用
毒理试验
毒理试验设计要点
毒理研究
毒理研究范围
急性（单次给药）毒性 长期（重复给药）毒性 致突变（遗传毒性） 生殖毒性 致癌性 其它毒性（过敏性、溶血性、光毒性、免疫毒性、
药物依赖性等试验）
毒理研究-共性问题
受试药物
化学药品：原料、制剂 生物制品：制剂 中药：原料、制剂、浸膏
试验动物
动物同药效试验 啮齿类和非啮齿类两种，如大鼠、犬或猴等。 理由充分，一种相关动物
• 设法发现引起毒性反应的剂量、剂量与毒性之间的关 系、中毒表现和程度、主要毒性靶器官或组织及可逆 程度等
• 预测临床研究阶段可能的安全范围和毒性，预先制定 防治措施或避免某些有特殊疾病患者的使用，减少临 床可能的风险
• 为临床试验初始剂量和指标的选择等提供重要参数
毒理研究- 长毒
试验方案设计- 基本原则
• 一类药需要提供实验资料
毒理- 生殖毒性
生殖毒性试验
• 评价药物对哺乳动物生殖的影响，推测对人可能的生殖毒性 • 研究分为三段
I段（一般生殖毒性）：是评价对成年动物生育力和早期胚胎发 育影响，评价药物对配子成熟，交配行为、受孕、胚胎着床前和 着床的影响 II段（致畸敏感期毒性）：即妊娠动物在胚胎器官形成期给药， 评价药物对亲体、胚胎、胎仔发育影响 III段（围产期毒性）：在妊娠动物分娩前后给药，评价胎仔出生 前后的发育和孕鼠从妊娠后期至断奶期间给药对妊娠、分娩、哺 乳、胚胎、胎仔发育的影响。 • 根据临床用药次数、适应证和拟用人群决定是否进行该试验 • 创新药，一般可在申报临床研究前先提供II段试验 • 对于可能只给一次或终身一次（如诊断或外科手术）的药，重复 给药研究也许是不必要的。在较高剂量下，缩短处理期似乎更合 适。
简述简述药物毒理学的定义及主要研究内容
药物毒理学是研究药物对生物体产生的有害效应及其机制的学科。
它主要研究药物的毒性作用、药物代谢、药物致毒机制、毒性效应的发生和防治等内容。
药物毒理学既是药品研发与临床应用的重要参考，又是保护人类和动物免受毒害的重要手段。
一、药物的毒性作用药物的毒性作用是指药物对生物体产生的有害效应。
药物的毒性作用主要包括急性毒性和慢性毒性。
急性毒性是指药物在短时间内对生物体产生的严重有害效应，常表现为急性中毒症状，如头晕、恶心、呕吐、昏迷等。
慢性毒性是指长期服用药物或长期接触药物后对生物体产生的慢性毒害效应，可能表现为器官功能损害、免疫功能下降、细胞突变等。
二、药物代谢药物代谢是指药物在体内经过一系列的生物化学反应，最终转化成代谢产物和排泄出体外的过程。
药物代谢是药物毒性的重要环节，大部分药物在体内经过代谢后才能发挥药效，但部分药物代谢过程中会产生毒性代谢产物，对机体造成损害。
三、药物致毒机制药物致毒机制是指药物对生物体产生毒性效应的机制，主要包括药物与生物大分子的结合，影响细胞代谢和信号传导，诱导氧化应激和导致DNA损伤等。
了解药物致毒机制对于预防和治疗药物中毒具有重要意义。
四、毒性效应的发生和防治毒性效应的发生和防治是药物毒理学的核心内容。
毒性效应的发生受多种因素影响，包括药物剂量、频率、给药途径、个体差异等。
在临床应用中，如何预防和治疗药物中毒是关乎患者安全的重要问题，需要依靠药物毒理学的研究成果进行指导。
药物毒理学是一门既重要又复杂的学科，它对于药品的研发、临床应用和毒物的防治都具有重要意义。
希望今后能有更多的科研人员投身于药物毒理学的研究，为人类的健康做出更大的贡献。
药物毒理学作为一门复杂而重要的学科，其研究内容涉及诸多方面，不仅关乎药物的合理应用和人类健康，也有着深远的社会影响。
五、药物的特异毒性药物的特异毒性是指同一种药物在不同个体或不同物种中表现出不同的毒性效应。
个体差异、物种差异、遗传差异等都会导致药物的特异毒性。
毒理学 长期毒性试验
蓄积毒性作用
药物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物
反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度
(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学
毒物的蓄积作用 (accumulation) 。
三、长期毒性试验与急性毒性试验的根本差异
1.给药的期限不同
急性毒性试验为一次性给药或 24h 内多次给药。
长期毒性试验为连续多日接触一定剂量给药，给药期限可以从数天至终生甚至数代，一
般为临床用药的 3-4 倍。
表 3-1 常用实验动物的平均寿命及长期毒性试验给药期限
试验动物 平均寿命（年） 亚慢性试验给药期限（月） 慢性试验给药期限（月）
使用本方法时要注意染毒期间定期(每 4 天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒 物的染毒绝对量。 3.剂量固定的 20 天蓄积法：
通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为 5 个组，包括阴性对照组和 1/20 LD50、 l/10 LD50、1/5 LD50 和 1/2 LD50 四个剂量组，每组动物数 10 只，雌雄各半。每日染毒一次， 连续染毒 20 天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。
①供试药物在体内的生物蓄积作用：测定有关的蓄积参数，有助于了解药物的蓄积性。 对于高蓄积性药物应适当减少剂量； ②供试药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而这些酶又是否易被供 试药物本身所诱导或抑制。例如，某些药物如果抑制与其本身代谢或解毒有关的酶，则 该药物的给药剂量应酌情减少。 ③供试物在消化道中的稳定性，与胃肠道内容物有亲和性的药物，应酌情增加剂量。
功，是其它实验动物不可替代的。
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药物毒理学实验方法与技术
药物毒理学实验方法与技术是用于研究药物的安全性和有效性的
重要手段。
它旨在了解药物如何在人类体内和动物体内影响生物标记物、细胞和分子水平，从而促进新药的发展。
实验方法可以分为两类：生物学和定量分析。
一般来说，在进行药物毒理学实验之前，需要使用许多先进的实
验技术，以确定实验目标、指导实验过程和分析实验结果，并评估实
验的安全性和质量。
生物学技术包括免疫荧光技术、电镜（TEM）技术、杂交实验、RNA和DNA克隆等。
其中，最常用的实验技术是药物动力学（PK）和药物代谢（XB）实验。
以PK实验为例，主要通过测定新药在体内的吸收率和消除率，
预测其在体外的有效性和有害影响。
与PK实验类似，XB实验旨在探讨药物及其代谢产物在内部环境下如何进行代谢和分解，以及它们是如
何影响有效活性和毒性的。
除了上述技术外，非定量分析技术也是药物毒理学实验的关键工
具之一。
这些技术可以帮助科学家了解复杂生物系统如何应对外来物质，从而揭示药物给患者带来的有效性和毒性。
综上所述，药物毒理学实验需要运用大量先进的实验技术，如生
物学技术、药物动力学和药物代谢实验、非定量分析等技术，以有效
地评估新药剂的安全性和有效性。
这些实验方法是药物开发过程中不
可缺少的一部分，能够帮助医疗行业更好地了解药物的不良作用。