家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的原核表达

９０　微生物学杂志　２０１１年７月第３１卷第４期ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ　Ｊｕｌｙ　２０１１　Ｖｏ１．３１　Ｎｏ．４　

家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白ＧＰ６４的原核表达　

李国辉，唐　琦，胡朝阳，陈慧卿　

（江苏大学生命科学研究院，江苏镇江２１２０１３）　

摘　要　通过Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０设计ｌ对特异性引物，用于扩增家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白ＧＰ６４的部分　ＤＮＡ片段，对ＰＣＲ扩增得到的ＤＮＡ片段进行纯化，并对纯化后的双酶切ＤＮＡ片段与经同样双酶切后的原核　表达载体ｐＥＴ２８ａ进行连接；对捕获有重组质粒ｐＥＴ２８ａ—ＧＰ６４的大肠埃希茵ＢＬ２１（ＤＥ３）细胞进行ＩＰＴＧ诱导，　通过ＳＤＳ．ＰＡＧＥ对诱导产物进行电泳分析，结果表明扩增的目的片段获得了表达；通过Ｈｉｓ单抗对诱导产物进　行Ｗｅｓｌｅｒｎ　Ｂｌｏｔ印迹分析，其结果表明诱导蛋白带为融合有组氨酸的目的蛋白。对原核表达的ＧＰ６４截短蛋白　

和免疫佐荆进行充分研磨，将充分研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射，以制备的ＧＰ６４多抗对家蚕　核型多角体病毒粒子感染的ＢｍＮ细胞总蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ印迹分析，结果在杂交膜上出现一条特异杂交　带、其分子量大小约为６４　ｋｕ，表明制备的ＧＰ６４多抗可用于其功能的进一步研究。　关键词　家蚕核型多角体病毒；ＧＰ６４基因；ＧＰ６４蛋白；原核表达；抗体制备　

中图分类号Ｑ７８６　文献标识码Ａ　文章编号ｌＯ０５—７０２１（２０１１）０４—００９０一Ｏ５　

Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｉｌｋ　Ｗｏｒｍ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒ）　

ＮｕｃｌｅＯｐＯｌｙｈｅｄｒＯｖｉｒｕｓ　ＧＰ６４　Ｇｅｎｅ　

ＬＩ　Ｇｕｏ—ｈｕｉ，ＴＡＮＧ　Ｑｉ，ＨＵ　Ｚｈａｏ—ｙａｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｈｕｉ—ｑｉｎｇ　

（Ａｃａｄ．ｏｆＬｉｆｅ　Ｓｃｉ．，Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｕｎｉ．，Ｚｈｅｎｆｉａｎｇ　２１２０１３）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ａｍｐｌｉｆｙ　ａ　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｉｌｋ　ｗｏｒｎｌ　ＢｍＮＰＶ　ＧＰ６４　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｉ—　ｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｔａｒｇｅｔ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ２８ａ　ｗａｓ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔＯ　ｄｏｕｂｌｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＥｃｏＲＩ　ａｎｄ　ＨｉｎｄＩＩＩ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｔｈｅ　ｌｉｇａｔｉｏｎ；Ｅ．ｃｏｉｌ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｔ　ｈａｄ　ｃａｕｇｈｔ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＥＴ２８ａ・ＧＰ６４　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｗｉｔｈ　ＳＤＳ・－　ＰＡＧＥ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｔａｒｇｅｔ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　６×Ｈｉｓ　ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｈａｄ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂａｎｄ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｌｅｎｄｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ．Ｔｈｅ　ｃｕｔ　ｓｈｏｒｔ　ｐｍｋａ￣ｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＧＰ６４　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ　ｗｅｒｅ　ｆｕｌｌｙ　ｇｒｏｕｎｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｕｌｌｙ　ｇｒｏｕｎｄ　ｅｖｅｎ　ｐｌａｓｍａ　ｗａｓ　ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃａｌｌｙ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｋｕｎｍｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ａｔ　ｍｕｌｔｉ—ｐｏｉｎｔ．Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ＢｍＮ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＢｍＮＰＶ　ｗａｓ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ｒａｉｓｅｄ　ＧＰ６４　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ．Ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂａｎｄ　ｗｉｔｈ　ａｂｏｕｔ　６４　ｋｕ　ａｐｐｅａｒｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｈｙｂｒｉｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ＧＰ６４一ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ；ＧＰ６４　ｇｅｎｅ；ＧＰ６４　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｅｐａ—　

ｒａｔｉｏｎ　

家蚕核型多角体病毒（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　ｎｕｃｌｅ—　ｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ，ＢｍＮＰＶ）是昆虫杆状病毒科核多　

角体病毒属的代表成员，该病毒是具有囊膜包被　的双链环状ＤＮＡ病毒，其基因组为１２８　ｋｂ，理论　

预计有１３６个开放阅读框（编码具有６０个氨基酸　以上的ＯａＦ，Ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）…。研究报道　

基金项目：高级人才启动基金（０９ＪＤＧ０５７）　作者简介：李国辉男，博士，助理研究员。主要从事病毒分子生物学及基因工程研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｇｕｏｈｕｉｊｎｌ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ　收稿日期：２０１１－０７－０５；修回日期：２０１１－０７－

２５　４期　李国辉等：家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白ＧＰ６４的原核表达　９１　

ＢｍＮＰＶ宿主范围域较窄，主要感染家蚕卵巢组织　

来源的ＢｍＮ细胞系，而不能在草地贪叶蛾卵巢组　

织来源的Ｓｆ２１或者Ｓ　细胞系以及粉纹夜蛾胚胎　

来源的Ｈｉ５细胞系中有效地增殖　。ＢｍＮＰＶ在　

其生活史中会出现２种典型的病毒粒子：出芽型　

病毒粒子ＢＶ和包埋型病毒粒子ＯＤＶ。ＯＤＶ病　

毒粒子介导家蚕个体之间的传播；而ＢＶ病毒粒　

子介导家蚕体内细胞以及体外培养细胞之间的传　

播。ＢＶ与ＯＤＶ在遗传组成上相同，它们表型不　

同主要体现在病毒囊膜蛋白组分上的差异，其中　

ＧＰ６４蛋白是ＢＶ病毒粒子囊膜上的一种特有结　

构蛋白　。ＧＰ６４蛋白是病毒囊膜上的一个糖蛋　

白，在病毒感染宿主的过程中，该蛋白能够介导　

ｐＨ引发的病毒与宿主之间的膜融合；ＧＰ６４蛋白　

对于病毒粒子的出芽和感染性病毒粒子的产生也　

是必需的；近来研究表明该蛋白与宿主细胞膜上　

的受体结合区主要定位在ＧＰ６４蛋白的Ｎ端　引。　

ＧＰ６４蛋白也是Ｉ型ＮＰＶ与Ⅱ型ＮＰＶ之间的一　

个分类依据，尽管Ⅱ型ＮＰＶ中不存在ＧＰ６４的同　

源蛋白，但在Ⅱ型ＮＰＶ中存在与ＧＰ６４蛋白功能　

类似蛋白　…。ＧＰ６４（ＢｍＮＰＶ　ＯＲＦ１０５）基因是　

Ｉ型ＮＰＶ中的一个高度保守基因，其中ＢｍＮＰＶ　

ＧＰ６４蛋白与苜蓿丫蚊夜蛾核多角体病毒（ＡｃＭＮ．　

ＰＶ）ＧＰ６４蛋白一致性高达９５％；ＧＰ６４基因位于　

ＢｍＮＰＶ基因组９９　８４４～１０１　４３６　ｎｔ之间，阅读框　

全长１　５９３　ｂｐ，编码５３０个氨基酸，预计分子量６４　

ｋｕ，故命名为ＧＰ６４蛋白　’“　。为了深入研究　

ＢｍＮＰＶ　ＧＰ６４基因在病毒感染过程中的具体功　

能，通过ＰＣＲ扩增ＢｍＮＰＶ　ＧＰ６４基因中的９０４　ｂｐ　

ＤＮＡ片段，其编码的蛋白理论分子量大小为３４　

ｋｕ，通过原核表达系统成功地表达了ＢｍＮＰＶ　

ＧＰ６４截短蛋白，对表达的目的蛋白进行割胶纯化　

并免疫昆明小鼠，进而获得了ＧＰ６４多克隆抗体，　

为深入研究ＢｍＮＰＶ　ＧＰ６４蛋白在病毒侵染过程　

中的具体功能以及为病毒基因组其他基因的功能　

研究提供了依据。　

１　材料与方法　

１．１　材料　

１．１．１　实验材料ＢｍＮ细胞、野生型ＢｍＮＰＶ、　

克隆菌株大肠埃希菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５ｃｔ和　

表达菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）由本室保存；原核表达载体　ｐＥＴ－２８ａ质粒购于Ｎｏｖａｇｅｎ公司。雄性昆明小鼠　

购自江苏大学动物实验中心。　

１．１．２培养基　大肠埃希菌的培养采用常规固　

体或液体ＬＢ培养基；ＢｍＮ细胞培养于ＴＣ一１００培　

养基（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）辅以１０％胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ　

ＢＲＬ）。　

１．１．３　主要试剂　限制性内切酶ＥｃｏＲ　Ｉ、饿ｎｄ　

１１Ｉ、２５０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ　Ｍａｒｋｅｒ、蛋白质低分子量　

Ｍａｒｋｅｒ、Ｔａｑ酶购自ＴａＫａＲａ公司；蛋白质预染　

ＭａｒｋｅｒⅢ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；质粒提取和胶回收　

试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公司；丙烯酰胺和Ｎ，Ｎ．亚甲　

基双丙烯酰胺购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；Ａｎｔｉ．Ｈｉｓ单抗购　

自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＨＲＰ标记的羊抗鼠二抗购自　

武汉博士德公司；ＤＡＢ底物显色试剂盒购自北京　

康为世纪生物公司；弗氏完全佐剂和不完全佐剂　

购自Ｓｉｇｍａ公司。　

１．１．４　仪器ＰＣＲ仪（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｅｐ・　

ｐｅｎｄｏｆｆ）；Ｇｅｌ　Ｄｏｃ　２０００凝胶成像系统（美国Ｂｉｏ．　Ｒａｄ公司）；聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质转印系　

统（美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司）。　１．２方法　

１．２．１　ＢｍＮＰＶ基因组ＤＮＡ的提取ＢｍＮＰＶ基　

因组ＤＮＡ纯化参照文献［１２］。　

１．２．２　引物设计及ＰＣＲ参照ＢｍＮＰＶ基因组　

全序列…，通过Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０软件设计２条　

特异性弓Ｉ物：ＧＰ６４．Ｆ：５　．ＡＴ　ＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＧＴＣＡ　

ＴＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＧＡ和ＧＰ６４－Ｒ：５　．ＧＣ　ＡＡＧＣＴＴＣ　

ｃＡＡＧＴＧＧＧＧＴＧＧｃｃＧ－３　，引物２端分别引人了　

ＥｃｏＲ　Ｉ和胁ｎｄ　ｌｌＩ酶切位点。以提取的ＢｍＮＰＶ　

Ｂａｅｍｉｄ为模板，用引物ＧＰ６４－Ｆ和ＧＰ６４．Ｒ进行　

ＰＣＲ扩增，扩增的目的片段理论大小为９０４　ｂｐ，　

反应条件：９４℃预变性４　ｍｉｎ，９４℃变性４０　ｓ、５５　

℃退火４０　ｓ、７２℃延伸４０　ｓ，３２个循环，最后７２　

℃延伸１０　ｍｉｎ，于４℃保存备用。　

１．２．３　ＧＰ６４截短蛋白的表达载体构建　将　

ＧＰ６４－Ｆ和ＧＰ６４一Ｒ引物对扩增的ＤＮＡ片段进行　

ＥｃｏＲ　Ｉ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，对酶切纯化后的ＤＮＡ　

片段与经同样双酶切的原核表达载体ｐＥＴ２８ａ进　

行连接，将连接产物转化ＤＨ５ａ感受态细胞，对平　

板上的克隆进行鉴定，对目的重组质粒命名为　

ｐＥＴ２８ａ・ＧＰ６４。胶回收按照试剂盒操作说明进　

行；质粒提取、酶切、连接、转化等步骤参照文献

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杆状病毒SpltMNPV gp41基因的克隆、表达及抗体制备

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2004,12(6):676~679

*基金项目：国家重点基础研究与发展规划（973）项目（No.G2000016209）资助。潘丽晶：女，1976年生，博士研究生。E-mail:.**通讯作者。Authorforcorrespondence.E-mail:.收稿日期：2003-11-24接受日期：2004-02-22·研究论文·杆状病毒SpltMNPV基因的克隆、表达及抗体制备*潘丽晶李朝飞尹崇吕雷庞义**（中山大学生物防治国家重点实验室，广州510275）摘要：GP41是杆状病毒包埋型病毒粒子（，ODV）特有的糖蛋白，它介导芽殖型病毒粒子（，BV）的核衣壳通过胞核。用PCR方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（，SpltMN-PV）基因,并将其克隆至5′端有6伊His编码序列的原核表达载体pQE30上，转化大肠杆菌()M15[pREP4]，在1mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的1个37.9kD融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔制备了特异的抗GP41抗体。Western印迹分析表明，该抗体适合进一步分析SpltMNPVGP41蛋白。关键词：斜纹夜蛾核多角体病毒；基因；原核表达；抗体CloningandExpressionofnucleopolyhedrovirusGeneinandPreparationofItsAntibodyPANLi-JingLIZhao-FeiYINChongLVLeiPANGYi**（StateKeyLaboratoryforBiocontrol,ZhongshanUniversity,Guangzhou510275,China）GP41,amajorglycoprotein,hasbeenidentifiedinthe（ODV）ofbaculoviruses,whichwasre-quiredfortheegressofnucleocapsidsfromthenucleusinthepathwayofthe（BV）synthesis.TheORFof（SpltMNPV）genewasobtainedbyPCRmethodfromSpltMNPVgenomicDNA.ThePCRproductwasclonedintopMD18-Tvectortogettherecombinantplasmid（）.Thegenewasrecombinedwithprokaryot-icexpressionvectorpQE30andtransformedintoM15[pREP4].TheM15[pREP4]strain,containingrecombi-nantplasmid,expresseda37.9kD6伊His-tagfusionproteinafterinductionwith1mmol/LIPTG(isopropylthio-β-D-galactoside).ThefusionproteinwaspurifiedwithNi-NTAresincolumnandusedastheimmunogentoraiseaGP41-specificantibody.WesternblottinganalysisindicatedthattheantibodywassuitabletobeusedforfurtheranalysisofGP41protein.;gene;prokaryoticexpression;antibody杆状病毒（baculovirus）是主要感染昆虫的一类双链环状DNA病毒，在应用上主要是作为重要的无公害生物杀虫剂及外源基因高效表达载体[1]。该类病毒根据其包涵体的形态可分为2个属，核多角体病毒属（，NPV）和颗粒体病毒属（，GV）。在NPV的生活史中存在两种完全不同形态的病毒———包埋型病毒粒子（，ODV）和芽殖型病毒粒子（，BV）。这两种病毒粒子在它们的糖蛋白组成上具有明显差异，其中GP64（GP67）是BV囊膜特有的和主要的糖蛋白，它在介导病毒与细胞之间的膜融合过程中起着重要作用[2]；而GP41是ODV独有的糖蛋白，在BV中没有发现GP41的存在[3]。研究表明，在BV合成中，GP41介导BV的核衣壳通过胞核[4]。斜纹夜蛾核多角体病毒（nu，SpltMNPV）是杆状病毒科多粒型核多角体病毒属的成员，对主要的农业害虫斜纹PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建第6期潘丽晶等:杆状病毒SpltMNPV基因的克隆、表达及抗体制备夜蛾（）具有特异高效的防治效果，已被本实验室开发成为商品化的杀虫制剂（注册商品名为“虫温一号”）。最近，我们完成了SpltMNPV基因组全序列的测定[5]，发现在该病毒中也存在基因。为了深入研究基因的功能，本研究在中高效表达了SpltMNPVGP41蛋白，并利用纯化的蛋白免疫家兔，制备了多克隆抗体，这为进一步研究GP41在杆状病毒侵染过程中的作用提供了基础。1材料和方法1.1材料和试剂1.1.1昆虫、病毒、菌种、质粒和细胞斜纹夜蛾（）幼虫由本实验室养虫室提供，用人工饲料于27~28℃饲养[6]。野生型斜纹夜蛾核多角体病毒G2株为本室分离的广州毒株。大肠杆菌()菌株TG1为本室保存。克隆载体pMD18-T（TaKaRa），表达载体pQE30和菌株M15[pREP4]购自QIAGEN公司。斜纹夜蛾细胞（Sl-zsu-1）培养于TC100培养基[7]（GibcoBRL），辅以10％胎牛血清（GibcoBRL）。1.1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺为Promega产品；DNA分子质量、蛋白质分子量标准、碱性磷酸酶底物NBT和BCIP、IPTG和X-gal等试剂均为华美生物工程公司产品；DNA回收试剂盒为Omega公司产品；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自GibcoBRL公司；6伊His-tag表达和纯化试剂盒购自Qia-gen；其它试剂为国产分析纯。1.2方法1.2.1SpltMNPV基因组DNA的制备SpltMNPV基因组DNA纯化主要参照文献[8]。在适量的多角体悬液（108～109PIB/mL）中，加入等体积的碱裂解液（0.1mol/LNa2CO3，0.15mol/LNaCl，pH10.5），37℃，裂解15min，12000r/min离心5min，除去不溶物质。取上清用酚、酚/氯仿（体积比为1颐1）和酚/氯仿/异戊醇（体积比为25颐24颐1）依次轻柔抽提，上清用2.5倍95％乙醇沉淀DNA，70％乙醇淋洗DNA沉淀，晾干后，溶于TE[10mmol/LTris（pH8.0），1.0mmol/LEDTA]中，4℃储存备用。1.2.2引物设计及PCR根据SpltMNPVG2株基因组全序列（GenBankaccessionNo.AF325155），运用DNASTAR软件，设计1对扩增SpltMNPV基因全长读码框的引物。上游引物SP1：5'-GGATCCATGAACAACGGTG-3'；下游引物SP2：5'-AAGCTTTCCAAATTCACTGCTGCTG-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为50滋L，模板为SpltMNPV基因组DNA，扩增条件为：95℃变性5min，50℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后延伸10min。1.2.3SpltMNPV基因原核表达质粒的构建原核表达质粒的构建策略如图1所示。质粒提取、酶切，DNA片段回收、连接、转化等按文献[9]略加修改进行。用引物SP1和SP2以SpltMNPV基因组DNA为模板进行扩增后的产物连入pMD18-T克隆载体，连接产物转化TG1，经序列测定后，以H玉和d芋酶切，回收并纯化，再连入pQE30，转化TG1，得到重组表达质粒。重组质粒pQE-SL经酶切鉴定后，进一步用pQE30测序引物，经ABIPRISM377（ersion3.3）自动分析仪进行测序鉴定。

家蚕四角形核型多角体病毒的研究(Ⅳ)多角体的结构及化学组成

贡成良;卢铿明

【期刊名称】《广东蚕业》

【年(卷),期】1991(000)001

【摘要】运用电子显微镜、氨基酸分析等电聚焦技术对四角形多角体的结构与组成进行了分析,并在同等条件下与六角形多角体进行了比较。结果表明:四角形多角体与六角形多角体的表面结构存在差异。四角形多角体外层电子密度较低,有一厚度为1500A°的中间层,多角体蛋白结晶以平行四边形排列,晶格距离为48A°。多角体蛋白的分子量约为29000dolt,同六角形多角体蛋白相比,四角形多角体蛋白的Gly.Tyx含量相对较高,Glu的含量则较低,胰酶酶切电泳扫描图两多角体蛋白间存在差异,其外多角体蛋白中某些金属元素的含量,对酸、碱的溶解性、两多角体蛋白间也存在差异。

【总页数】4页(P39-42)

【作者】贡成良;卢铿明

【作者单位】[1]华南农业大学;[2]华南农业大学;苏州蚕桑专科学校工作

【正文语种】中文

【中图分类】S88

【相关文献】 1.广西不同蚕区家蚕核型多角体病毒对家蚕致病力的研究 [J], 黄深惠;石美宁;唐亮;黄旭华

2.家蚕核型多角体病毒多角体的快速提取方法 [J], 李俊;屈达才;邱靖芸

3.家蚕四角形质型多角体病毒的研究 [J], 徐兴耀;谭佩婵;李兆平

4.家蚕核型多角体病毒四方形多角体突变株多角体蛋白基因的DNA序列分析 [J],

储瑞银;王清华;林玉莲;潘乃穟;陈章良

5.家蚕核型多角体病毒四角形多角体的研究 [J], 贡成良;卢铿明

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家蚕bmnpv表达系统表达霍乱毒素b亚单位及其与多角体蛋白的融合体的研究

浙江大学硕士学位论文家蚕BmNPV表达系统表达霍乱毒素B亚单位及其与多角体蛋白的融合体的研究姓名：***申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张耀洲;金勇丰20030501致谢

本论文是在导师张耀洲教授及金勇丰副教授的悉心指导下完成的。张耀洲教

授渊博的学识、严谨的治学态度、富于开拓性的思维和果敢的作风，都将使学生

终身受益匪浅。值此论文完成之际，谨向诸位导师表示诚挚的感谢。同时，要特

别感谢金勇丰副教授、朱成钢博士在实验期间所给予的悉心指导、关心和启发，

以及实验工作的完成所倾注的心血。

本论文全部工作均在浙江大学生物化学研究所完成，三年的学习与工作时光飞

逝而过，难以忘怀求学过程中生化所老师、同学的关心与支持。谨此感谢生化所

的史锋副教授、邵爱萍老师、钱震虹老师、朱健红老师、章骥老师等在实验中所

给予的指导和方便；同时也要感谢浙江博联生物技术中心的毛黎娟、徐渊、朱莹萍、钱清丽等的大力支持。

本论文的顺利完成离不开生化所已毕业的研究生王莹飞、赵秀玲、杨瑞

丽的无私帮助；离不开生化所同窗们的大力支持与合作，感谢金荣仲、朱立成、陈健、张文波、郭冬生、任爱霞、肖海龙、龚朝辉、徐颖、边腾飞

等研究生：还有我们２０００级龚贺华、马长安、毛立罡、朱～望、张文伶、

王丽鸳等硕士的团结帮助，在这样～个团结、互助的群体中，我感到了大

家庭的温暖。此外，要特别感谢中科院上海生物化学与细胞研究所的吴祥甫研究员老师在我的实验中给予的无私帮助。

最后，谨向参加本文评阅、答辩的各位专家致以最诚挚的感谢！

．‘１．任学毅

浙江大学生物化学研研究所

二零零三年五月中文摘要

霍乱毒素（ｃｈ０１ｅｒａｔｏｘｉｎ，ｃＴ）由两个亚单位组成，即Ａ亚单位（ＣＴＡ）和

Ｂ亚单位（ＣＴＢ）。Ａ亚单位是霍乱毒素的活性部分，Ｂ亚单位的主要功能是与有核

细胞上的神经结苷脂ＧＭｌ结合而使得Ａ亚单位进入细胞，Ｂ亚单位无毒性，具有

很强的免疫原性，能刺激机体产生黏膜ＩｇＡ和血清ＩｇＧ抗体。它在免疫佐剂、口

家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的原核表达

家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白ＧＰ６４的原核表达　

李国辉，唐　琦，胡朝阳，陈慧卿　

（江苏大学生命科学研究院，江苏镇江２１２０１３）　

中图分类号Ｑ７８６　文献标识码Ａ　文章编号ｌＯ０５—７０２１（２０１１）０４—００９０一Ｏ５　

Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｉｌｋ　Ｗｏｒｍ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒ）　

ＮｕｃｌｅＯｐＯｌｙｈｅｄｒＯｖｉｒｕｓ　ＧＰ６４　Ｇｅｎｅ　

ＬＩ　Ｇｕｏ—ｈｕｉ，ＴＡＮＧ　Ｑｉ，ＨＵ　Ｚｈａｏ—ｙａｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｈｕｉ—ｑｉｎｇ　

（Ａｃａｄ．ｏｆＬｉｆｅ　Ｓｃｉ．，Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｕｎｉ．，Ｚｈｅｎｆｉａｎｇ　２１２０１３）　

广西家蚕核型多角体病毒gp64基因遗传多态性及进化分析

作者：陈慧珠龙羽燕屈达才徐开遵朱方容陈朝蓉梁湘

来源：《南方农业学报》2021年第02期

摘要：【目的】了解广西家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）gp64基因的遗传多态性及进化特点，掌握BmNPV在广西蚕区的流行和传播情况，揭示BmNPV种群维持遗传多样性的模式与机制。【方法】对20株广西BmNPV毒株的gp64基因进行测序分析，根据gp64基因构建遗传进化树及绘制毒株流行分布图，并比对不同毒株的致病力。【结果】广西BmNPV毒株gp64基因开放阅读框（ORF）长度存在3种情况（1590、1593和1599 bp），分别编码含529、530和532个氨基酸残基的GP64蛋白。20株广西BmNPV毒株与标准参考T3株的gp64基因核苷酸序列同源性在97.6%～99.2%，其推导氨基酸序列同源性在96.4%～99.6%。在广西BmNPV毒株gp64基因近N端分别出现GCG缺失和GCGCCG/GTGCCG插入突变，发生核苷酸替换突变的位点数目在13～28个，但大部分为同义替换，对编码蛋白的三聚体空间构象无明显影响。广西BmNPV毒株gp64基因编码蛋白的N-糖基化位点为3～4个;除GXZS株外，所有毒株的O-糖基化位点均为2个，且预测位点一致。基于gp64基因构建的遗传进化树显示，几乎所有的广西BmNPV毒株聚类于Clade I分群，其又被分为2个主要亚群（Sub-clade I和Sub-clade II）;而几乎所有的国外参考毒株聚类于Clade II分群。广西蚕区的BmNPV流行分布呈集中性与分散性并存;GXUA株对四龄和五龄起蚕的半数致死量（LD50）分别为3.3和3.1，而GXZZ株对四龄和五龄起蚕的LD50分别为5.5和5.3，说明GP64蛋白糖基化位点较少的BmNPV毒株表现出较弱的致病力。【结论】广西BmNPV毒株gp64基因在进化过程中其信号肽区出现明显变异，发生同义突变的频率较高，形成较独立的进化分群，毒株间的致病力差异可能与GP64蛋白糖基化位点不同有关，说明广西BmNPV毒株具有不同的基因型和表型，在一定程度上维持了BmNPV野生群体的遗传多样性。

家蚕核型多角体病毒基因与抗病育种

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家蚕核型多角体病毒基因与抗病育种

作者：孙波周洪英吴宏丽

来源：《湖北农业科学》2011年第16期

摘要：家蚕（ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＬ．）对家蚕核型多角体病毒（Ｂ．ｍｏｒｉＮｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＢｍＮＰＶ）抗性为不完全显性，在常染色体上由主效基因控制，在性染色体上有微效基因的协同作用。抗ＢｍＮＰＶ相关基因的研究，为生产上进行防治提供了理论基础。ＲＮＡ干涉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）技术被广泛应用于基因功能研究，为ＢｍＮＰＶ抗性品种培育提供了新的方法。随着分子标记技术的不断完善和应用，在家蚕抗性品种辅助选育方面也取得了一定的成果，并且有获得家蚕抗性新品种的报道。

关键词：家蚕；家蚕核型多角体病毒；抗性；基因；育种

中图分类号：Ｓ８８４．５＋１；Ｑ７８；Ｓ８８２．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）16－3249-04

Gene of Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus and Disease Resistance Breeding

ＳＵＮＢｏ，ＺＨＯＵＨｏｎｇ－ｙｉｎｇ，ＷＵＨｏｎｇ－ｌｉ

（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＣｒｏｐｓ，ＨｕｂｅｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： The resistance of Bombyx mori to B. mori Nuclear polyhedrosis virus（BmNPV） was incomplete dominance，and ｗａｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙｍａｊｏｒ

核型多角体病毒侵染及其与宿主免疫系统互作的研究进展

环境昆虫学报2021, 43 (2)： 329 -339Joornal cf Eavironmental Einomologyhttp：〃hjkcxb. alfournals. net doi： 1023969 Fii sn21674 -08582202120226黄博，朱梦瑶，丘需珊，张若男，张文庆，余小强，卢玉珍•核型多角体病毒侵染及其与宿主免疫系统互作的研究进展[J].环境昆虫学报，2021, 43 (2) : 329 -339.核型多角及其与宿主免疫系统互作的研究进展黄博1,3,朱梦瑶1,丘需珊1,张若男1,张文庆2,余小强1,卢玉珍1(1.华南师范大学生命科学学院，广东省昆虫发育生物学与应用技术重点实验室，广州510631；2.中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州510275； 3.华中师范大学生命科学学院，武430079)摘要：核型多角体病毒(NucmopXyhedavirus, NPV)应用广泛，已被开发成微生物杀虫剂和用于重组蛋白表达等。NPV具有两种病毒颗粒：包埋型病毒粒子(occlusion - derived virus, ODV)和芽生型病毒粒子(budded virus, BV),两的构成和在差异。病毒包涵体在肠道中溶出ODV进感染,子衣壳通出生BV引发全身性的次级感染。病毒感染昆虫引发宿主的免疫反应，同 NPV病毒已进化出多种策略抑制或逃避宿主的免疫反应，如免疫信号、黑和凋亡。总结鳞翅目特异性NPV与宿主的研究，着重介绍NPV的制、NPV与宿疫的研究进展。关键词：角体病毒；杆状毒；包埋型病毒粒子；芽生毒粒子；先天免疫中图分类号：Q965； S476 文献标识码：A 文章编号：1674 -0858 (2021) 02 -0329 -11Advance in the researchi of nucleopolyhenrovirus infection and its interaction with host immune systemHUANG Be1,3, ZHU Meng-YaX , QIU Pei-Shan1, ZHANG Rue-Nan1, ZHANG Wen-Qiny2, YU Xiav- Qiany1, LU Yu-/hen1" (1. Guangdong Provincial Key Laboratoy of Insect Developmental Bmioxy andApplied Technomyy, School of Life Sciences, South China Nomiai University, Guangzhou 510631, China； 2. State Key Laboratoy of Biocontai, Sun Yat-sen Universip, Guangzhou 510275, China； 3. School of LifeSciences, Centea4ChinaNoema4Uniieesity, Wuhan 430079, China)Abstraci: Nuteoplyhedavirus ( NPV) has been widely used as a bioloyicxi control ayent and an expression system for recombinant proteins. Thera arc tpv viuon phenotypes, occlusion -devved virus (ODV) and the budded virus ( BV) , that arc distinct in the composition and osembiy during tPvinfection cycle. The pvmaa infection occurs when occlusion bodies ( OBs) arc disassembled tv releaseODV viuons inta lumen of Pa midyut. The payeny nucleocapsids arc transported tv the plasma membrane P yenerata BV phenotype. The BV viuons may infect other tissues and cxusa secondary phase of infection. Insects possess efficient innate immune defenses tv viral infection, whereas NPV has evolved vavous 9teategie9to9uppee9oeaioid ho9timmuneee9pon9e9.Theinteeaction peoce9e9between NPV and ho9t immune system includa immune siynaliny pohway, melanization and apoptosis. In thu paper, wvsummavav recent studies on the interactions betpeen Lepidopteran-specific nucleopolyhedavirus and their基金项目：国家自然科学基金(31901941)；国家重点研发计划(2019YFD1002100)；中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室开放课题(2018SKLBC-KF03)作者简介：黄博，男，1994年生，湖北省黄冈市人，硕士生，研究方向为昆虫与病原菌的免疫互作，E-mail： ******************通讯作者Author for correspondence:卢玉珍，女，博士，副研究员，主要研究昆虫病原微生物，E - mail： luyuzhen2015@ outlook, com 收稿日期 Received： 2020 —08 —19 (接受日期 Accepted： 2020

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

卢觅佳;于涟;谢荣辉;张朝政

【期刊名称】《浙江大学学报（农业与生命科学版）》

【年(卷),期】2004(030)005

【摘要】将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDV VP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25 d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.

【总页数】8页(P545-552)

【作者】卢觅佳;于涟;谢荣辉;张朝政

【作者单位】浙江大学,生物医学工程系,浙江,杭州,310027;浙江大学,动物预防医学研究所,浙江,杭州,310029;浙江大学,动物预防医学研究所,浙江,杭州,310029;浙江大学,动物预防医学研究所,浙江,杭州,310029;浙江大学,动物预防医学研究所,浙江,杭州,310029 【正文语种】中文

【中图分类】S858.31

【相关文献】

1.家蚕表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的免疫原性初步研究(英文) [J], 周伟军;HAGBERG Per

2.传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因在家蚕中的表达 [J], 卢觅佳;李建荣;王莹飞;金勇丰;于涟

3.鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究

小反刍兽疫疫苗研究进展

王凡;智晓莹;董金杰;常艳燕;刘学荣

【摘要】小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种严重的烈性、接触性重大跨国动物疫病.目前,该病在我国已经发生,给我国畜牧业经济造成了巨大损失.同多数病毒性疾病的防制相同,对小反刍兽疫PPRS的防制仍以疫苗免疫预防为主.文章对小反刍兽疫的各类疫苗进行综述,以期为疫苗的合理应用提供技术帮助.

【期刊名称】《中国草食动物科学》

【年(卷),期】2014(034)003

【总页数】4页(P58-61)

【关键词】小反刍兽疫;小反刍兽疫病毒;疫苗

【作者】王凡;智晓莹;董金杰;常艳燕;刘学荣

【作者单位】中农威特生物科技股份有限公司,兰州730046;中农威特生物科技股份有限公司,兰州730046;中农威特生物科技股份有限公司,兰州730046;中农威特生物科技股份有限公司,兰州730046;中农威特生物科技股份有限公司,兰州730046

【正文语种】中文

【中图分类】S855.3

小反刍兽疫（PPR），又名小反刍兽伪牛瘟，是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病。主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。OIE将其列为A类疫病［1］。小反刍兽疫病毒（PPRV）属于副黏病毒科麻疹病毒属。和其他麻疹病毒属成员的致病性相似，PPRV最容易在动物的上皮组织和淋巴组织中复制。2～3 d就可导致病毒血症，病毒扩散至全身各处的淋巴器官、消化系统及呼吸系统的黏膜继续增殖，4～6 d后出现严重的临床症状［2］。目前对PPR尚无有效的治疗措施，因此对PPR的预防就显得尤为重要，市场上现在主要销售的是灭活疫苗和弱毒苗，基因工程疫苗在实验室研究也取得长足进展，但要想投入生产还需大量的临床试验，因而，急需生产出安全高效的新型疫苗来预防PPR的流行。

同源的PPR灭活疫苗通常使用感染PPRV山羊的病理组织进行制备。研究表明，氯仿的灭活效果优于甲醛，用氯仿灭活后免疫动物，血清抗体可持续8个月，但无法区分野毒株和疫苗株。

家蚕细小病毒样病毒(BmPLV-Z)VD1ORF4的原核表达

李国辉;唐琦;张俊红;郭旭丽;胡朝阳;姚勤

【期刊名称】《微生物学杂志》

【年(卷),期】2011(31)3

【摘要】Theoretically coded amino acid sequence of BmPLV-Z VD1ORF4

was carried out Blast searching, the results showed that it was homologous

to DNA polymerase B family. The DNA polymerase fragment of the

homologous domain (1 077 bp) in VD1 ORF4 was amplified by PCR. The

amplified target DNA domain was linked to prokaryotic expression vector

pET30a and induced E. coli that caught pET30a-1 077bp recombinant

plasmids with different concentration of IPTG, and the induced products

were carried out SDS-PAGE electrophoreses. The results showed that the

homologous domain of polymerase product was expressed, and further

confirmed by Western blot that the induced protein was a fused protein

with six histidines. Target protein harvested from excised gels was used to

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