第五章工程酶—人工酶

第5章酶

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1．绝对特异性(absolute specificity)：
一种酶只能作用于一种化合物，以催化一种化学反应，称为绝对特异性，如脲酶。
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绝对专一性
O 脲酶 H2N—C—NH2 + H2O 2NH3 + CO2
NH2 O C NH2 尿素 NH CH3 O C NH2 甲基尿素 + H2O
Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
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（二）Km与Vmax的意义
Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 ② 意义：
a) Km是酶的特征性常数之一；
b) Km可近似表示酶对底物的亲和力；
c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
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Vmax
定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从Vmax
唾液淀粉酶丧失催化能力称酶失活唾液淀粉酶
淀粉
底物
葡萄糖
产物酶促反应
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二、酶的化学组成★
(一)单纯酶完全由蛋白质组成 (二)结合酶蛋白质和非蛋白质全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子酶蛋白：决定着反应的特异性，辅助因子：决定着酶的催化反应类型
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全酶
（辅助因子是金属）
金属酶
（金属离子与酶蛋白结合紧密）
2. 抑制作用的类型
(1)不可逆性抑制 (2)可逆性抑制
①竞争性抑制
②非竞争性抑制
③反竞争性抑制
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(二) 不可逆性抑制作用
1. 概念
抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活；抑制剂不可用透析、超滤等方法去除。

第五章：(酶工程)酶分子修饰

活性中心基团的鉴定标准
①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 ②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。
差别标记：
化学修饰
底物或抑制剂存在
活性基团不与修饰剂作用
含同位素标记
去除底物或抑制剂
原来被保护的基团带同位素标记
的同样试剂
可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。
2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）
1. 活性部位情况 2. 稳定条件及反应最佳条件 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性
二、修饰剂的选择要考虑——
1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）
2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）
3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件
三、反应条件的选择要注意——
修饰酶（300nm)
5) 二硫键的化学修饰
还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
氧化：过甲酸: Performic acid
6)咪唑基的化学修饰
1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除
“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。
第四节酶化学修饰的设计
一、充分认识酶分子的特性包括酶的——
2. 修饰剂：
聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。
修饰方法：修饰前活化(P157），然后在一定条件下与酶分子共价结合。
3. 应用：
如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）

蛋白质与酶工程第五章酶和细胞固定化

5.1 什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术水不溶性酶（固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶
可溶
间歇
吸附
包埋
间歇
固定化
交联
化学偶联
连续
固定化酶：经提取和分离纯化后的酶
固定化菌体(死细胞)：含酶菌体或菌体碎片
固定化细胞：在一定的空间范围内进行生命活动的细胞
优点： 1. 不溶于水，易于与产物分离； 2. 可反复使用； 3. 可连续化生产； 4. 稳定性好。
此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。
共价键结合法
优点：共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载体上脱落下来，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间的优点。
缺点：载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白空间构象变化。
凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等
按照包埋后的形状不同，包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包埋在高分子凝胶网格中的称为网格型，将酶包埋在球状半透膜中的称为微囊型。包埋法一般不需要与酶形成共价键的反应，几乎不改变酶的高级结构，酶
活回收率高，因此可以用于许多酶、细胞、细胞器的固定化。
（1）网格型形成网格有两种方法，一种方法是把酶或细

5第五章人工模拟酶

半胱胺基酸巯基解离成负离子进攻正电性羰基碳原子，生成S-酰化中间体。 H2O羟基进攻正碳离子，含Cys残 N-C酰氨键断裂，致使基手臂酯水解。模拟酶兼具分子络合作用、手性识别作用和催化作用，与天然酶十分相似。速度提高103~104倍。
- SH H+
ROOC NH O=C O O NO2
R O O=C CH2
HOOC :N
β-Benzyme对于对-叔丁基-苯基乙酸酯 (p-NPAc)水解活性比天然酶高1倍以上， kcat/Km(底物专一性)也与天然酶相当， Bender因此闻名于世。
NH
HO
S
OH
β-Benzyme
组氨酸咪唑基是十分有效的酸碱催化剂和亲核催化剂，在水解酶活性中心起关键性催化作用。
OH O C=C ODEAE NH2 NH DEAE
CD环包结呋喃环-识别定向
O O O C=C O O
糠偶酰烯醇-O-与Cu2+静电或配位结合得以稳定加速反应进行。
Cu2+
NH NH2
催化基团催化活性中心
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX，EC.1.11.1.9)为含硒酶，是生物体内重要的抗氧化酶，能有效消除体内的自由基，与超氧化物歧化酶和过氧化氢酶共同作用，防止脂质过氧化。因此GPX在治疗和预防克山病、心血管病、肿瘤等疾病具有明显的疗效。该酶来源非常有限，而且稳定性差，分子量大等限制了它的实际应用。利用CD的疏水腔作为底物结合部位，硒巯基为催化部位，制备出系列双硒侨联环糊精。表现出很高的GPX酶活性，其中C2和 C6-硒化环糊精的GPX活力已达到4.3U/µmol和7.4 U/µmol。若将C2-硒化环糊精改变成碲化环糊精的GPX活力已达到45U/µmol。

第五章-生物化学-酶化学

CH2 H2N

酸、碱性基团：
CH2 C OH

5.2.2 酶的催化机制
1. 酶作用专一性的学说

锁钥结合学说

诱导契合学说

2. 决定酶作用高效率的机制

（1）邻近效应和轨道定向学说
在酶促反应中，一方面底物分子结合到酶的活性中心，底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度。另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。
脲酶 + H2O
相对专一性
基团专一性：如a－D-葡萄糖苷酶；键专一性：如酯酶。
立体构型专一性：

①旋光异构专一性，如L-氨基酸氧化酶； ②几何异构专一性，如延胡索酸水化酶（反－丁烯二酸）
HOOCCH=CHCOOH H2O HOOCCH2CHCOOH OH
③酶能区分从有机化学观点来看属于对称分子中的两个等同的基团，只催化其中的一个基团。如：甘油＋ATP 甘油－1－磷酸
v=
＞＞
1 2
vmax [S] v max vmax时， 2 = Km + [S]
Km = [S]
米氏常数

2. 米氏常数（Km）的意义和应用

米氏常数（Km）：酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。（mol/l） vmax [S] v 1 v max v = 2 max时， 2 = Km + [S] 重要意义： Km值是酶的特征常数不同的酶，Km值不同,一般在1×10-8～10-1 mol/l

现代生物技术酶工程

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（5）有机介质中的酶反应
由于酶在有机介质中的催化反应具有许多优点。因此，近年来，酶在有机介质中催化反应的研究，已受到不少人的重视，成为酶工程中一个新的发展方向。酶在有机介质中要呈现很高的活性，必须具备哪些条件?有机介质对酶的性质有哪些影响?如何影响?近年来，对这些问题的研究，已取得重要进展。
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基因工程
基因工程菌
转基因动物
转基因植物
细胞工程
发酵工程
酶菌体细胞固定化菌体细胞
酶工程
酶
细胞
酶工程与发酵工程、基因工程、细胞工程的关系
现在学习的是第4页，共106页
一、酶工程的内容
1.酶工程的分类：（1）化学酶工程：自然酶、化学修饰酶、固
定化酶、化学人工酶的研究和应用。（2）生物工程酶：
人工酶是用人工合成的具有催化活性的多肽或蛋白质。据1977年Dhar等人报道，人工合成的Glu—Phe—Ala—Glu—Glu—Ala—Ser—Phe八
肽具有溶菌酶的活性。其活性为天然溶菌酶的50%。
利用有机化学合成的方法合成了— 些比酶结构简单得多的具有催化功
能的非蛋白质分子。这些物质分子可以模拟酶对底物的结合和催化过程。既可以达到酶催化的高效率，又能够克服酶的不稳定性。这样的物质称为
现在学习的是第16页，共106页
二、酶工程的意义、发展及展望
1.酶工程的研究意义
一切生物的生命活动都是由新陈代谢的正常运转来维持的，而代谢中的各种化学反应是由各种酶的催化来实现的。没有酶，代谢就会停止，生命亦就停止。个别酶的缺乏或者酶活性受到抑制就会使代谢受阻或紊乱，从而引起疾病。因此，研究酶的结构与功能以及动力学，对于阐明生命的本质和活动规律，对于阐明发病机理以及诊断治疗，具有极其重要的作用。

第五章化学酶工程

第五章化学酶工程第一节酶分子的化学修饰第二节抗体酶第三节印迹酶第一节酶分子的化学修饰一．酶的化学修饰原因1．稳定性不够，不能适应大量生产的需要。

（热、蛋白）2．作用的最适条件不符。

（半衰期延长，最适PH扩大）3．酶的主要动力学性质的不适应。

（Km增大，结合差）4．临床应用的特殊要求。

(异源蛋白-抗原-抗体-降低酶类药物抗原性）二．酶修饰的方向1．核酸水平2．蛋白质水平（化学修饰）三．酶化学修饰的基本原理（解决4个“ ？”）1．如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性2．如何保护酶活性部位与抗抑制剂3．如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4．如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境酶化学修饰的定义：（二）酶化学修饰的方法及修饰剂一．修饰剂的要求二．酶性质的了解三．反应条件的选择四．酶修饰方法一．修饰剂的要求1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性。

2．修饰剂上反应基团的数目及位置。

3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件。

二．酶性质的了解1．酶活性部位情况2．酶的稳定条件、酶反应最适条件3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等。

三．反应条件的选择1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例。

2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件。

3．反应温度及时间。

四．酶修饰方法1．酶分子侧链基团的化学修饰2．有机大分子对酶的化学修饰3．蛋白质类及其他。

1. 酶分子侧链基团的化学修饰一．几种重要的修饰反应二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰三. 研究新热点一．几种重要的修饰反应1．酰化及其相关反应2．烷基化反应3．氧化和还原反应4．芳香环取代反应二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1．巯基的化学修饰常用：烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺2．氨基的化学修饰3．羧基的化学修饰4．咪唑基的化学修饰5．胍（gua）基的化学修饰三. 研究热点-核酸类酶的修饰RNA酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。

主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基。

第五章工程酶-修饰酶

武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室二酶分子修饰modificationenzymemolecule的意义1提高酶的活力activity2增强酶的稳定性stability3降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty4研究和了解酶分子中主链侧链组成单位金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响structure武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室酶分子修饰的方法物理修饰法化学修饰法和基因工程修饰法通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分子的物理修饰
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
（2）主链有限水解修饰在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
应用举例木瓜蛋白酶：木瓜蛋白酶：用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去其肽链的 2/3，该酶的活力基本保持，其抗原性却大大降低。枯草杆菌中性蛋白酶：在经过EDTA处理后，再通过纯水或稀枯草杆菌中性蛋白酶：盐缓冲液透析，可以使该酶部分水解，得到仍然具有蛋白酶活性的小分子肽段，用作消炎剂使用时，不产生抗原性，表现出良好的治疗效果。
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
4、四硝基甲烷修饰酪氨酸酚基：
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
应用举例
葡萄糖异构酶：葡萄糖异构酶：在果糖、果葡糖浆的生产中有重要应用价值，经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5，并增强酶的稳定性，更加有利于果葡糖浆和果糖的生产。
小分子修饰，在大多数情况下，由于共价结合反应通常较为剧烈，酶活性都会不同程度下降，当然，修饰的目的是为了提高的稳定性、改变它的专一性、改变它的最适反应温度和pH、降低抗原性等。
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室

酶工程第五章酶分子修饰第五节氨基酸置换修饰

第五节氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰除了在酶工程方面应用之外，还可用来修饰其他功能蛋白质或多肽分子。例如：β-干扰素原来稳定性差。这是由于其分子中含有3个半胱氨酸，其中2 个半胱氨酸的巯基连结形成二硫键，而另一个在第17位的半肮氨酸(Cys-17)的巯基是游离的。当β-干扰素分子的游离巯基与另—个β-干扰素的游离巯基相结合形成二硫键时，β-干扰素就失去其活性。若将这个半胱氨酸(Cys17)用丝氨酸置换，就使β-干扰素不会生成二聚干扰素，从而大大提高其稳定性。经修饰后的β-干扰素在低温条件下保存半年，仍可保持其活性不变，这就为β-干扰素的临床使用创造了条件。
第五节氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰可以用化学方法进行。例如：Bender 和Koshland成功地用化学方法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，经修饰后，该酶对蛋白质和肽的水解能力消失，但却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学方法进行氨基酸置换，难度较大，受到诸多限制。
80年代兴起和发展起来的蛋白质工程，为氨基酸置换修饰提供了行之有效的可靠手段。
蛋白质工程又被称为第二代遗传工程。是指通过改造与蛋白质相对应的基因中的碱基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到寄主细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质的技术过程。
第五节氨基酸置换修饰
蛋白质工程主要步骤如下： 1.新蛋白质结构的设计根据已知的蛋白质或酶的化学结构、空间结构及其特性，确定欲得到的新蛋白质或酶的氨基酸排列次序。确定欲置换的氨基酸及位置。 2.突变基因的核苷酸序列的确定根据欲得到蛋白质的氨基酸序列，确定其对应的m RNA上的核苷酸序列，再根据互补原则，从mRNA核苷酸序列确定其所对应的突变基因上的核苷酸序列。依据欲置换的氨基酸确定需要置换的核苷酸及其位置。

人工酶

人工酶的理论基础
酶学基础(pauling的稳定过渡态理论):
20世纪著名科学家，两次诺贝尔奖(化学奖和酶和底物定向结合－稳定的过渡态 (活化能最低)－催化产生和平奖)获得者。著名的pauling轨道理论是他产物(酶高效的原因) 对有机化学的杰出贡献。
超分子化学和主客体化学： (天然酶＋底物)通过非共价键形成“超分子”(具有分子识别、催化、选择性输出的稳定大分子 )。天然酶是主体，底物是客体。化学家可以通过酶活性的模拟，或酶作用机制的模拟，人工合成类酶物质，即人工酶(主体)，和人工酶反应的反应物是客体。主体和客体互补：在结合部位的空间及电子排列上主、客体应互补！(主体＋客体)形成超分子。
催化糠偶姻(B)氧化成糠偶酰的反应，姻的烯醇负离子通过与桥基铜离子的静电或配位作用得其催化速率Kcat 比没有催化剂时大
20倍。
以稳定，从而加速了反应。
胡萝卜素利用桥联环糊精氧化为视黄醛
胡萝卜素
视黄醛
合成的主－客体酶模型
环糊精是天然的主-客体酶模型。
冠醚、穴醚、环番、环芳烃等是合成的主-客体酶模型。
此化合物可催化 ATP水解为 ADP和 AMP。pH 7时水解提速500倍。
-胰凝乳蛋白酶模拟
A ： - 胰凝乳蛋白酶模拟物，是含 B 的具有孔隙状结构的球状配体，由环状尿素连接
而成的孔穴状结构，方便与
底物结合。 B ：催化底物进行酰基转移
反应的亲核试剂。
A催化底物反应的速度是B的 1011 倍。
金属胶束人工酶：
由表面活性剂加金属离子组成。表面活性剂营造疏水微环境可以包结底物，金属离子起催化作用。
三、肽酶(pepzyme)
本质：人工合成的多肽。

第五章 工程酶—人工酶

第5章 酶