产低温蛋白酶极地菌株的筛选及Pseudoalteromonas sp. QI-1产蛋白酶粗酶性质
海洋低温淀粉酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究
ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｐ ｒ ｅ ｌ ｉ ｍｉ ｎ ａ ｒ ｙ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ ｓ ｈ ａ ｋ ｅ ｌ ｆ ａ ｓ ｋ ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ａ ｒ ｙ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ ， ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｗａ ｓ ６ ． ２ ５ Ｕ／ ｍ１ ． Ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｇ ｈ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ，
３ ． Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆ Ｌｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅａ ｎ ｄＢｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｎｏ ｈ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｄａ ｌ ｉ ｎ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙｏ ｆＴ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｄａ ｌ ｉ ｎ ａ １ １ ６ ０ ２ ４ Ｃｈ ｉ ｎ ａ ｊ
摘 要： 以大 连 黄 海海 泥 和 海水 为样 品 ， 采用 稀 释 涂布 板 透 明 圈法 初 筛 、 摇 瓶 发酵 复筛 ， 得 到 一 株 淀粉 酶 高 产 菌Ｚ Ｘ Ｓ ． ５ ， 测得 酶 活
为６ ． ２ ５ Ｉ 『 ／ 瑚Ｉ ， 。 通 过 形态 学 、 生 理 生化 及 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ序 列鉴 定 ， 菌株 Ｚ Ｘ Ｓ 一 ５ 为 荧光 假单 胞 菌 （ Ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍｏ ｎ ａ ｓ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｓ ） 。该酶 的最适 作 用 温度为２ ５℃， 酶 的热 稳 定 性 相 对 较 差 ； 最适作用ｐ Ｈ值 为 ８ ． ０ ， 属于碱性酶， 该 酶 在 酸 性 条件 下稳 定性 较 差 ； Ｂ ａ 、 Ｃ ｕ ２ ＋ 、 乙二 胺 四 乙酸 （ Ｅ ＤＴ Ａ ） 对 该 酶 抑制 性 较强 ， Ｆ ｅ 、 ｚ ｎ 、 Ｍｎ ２ ＋ ￣ ｊ － 该酶 的 活性 影 响不 明显 ， Ｍｇ ＋ ２ ， Ｎ ａ 对 该 酶激 活 作用 较 弱 ， Ｃ ａ ２ ＋ Ｘ ￣ ＂ 该 酶激 活作 用较 强 。 关键 词： 低 温 淀粉 酶 ； 鉴定； 荧光 假单 胞 菌 ； 酶学 性质 中 图分 类 号 ： Ｑ９ ３ — ３ ３ １ 文 章编 号 ： ０ ２ ５ ４ — ５ ０ ７ １ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ８ ～ ０ ０ ５ ７ — ０ ５ ｄ ｏ ｉ ： ｌ ０ ． １ １ ８ ８ ２ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ０ ２ ５ ４ — ５ ０ ７ １ ． ２ ０ １ ７ ． ０ ８ ． ０ １ ３
南极Pseudoalteromo...
厘［Ｊ态望熊±监塞！直拯低迢＆】：魔酶基固瘟隆厘萱里兹渣沉抠塑生血型基因查搓性硒宣３结果与分析３．１南极普里兹湾深海微生物产几丁质酶基因的研究３．１．１ＡＣ４４４菌株的分类鉴定３．１．１．１深海沉积物中产几丁质酶菌株的分离将采集到的水样稀释，泥样用无菌水浸泡取上清液后，涂布在２２１６Ｅ培养基平板上，４。
Ｃ冰箱培养，挑取单个菌落划线于几丁质筛选培养基平板，４０Ｃ冰箱培养３“ｄ，挑取透明圈与菌落直径之比较大的１１株菌株纯化，镜检，保种。
图１．ＡＣ４４４菌株的油镜观察和菌落形态Ｆｉｇ．１．Ｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ５ｏｆｓｔｒａｉｎＡＣ４４４ｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅ矗ｇｕｍｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅ将初步筛选获得的菌株接入摇瓶发酵培养基中，２００Ｃ，２００ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８～７２ｈ，测定酶活，经反复比较后，选用活力最高的菌株作为实验菌株，编号为ＡＣ４４４。
３．１．１．２ＡＣ４４４菌株的形态特征及生化特性ＡＣ４４４菌株在１５０Ｃ、改良２２１６Ｅ培养基上培养７２ｈ后的菌落为圆形，呈乳黄色，表面光滑，中阳Ｊ隆起，有明显的皱褶，不透明。
油镜下细胞呈短杆状，单个排列。
革兰氏染色为阴性，菌体大小为Ｏ．５～０．８ｐｍｘ２～３ｐ．ｍ。
摇瓶中发酵培养，幼龄时呈乳白色，后逐渐变为土黄色，直至红褐色。
有较强烈臭味。
厘［］厶堂亟主逾塞；直拯低凰且工厘酲垂崮夏隆厘黄墨螫接近援物虫吐趔基崮垒搓性珏盔图７几丁质酶基因克隆过程中四轮ＰＣＲ扩增产物电泳分析Ｆｉｇ．７．ＡｇｒｏｓｅｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇｏｆｃｈｉｔｉｎａｓｅＡＴＧＣ从ＣＴＴＡＡＣＣＡｃＧＧＣＡＡＡＴＴＡＴＣＧＡＣＧＴＴＴＡＧｃＧＴＧＴＴＧＴｃｒＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＴＡＡＣＡＭＱＬＮＨＧＫＬＳＴＦＳＶＬＳＬＧＡＶＴＧＧｃＴＧＧＣＡｃＧＣＡＧｃＴＧＴＧＧＡＴＴＧＴＡＣＡＡＡＴＡＴＣＧＣＡＣｃＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＡＴＧＷＨＡＡＶＤＣＴＮＩＡＰＷＯＳＧＰＡＹＡＣＣＧＧＡＧＧＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＧＴＡＴＧＡＧＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＧＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＯＬ０ＫＡＮＴＡＹＥＡＫＷＷＴＱＧＣＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＣＴＧＧＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＣＡＴＧＴＧＡＣＡＮＰＬＥＮＡＧｑＹＱＤＷＬＬＬＤＡＣＤ；，阻ｎ他甜博甜厘［］盍堂亟．！：迨塞！直塑低星凸工豆丝基固丘隆盈萱里蕉鎏近摆物虫！＆型基固蒸搓：睦监五度。
深海适冷菌SM9913产生的低温蛋白酶
深海适冷菌SM9913产生的低温蛋白酶陈秀兰;张玉忠;王运涛;高培基;栾裼武【期刊名称】《海洋科学》【年(卷),期】2001(025)001【摘要】从1855m深的深海泥样中分离纯化得到200多株分泌蛋白酶的适冷菌，其中3株产低温蛋白酶，本文对其中一株Pseudomonassp.SM9913(P.SM9913)生长的适冷性和它产生的蛋白酶的适低温特性进行了研究。
该菌株能够在0℃下正常生长，其最适生长温度为15℃，最高生长温度为35℃。
为一株适冷菌。
该菌株所产蛋白酶的比合成速率在10℃时最高，催化酪蛋白水解的最适温度为35℃，在0℃仍具有3％的酶活力。
最适pH为8.0。
该蛋白酶的热稳定性很低，在40℃保温10min即丧失85％的活力，40℃时的半衰期为6min，为一典型的低温酶。
抑制剂试验表明，该蛋白酶为金属蛋白酶。
%More than 200 psychrotrophilic strains excreting protease were isolated from 1 855 meter deep sea silt and were puri－fied. 3 strains of them excreted psychrotrophilic protease. The psychrotrophilic characteristics of the protease excreted by one of the three strains—— Pseudomonas sp. SM9913(P.SM9913） were preliminarily studied. Strain P. SM9913 could grow at 0 ℃ . The optimum temperature for growth was about 15 ℃ . And the highest temperature for growth was 35 ℃ , which sug gested that stain P. SM9913 was psychrotrophilic. The highest specific synthetic rate of the protease occurred at about 10 ℃ . The optimum temperature of the protease for casin catalysis was 35 ℃ , and the highest protease activity for casincatalysis was at pH8.0. The protease was susceptible to heat treatment, and the half time for the decrease of protease activity was 6 minutes when incubated at 40 ℃ . These results showed that this protease was psychrotrophilic. The activity of the protease was inhibited by EDTA, indicating that this protease belonged to metalprotease.【总页数】5页(P4-8)【作者】陈秀兰;张玉忠;王运涛;高培基;栾裼武【作者单位】1State Key Lab of Microbial Technology, Shandong University,;State Key Lab of Microbial Technology, Shandong University,;State Key Lab of Microbial Technology, Shandong University,;State Key Lab of Microbial Technology, Shandong University,;中国科学院海洋研究所【正文语种】中文【中图分类】Q5【相关文献】1.深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9913的适冷生长机制探讨 [J], 陈秀兰;张玉忠;栾裼武;高培基2.对深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9915分泌不同适冷蛋白酶的研究 [J], 陈秀兰;张玉忠;高培基;栾锡武3.产低温碱性蛋白酶海洋适冷菌SY的筛选 [J], 陈静;王淑军;黄炜;牛天贵;陆兆新4.深海适冷假交替单孢菌Pseudoaltermonas sp.SM9913产适冷蛋白酶的条件优化 [J], 李建伟;潘军;何海伦;陈秀兰;张玉忠;高培基5.离子对深海适冷菌Pseudoalteromonas sp. SM9913胞外蛋白酶分泌的影响[J], 边斐;何海伦;陈秀兰;张玉忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
蛋白酶产生菌的分离、鉴定及发酵条件研究
实验方案设计人：陈龙1．蛋白酶产生菌的分离1. 1 实验材料菌源：酱香型大曲1. 2 培养基的配制细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-25g、水1000ml；称量：分别准确称取上述蛋白胨和NaCl量置于烧杯中，然后加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；牛肉膏用玻璃棒挑取置于小烧杯或是表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯中。
溶化：在上述烧杯中先加少许所需要的水量，将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，让药品完全融化，补充水到所需的总体积。
调PH：在未调PH前，先用PH试纸预测培养基原来的PH，若偏酸用1 mol/L NaOH调节边加变搅拌，并随时用PH试纸检测至PH到7.2。
反之，用0.1 mol/LHCL进行调节。
分装、包扎、灭菌。
霉菌培养基（察氏培养基）：蔗糖30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-25g、蒸馏水1000ml；量取所需水量约2/3左右加到烧杯中，分别称取上述物品依次逐一加入水中溶解，方法同细菌培养基。
分装、包扎、灭菌。
产蛋白酶发酵培养基：葡萄糖20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.0g，Na2CO3 0.1g，自来水100ml PH 9.0（灭菌前）。
pH7．0。
配制方法：称取葡萄糖20g，酵母膏15g置于洁净干燥500ml锥形瓶轻轻摇动，使物料混匀，按上述配方用自来水配制无机盐溶液50ml，调节Ph 9.0,倒入装有物料的锥形瓶中混匀，在0.1Mpa压力灭菌30min。
选择培养基：豆粕粉10．0 g，琼脂15．0 g，蒸馏水1000 mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌30 min。
固体斜面培养基：250mL三角瓶装料12.5g麦麸，麦麸：水=1：1.2，pH自然，121℃灭菌30min。
筛选平板：牛肉膏蛋白胨培养基（配法同上）。
1. 3 试剂和溶液1.3.1 配制生理盐水：分装于250ml锥形瓶，每瓶内装99ml，并装10粒玻璃珠。
蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定
蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定作者刘艳芝指导教师张玲秀（忻州师范学院生物系 1201班 034000）摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃ 。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。
我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。
本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。
对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。
研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。
1、材料及方法：1.1 实验材料与仪器实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
1.2 实验材料：样品：取自忻州师范学院附近的土壤。
试剂：无菌水（带玻璃珠）、100ug/ml 酪氨酸溶液、PH8.0硼酸缓冲液、0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基二、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2，配制200mL酪蛋白培养基：牛肉膏0.3g，酪素 1g，NaCl 0.5g，琼脂2g ，定容于100ml产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氢钾0.03g，碳酸钠0.1g，磷酸氢二钠0.4g，定容于100ml（二）分离1.洗涤培养皿、试管等实验器具，与121℃高压灭菌20min2.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。
适冷海洋细菌交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)MB-1内切葡聚糖酶基因的克隆和表达
［#］ 交替假单胞菌属 （ !"#$%&’()#*&+&,’" ） 是 #CC" 年 根 据
（ .()#*&+&,’" ） 中分离出 #4I -J1K 序列的特点从交替单胞菌属 来的一个新属， 目前已知的交替假单胞菌都是从海洋和湖泊
［$］ ， 最适生长温度在 #"T 左 中分离得到的， 大部分是适冷菌
［D］ 参照 \+9?,.-R 等 （#CC#） 报道， 采用细菌 #4I -J1K 的通
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" 通讯作者。 2+(： 345"6#53644##3； 758/9(： :;<= (9>+) ?@. ) +@. ) AB
［G］ 沁等 报道的方法测定融合酶 ’D0*H,-. 的酶
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结果和分析
$"! !%& ’()* 序列的 +,- 扩增 以细菌 C"*% 染色体 BI. 为模板， 以 >% 和 >$ 为引物进 行 >HJ 扩 增， 得 到 %;?KL 左 右 的 片 段。将 该 片 段 克 隆 到 测序结果表明该扩增片段为 %?%?L&。在 IH"= &MH2*0 载体， 进 行 "#.D0，结 果 显 示 它 与 交 替 假 单 胞 菌 属 （ ()*+,#-$.*/#0#1-) ） %ND OBI. 序 列 同 源 性 可 达 GG: 。结 合 将其鉴定为交替假单胞菌属的一个种， C"*% 的形态学特征， 命名为 ()*+,#-$.*/#0#1-) P&! C"*%。目前大部分交替假单胞 菌都是从海水中分离到的， 绝大部分是适冷菌， 最适生长温 度在 %?9 左右， C"*% 的特征与它们相吻合。 将 ()*+,#-$.*/#0#1-) P&! C"*% 的 %ND OBI. 序 列 在 比对结果用 H-RPSQ-T 在线绘制 ’,6"Q6K 中进行了同源比较， 了系 统 发 育 树。 结 果 表 明 ()*+,#-$.*/#0#1-) P&! C"*% 与 ( ! %))-"2*13#1%% 的进化关系最近。 $"$ 内切葡聚糖酶基因 !"#$ 序列的 +,- 扩增 以 >7 以 ()*+,#-$.*/#0#1-) P&! C"*% 染色体 BI. 为模板， 和 >/ 为引物进行 >HJ 扩增， 得到 %;?KL 左右的片段。将该 片段克隆到 &’()*/0*% 表达载体上， 测序结果表明该扩增片 段 为 %?18L&。 在 IH"= 进 行 "#.D0，结 果 表 明 它 与 ()*+,#-$.*/#0#1-) 2-$#4$-1".%) 的 "*$5 基 因 和 ()*+,#-$.*/#0#1-) 证明克隆到正确 P&! BU*7 的 "*$6 基因同源性均在 G7: 以上， 的基因。将该基因命名为 "*$7 ， 将构建的融合型表达质粒命 名为 &’()*+,-.。 利用 >O52,O?;1 分析 "*$7 ， 结果显示该序列编码 /G$ 个氨 基酸， 推导的蛋白质理论分子量为 ?7KB 左右。利用自动蛋 白质同源模建服务器 （ DT=DD*CVB(#） ， 模建了 H,-. 的三维结 构。模建结果表明 H,-. 包含两个大的结构域， 即催化结构 域和 底 物 结 合 结 构 域， 通 过 蛋 白 质 序 列 比 对， H,-. 和 而根据 ()*+,#-$.*/#0#1-) 2-$#4$-1".%) 的 H,-’ 同源性高达 G/: ， 的报道， 底物结合结构 W5@-@S 等 %1（$117） H,-’ 由催化结构域， 域和链接区组成， 其催化结构域属于糖基水解酶家族的第 ? 族， 因此判断 H,-. 的催化结构域同样属于糖基水解酶家族 判断其 % X $8 氨基酸序 的第 ? 族。结合 H,-. 同源模建结果，
低温蛋白酶综述
低温蛋白酶的研究进展与应用前景摘要：论文从来源，特征，研究方法等方面阐述了低温蛋白酶的研究进展以及其在洗涤剂、食品、废水处理等工业上的应用前景。
关键字：蛋白酶；低温蛋白酶；低温菌Abstact:The paper analyze the development of alkaline cold-active protease from their origin, characteristics, approaches of research and so on. These psychrotrophilic proteases have great potential in the industries of detergent, food, waste water treatment.Key words: protesse; alkaline cold-active protease; psychorophilic bacteria蛋白酶是目前应用最多的酶，占工业水解用酶的60%左右。
目前工业上应用的蛋白酶多数为中温蛋白酶，最适产酶温度在30-35℃，最适酶活在50℃左右。
已广泛应用于洗涤剂、饲料、皮革、食品加工等行业中[1]。
低温酶是指最是催化温度在30℃左右，在0℃仍有一定催化效率的酶，主要有嗜低温菌（psychropiles）和耐低温菌（chrotrophiles）产生。
这些菌的最适生长和产酶温度一般在20℃[7]。
低温蛋白酶具有产酶温度低，最适酶活温度低，在低温下具有更高的催化效率等特点，因而在洗涤剂、饲料、皮革、食品加工上又中温蛋白酶无法取代的优越性，也越来越受到人们的重视。
自70年代以来，世界上已有许多实验室在从事低温蛋白酶的研究，有些低温蛋白酶已用于工业生产。
如由美国华盛顿大学州立大学的海洋微生物学家研究的嗜碱性蛋白酶应用于洗涤剂工业，改变了欧洲传统的热水洗涤方式，节约能源，使加酶洗涤剂在冷水洗涤中发挥显著的效益。
蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究
蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【摘要】以酪蛋白水解圈为筛选标记，在以酪蛋白为唯一氮源的平板上，从土壤中分离筛选到3株高产蛋白酶的菌株，经形态学鉴定和16S rRNA分析，将其分别鉴定为Bacillus sp．G1、Bacillus sp．G2、Stenotrophomonas sp．V1。
将这3株菌株的发酵液通过硫酸铵分级沉淀初步纯化后，其比酶活分别为22．21、19．10和16．03 U／mg。
菌株Bacillus sp．G1和Ba-cillus sp．G2所产蛋白酶的最适反应温度和最适反应pH值均为40℃和7．0；菌株Stenotrophomonas sp．V1所产蛋白酶的最适反应温度为70℃，最适酶反应pH值为7．5。
%Three bacteria strains producing protease were screened and isolated from soil by observation of clearing zones on casein agar plates, based on phenotypic and 16S rRNA gene phylogenetic analysis, G1, G2 and V1 were preliminary classed and named as Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1.Bacill us sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were all aerobic strains.The proteases from Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were purified by the methods of ammonium sulfate precipitation, the specific activities of three proteases were up to 22.21 U/mg, 19.10 U/mg and 16.03 U/mg, respectively.The enzymes from Bacillus sp.G1 and G2 were optimally active at 40℃and in 20 mmol/L phosphate buffered saline buffer( PBS, pH 7.0) , and the alkaline protease from Stenotrophomonas sp.V1 was optimally active at 70℃and in 20 mmol/L PBS buffer ( pH 7.5) .【期刊名称】《江西农业学报》【年(卷),期】2016(028)004【总页数】7页(P32-38)【关键词】蛋白酶;筛选;鉴定;酶学特性;Bacillus sp.G1;Bacillussp.G2;Stenotrophomonas sp.V1【作者】赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【作者单位】江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045【正文语种】中文【中图分类】TQ925.2蛋白酶(Protease, EC 3.4)属于水解酶类,是最重要的三大工业用酶之一,销售额约占全球酶制剂市场的60%[1],被广泛应用于食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业,在我国国民经济的发展中起着重要的作用[2]。
碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件初探
碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件初探高玉千，李林柯，刘琦（河南农业大学生命科学学院，郑州，450002）摘要：从四个不同地点采集的土壤样品中，平板分离初筛到9株蛋白酶产生菌，进一步复筛得到一株高产且稳定的碱性蛋白酶菌株B4，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
实验证明其最佳产酶pH8.5，水解温度53℃，发酵时间60h，为下一步进行碱性蛋白酶基因的克隆和诱变奠定基础。
关键词：枯草芽孢杆菌，碱性蛋白酶，筛选Studies on Isolation of Alkaline ProteaseGao Yu-qian, Li Lin-ke, Liu Qi(College of Life Sciences, Henan Agriculture University, Henan, Zhengzhou, 450002) Abstract：9 producing alkaline protease strains were isolated from soil samples, within one strain named B4 was selected and identified as Bacillus subtilis.The optimum conduction for the protease producing consisted of pH8.5, 53℃ and after 60h fermentation. The research could do good preparation for the clone and the mutagenesis of the protease-gene.Keyword：Bacillus subtilis alkaline protease screening蛋白酶是一种重要的酶制剂，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
20世纪末国际市场上商品蛋白酶多达80多种，其销售额占酶制剂总销售额的60%以上，而微生物碱性蛋白酶又占了整个蛋白酶40%左右的市场份额，被认为是最重要的应用型酶类[1]。
产蛋白酶菌株的分离
产蛋白酶菌株的分离一、教学目标及基本要求1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。
由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。
2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。
利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。
有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。
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摘
要 ： 过 酪蛋 白平 板 法从 实验 室极 地 微 生 物 资 源 库 中 筛 选 到 １０株 在 低 温 条 件 （ 通 ３ ４℃ ） 具 有 蛋 白酶 活性 的 菌 下
ｆｏ ｔ ｅ ｐ ｌｒｍｉｒ ｂ ａ ｅ ｏ ｒ ｅ ｙ ａ ｃ ｓ ｉ ｌｔ ｔ ｏ ｒｍ ｈ ｏ ａ ｃ ｏ ｉｌｒ ｓ ｕ ｃ ｓ ｂ ａ ｅｎ ｐ ａｅ ｍｅｈ ｄ， ａ ｄ ｔ ｅ ｐ ｙ ｏ ｅ ｅ ｉ ｎ ｌｓｓ ｏ ｈ ｔａ ｎ ｎ ｈ ｈ ｌｇ ｎ ｔ ａ ａｙ ｉ ｆ ｔ ｅ ｓｒ ｉ ｓ ｃ ｗｉ ａ ｇ ｒｃ ｓ ｉ ｙ ｒ ｌｚ ｔｏ ａ ｏ ｓｃ ｒｉ ｄ ｏ ｔ Ｔ ｅ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔ８ ｉｏａｅ ｔ ｉｈｅ ｒｔ — ｔ ｌｒｅ ａ ｅｎ ｈ ｄ ｏ ｙ ａｉｎ ｈ ｌｓｗａ ａｒｅ ｕ ． ｈｅｒ ｓ ｌｓｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｓ ｌｔ ｓｗｉ ｈ ｇ ｒｐ ｏｅ ｈ ｈ ａ ｅ ａ ｔ ｉ ｅｏ ｇ ｄ ｔ ｅ ｄ ａ ｔｒｒｏ ａ ，５ ｗｅｌ，Ｓ ｅ ｎ Ｕａ ａ ｄ Ｐｓ ｃ ｏ ａ ｔｒ ｅ ｐ ｃｉｅ ｙ Ｂ ｓｎ ｓ ｃｉ ｔ ｂ ｌ ｎ ｅ ｏＰｓ ｕ ｏ ｌ ｏｎ ｎ ｓ ｂｌ ｌ ｖｙ ｅ ｉ ｈ ｗａ ｅ ｎ ｙ ｈｒｂ ｅｅ ，ｒ ｓ ｅ ｔｖ ｌ ． ｙ ｕ ｉ ｇ
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文献标 志码 ： Ａ
文章编号 ：６ ２—３７ （Ｏ Ｏ ０ ０ ５ ０ １７ ６ ８ ２ Ｌ ）２— ０ ５— ６
Ｓ ｒ ｅ ｎ ｆ ｃ ｌ ａ ｔｖ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｎ ｒ ｍ ｌ ｒ ｍ ｉ ｒ ｏ ｇ ｎ ｓ ｎｄ ｐａ ｔａ ｃ ｅ ｎｉ ｇ ｏ ｏ ｄ・ ｃ ｉ ｅ ｐｒ ｔ ａ ｅ ｓ ｒ ｉ ｓ ｆ ｏ ｐｏ ａ ｃ ｏ ｒ ａ ｉｍ ａ ｒ ｉ ｌ
产 低 温 蛋 白酶 极 地 菌 株 的 筛 选 及 Ｐ ｅ ｄ ａｔｒｍｏ ａ ｐ Ｑｌ１产 蛋 白酶 粗 酶 性 质 ｓｕ ｏ ｌ ｏ ｎ ｓｓ ． ・ ｅ
徐 国英 林 学政 王 能飞 ， 一， ， 朱启 忠
（ ．山东 大学 威海分 校 海洋 学 院 ， １ 威海 ２ ４ ０ ； ６ ２ ９
最适 反 应 ｐ 为 ｌ． ； 化 作 用 不 需要 金 属 离子 的参 与 ； 稳 定性 极 差 ， ６ Ｈ ０ ０ 其催 热 在 ｏ℃放 置 １ ｉ 完 全 失 活。 ５ｒ ｎ即 ａ 关键 词 ： 温 蛋 白酶 ； 学性 质 ； 低 酶 系统 发 育 分 析 ； 地 微 生物 极
中图分类号 ：９ Ｑ４
株 ， 对部 分 酪 蛋 白水 解 圈较 大 的 菌株 进行 了酶 活 测 定和 系统 发 育 分析 。 发 现 酶 活 较 高的 ８ 菌 分 别 属 于 假 交 替 单 并 株
胞菌属（ ｓ ｄａｔ ｏ ｏａ ）科 尔韦尔氏菌属 （ ｏ ｅｉ）希 瓦氏茵属（ ｈｗ ｎｌ ） 嗜冷杆 菌属（ ｓｃｒｂｃ ｒ 。选择 Ｐｅ ｏ ｌｒｍ ｎ ｓ 、 ｕ ｅ Ｃ ｌ Ｕａ 、 ｗ Ｓ ｅａ ｅａ 、 ｌ Ｐｙｈｏａｔ ） ｅ 低温蛋 白酶－ ｌ较 高的菌株 Ｐｅｄ ａ ｅ ｍ ｎｓｓ．Ｑ 一 活｝ 生 ｓｕｏｌｒ ｏａ ｐ Ｉ ｔｏ １为研 究对象， 以酪蛋 白为反应底 物对其所产低 温蛋 白酶粗酶 酶性质进行初 步研究。结果表 明：Ｉ１ Ｑ 一 低温蛋 白酶酶 活最适反 应温度为 ４ ｏ℃， ０℃ 时保持 １％的相对酶 活， 在 ０ 酶活
（ ．Ｍ ｒ ｅＣ ｌｇ ，ｈｎｏｇＵ ｉｅ ｉ ｔ ｉａ， ｉ ｉ ６２９ Ｃ ｉａ １ ａ ｎ ｏ ｅｅＳ ａｄｎ ｎｖｒ ｔ ａ Ｗｅ ｉ Ｗｅ ａ ２ ４０ ， ｈｎ ； ｉ ｌ ｓｙ ｈ ｈ ２ Ｋ ｙＬｂｒｔ ｙｏ ａｉ ｉ ｃｖ ｕ ｓ ｎｅ ， ｓ Ｉｓｔｔ ｏ ｃａｏｒｐ ｙ Ｓ Ａ， ｉ ｄｏ２６６ ，Ｃ ｉａ ． ｅ ａ ｏ ｏ ｆ ｒ ｅＢｏ ｔ ｅＳｂｔ ｃｓｎｒ ｎｔｕｅ ｆ ｅｎ ｇ ｈ ， Ｏ Ｑｎ ａ ６０ １ ｈ ） ａｒ Ｍ ｎ ａｉ ａ ｔ ｉ Ｏ ａ ｇ ｎ
第 ８卷 第 ２期
２１ ０ ０年 ３月
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工 Ｎｏ ２
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