大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转__[1]...
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由互补产生的β －半乳糖苷酶(LacZ)能够作 用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β －D－ 半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这 个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入 一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会 造成LacZ(β －半乳糖苷酶)基因的失活，破坏α -
步骤需在超净工作台和冰上操作；
4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管
中，在冰上冷却10分钟；
5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
6 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2
溶液，用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细
胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液， 用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保 护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存 备用（－80℃）。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 实验原理
• 实验仪器 • 实验试剂
• 实验步骤 • 注意事项
实验原理
进行基因克隆时，体外连接的重组DNA分
子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、 增殖和表达。 感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一 些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后， 细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞 实验步骤
1．前夜接种受体菌（DH5或DH10B）， 挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培 养过夜； 2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB 培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
年夜肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项之答禄夫天创作时间：二O二一年七月二十九日1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后必需导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及把持统称为重组DNA分子的转化.在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很年夜的关系. 所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响.cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可年夜年夜增进转化的作用.细胞的感受态一般呈现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键.制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保管有效期6个月.2、转化的概念及原理在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法.它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一.受体细胞经过一些特殊方法,如电击法、CaCl2等化学试剂法处置后,使细胞膜的通透性发生变动,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞.进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞呈现新的遗传性状.年夜肠杆菌的转化经常使用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的.其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA 形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞概况,经42℃短时间热冲击处置,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中重组子中基因获得表达,在选择性培养基平板上可选出所需的转化子.Ca2+处置的感受态细胞其转化率一般能到达5×106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验.如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处置细菌,则可使转化率提高100~1000倍.化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保管,因此被广泛用于外源基因的转化.除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠长久的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能到达109~1010转化子/ug闭环DNA.因把持简便愈来愈为人们所接受.3、感受态细胞制备及转化中的影响因素⑴、细胞的生长状态和密度最好从-70℃或-20℃甘油保管的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.不要用已经过屡次转接及贮存在4℃的培养菌液.细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳.即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制.对TG1菌株OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右.应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的分歧而分歧.密渡过高或缺乏均会使转化率下降.另外受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株.而且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配.⑵、质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比但当加入的外源DNA的量过多或体积过年夜时则会使转化率下降.一般地,DNA溶液的体积不应超越感受态细胞体积的5%1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞到达饱和.对以质粒为载体的重组分子而言,分子量年夜的转化效率低,实验证明年夜于30kb的重组质粒将很难进行转化.另外重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍,因此重组DNA年夜都构成环状双螺旋分子.⑶、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯洁的水配制,最好分装保管于4℃.⑷、防止杂菌和杂DNA的污染整个把持过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管、移液枪头等最好是新的,并经高压灭菌处置.所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染否则均会影响转化效率或杂DNA的转入.⑸、整个把持均需在冰上进行不能离开冰浴否则细胞转化率将会降低.时间：二O二一年七月二十九日。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
大肠杆菌感受态制备及转化
大肠杆菌感受态制备及转化大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，常见于土壤、水体、人和动物的肠道等地方。
由于其易于培养和操作，成为生物学研究中常用的实验材料。
本文将介绍大肠杆菌的感受态制备及转化的过程。
感受态制备是指将大肠杆菌细胞从冻存状态恢复到活跃状态的过程。
为了保证感受态制备的成功，首先需要准备培养基和细菌菌种。
常用的培养基有LB培养基和SOC培养基，其中LB培养基适用于大肠杆菌的一般培养，SOC培养基则适用于感受态制备和转化实验。
培养基的配制需按照实验要求进行，注意消毒措施，避免污染。
感受态制备的过程一般包括以下几个步骤。
首先，将冻存的大肠杆菌菌种转移到预先加热的LB培养基中，进行孵育培养。
培养温度和时间根据实验需要进行调整，通常为37摄氏度下培养12-16小时。
其次，将培养物进行稀释，使其浓度适合后续实验操作。
最后，将稀释后的细菌液进行离心，去除上清液，沉淀后的菌体即为感受态大肠杆菌。
感受态大肠杆菌的转化是指将外源DNA导入到大肠杆菌细胞中的过程。
转化的前提是大肠杆菌细胞处于感受态，即细胞膜对外源DNA具有较高的通透性。
转化的关键是选择合适的质粒载体和转化方法。
常用的质粒载体有pUC19、pGEM-T等，这些载体具有含有抗生素抗性基因的特点，可以通过抗生素的选择来筛选转化成功的细菌。
质粒载体通常通过限制酶切与外源DNA进行连接，形成重组质粒。
将重组质粒与感受态大肠杆菌进行转化后，通过培养在含有抗生素的培养基上筛选，即可得到含有目标基因的转化菌落。
转化的方法有热激法、电穿孔法和化学法等。
热激法是将感受态大肠杆菌与重组质粒混合后，在高温条件下进行短暂的热冲击，使细菌细胞膜通透性增加，促进外源DNA的摄入。
电穿孔法是利用电场作用使细菌细胞膜产生孔隙，使外源DNA通过孔隙进入细胞。
化学法则是利用化学试剂改变细菌细胞膜的性质，增加其对外源DNA的吸收能力。
转化后的菌落需要进行筛选，常用的方法是通过抗生素选择。
课件：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
实验材料与耗材
➢ 实验材料：大肠杆菌菌株JM109细胞，待转化的重 组DNA分子（含有Ampr）。
➢ 耗材：培养皿，三角瓶，玻璃推子，移液器（规 格1000μl、100μl、10μl），1.5ml离心管。
➢ 试剂：CaCl2，胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl， NaOH，氨苄青霉素
实验步骤
菌株活化 ➢ 用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它 操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但 涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上， 此组正常情况下应产生大量菌落。
实验步骤
转化率统计 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
实验目的
1、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞的实验技术。 2、掌握热激转化实验技术。
实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指外 源DNA导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗 溶液中，菌体细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗 DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间 热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择 性培养基中保温复苏一段时间，促使在转化过程中获得的新 的表型（如Amp）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有 氨苄青霉素的选择性培养基上，进行转化结果的筛选。
预冷10min ➢ 4000rpm离心5 min,弃上清 ➢ 加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即
可使用。也可加入总体积15％的甘油70℃长期 保存
实验步骤
转化 ➢ 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放
超级感受态细胞(大肠杆菌)-原理和制备Protocol
大肠杆菌超级感受态细胞原理和制备
所谓感受态，是指受体（或宿主）细胞最容易接受外源DNA片段而不将其降解并实现其转化的一种生理状态。
一. 原理：
人工感受态的形成, 需要低温和Ca2+处理，细胞膨胀成球状，细胞表面正电荷增加，
通透性增加，这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列。
转化的质粒DNA 由于形成抗
DNase 的羟基-钙( Ⅱ) - 磷酸复合物而粘附于细胞表面。
Ca2+与膜上的多聚羟基丁
酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA 的渗入。
cAMP可以使感受态水平提高10000倍，而Ca2+也可大大的提高转化的效率，在
Mg2+的辅助下Ca2+感受的细胞转化率比单用Ca2+处理的高1.84倍。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：
1）局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
2）酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：
二. 制备：
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在无菌低温下进行。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
3. 将菌液快速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4. 吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5. 4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6. 弃去上清，加入1500 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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试验步骤
CaCl2感受态细胞制备试验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞试验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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CaCl2感受态细胞制备试验步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5 或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 . 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上猛烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
热激法是利用冰凉CaCl2处理对数生长久细 胞, 能够诱导其产生短暂“感受态”, 易于摄取外源 DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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试验仪器
1 . 超净工作台 2 . 低温离心机 3 . 恒温摇床 4 . 恒温培养箱 5 . -70 ℃ 冰箱 6 . 制冰机 7 . 移液器 50ul 、200ul 、1000ul
悬浮；
7. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 8. 弃去上清，加入750 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
悬浮；
9. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 10. 加入20 l冰凉10%甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11. 马上使用或快速置于-70ºC超低温保留。
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一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能承受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞外表正电荷增加，通透性增加，形成能承受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA〔重组质粒〕引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间发生。
目前对感受态细胞能承受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞外表的细胞壁构造发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：〔1〕发芽的芽孢杆菌容易转化；〔2〕大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；〔3〕适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的外表形成一种能承受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：〔1〕蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；〔2〕细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；〔3〕别离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进展探索，试图从实验中获得明确答复。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
〔二〕重组DNA 的转化原理我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的DNA 引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。
作为受体的大肠杆菌C600 或DH5α，必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。
这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。
保持外来DNA分子在受体细胞中的稳定性。
制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷〔rk-mk-r ec-〕同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感〔Ap〕。
在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素〔Ap〕基因存在，当它导入受体细胞后，就赋于这些受体细胞新的特性，即Ap 抗性。
同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因(lacZ)，我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因(lacZ)，使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。
因pUC18带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pUC18 DNA 的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子那么不能存活。
此为初步的抗性筛选。
pUC18 上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 个氨基酸的编码序列。
这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ 的阅读框架,不影响其正常功能。
E.coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C 端局部序列的编码信息。
在各自独立的情况下, pUC18 和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。
但在pUC18 和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。
这种lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。
由α-互补产生的Lac 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。
当外源片段TGFβⅠ插入到pU C18 质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去α-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。
由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA 分开。
此为α-互补现象筛选。
本实验是把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合，使其进入受体细胞。
DNA分子转化的原理较复杂：1、吸附――完整的双链DNA 分子吸附在受体菌外表。
2、转入――双链DNA 分子解链，单链DNA 分子进入受体菌，另一链降解。
3、自稳――外源质粒DNA 分子在细胞又复制成双链环状DNA。
4、表达――供体基因随同复制子同时复制，并被转录和翻译。
对DNA 分子来说，能被转化进受体细胞的比率极低，通常只占DNA 分子的0.01%，改变条件，提高转化率是很有可能的，一些研究说明以下因素可以提高转化率：〔1〕受体菌细胞与DNA 分子两者比例在1.6×108 细胞：1毫微克DNA分子〔4.3Kb〕左右转化率较好；〔2〕DNA 分子与细胞混合时间为1小时最正确；〔3〕铺平板条件会影响转化率；〔4〕对不同转化菌株热处理〔效应不一致〕。
除上述因素外，转化试验还注意如下问题：1、连接DNA 反响液与受体细胞混合时，一定保持在冰浴条件下操作，如果温度时高时低，转化效率将极差。
2、热处理2 分钟后，要迅速加进1 毫升LB 以使表型表达，延迟加LB，将使转化率迅速降低。
3、在平板上涂布细菌时。
注容防止反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械压涂布将会使细胞破裂。
影响转化率。
三、材料〔一〕仪器与器皿恒温振荡器分光光度计电动沉淀离心机旋涡混合器恒温培养箱隔电热恒温水浴锅恒温摇床普通冰箱Eppendorf管转液管平皿涂布棒微量取样器微波炉三角烧瓶试管刻度离心管保温瓶酒精灯等〔二〕菌种大肠杆菌C600 或DH5α〔rk rec mk〕〔三〕培养基与试剂1.LB 液体培养基〔1%蛋白胨0.5%酵母粉0.5%NaCl pH7.5。
〕2、100mmol/ L CaCl23.氨苄青霉素溶液〔50 毫克/毫升〕4.DNA 连接反响液5.X-gal 储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃。
6.IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。
7.含Amp 的LB 固体培养基:将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,参加Am p 储存液,使终浓度为50μg/ml,摇匀后铺板。
8.含X-gal 和IPTG 的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板外表加40 ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4 小时,使培养基外表的液体完全被吸收，备用。
四、实验步骤〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备1、将受体大肠杆菌接种于LB斜面上活化，置于恒温培养箱中37℃培养过夜。
2、取一环上述大肠杆菌培养物菌落接种于3 毫升LB试管中，于恒温振荡器上，37℃振荡培养过夜〔约16 小时〕，必要时在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致，有无杂菌污染。
3、用移液管无菌条件下，取过夜培养液1 毫升，接种于新鲜的LB 中〔100毫升LB/250毫升三角瓶，接种量按菌液浓度而定，一般在1%左右〕，于恒温振荡器上37℃培养2―3 小时。
4、取1 毫升培养液以未接种的LB 作空白对照，在751 分光光度计上测OD550的光密度值，约为0.2―0.5 左右。
5.无菌条件下将上述1 毫升菌液倒入1.5毫升EP 离心管中〔离心管应带盖并高压灭菌过〕，每组2 支。
6、带菌液的离心管置于冰上10 分钟，冷却菌液，平衡好，置于台式低速离心机上，3500r /min 离心5 分钟。
7、无菌条件下，倒去上清LB，倒斜离心管，让LB 流干，留下沉淀菌体，参加预冷的100 mmol/L CaCl2溶液600微升，用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体，使其悬浮后，把2支管转为1支，摇匀后于冰浴中放置30分钟。
8、重新将CaCl2菌悬浮液置于台式低速离心机上，3500r/min离心10分钟，小心侧倒掉上清CaCl2，留沉淀菌体。
9、再把菌体悬浮在200 微升100mmol/L CaCl2的溶液中，置于冰上作为转化的受体菌液。
此制备的感受态细胞应在此步后1小时至24小时使用，效率比拟高。
10.在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板外表加40ml X-gal 储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基外表的液体完全被吸收，备用。
〔二〕重组DNA 转化1.取0.2ml 大肠杆菌感受态细胞，在无菌条件下，参加到连接液的Eppendorf管，混匀，置冰浴中30 分钟。
2.冰浴后，将正在转化反响的细胞悬浮液参加已调好42℃的的恒温水浴槽，保温2分种。
3.热冲击处理后的细胞易死亡，应迅速倒入LB培养液1 毫升，〔无抗菌素LB 液，有助于基因表达〕马上置37℃水浴1 小时，每10 分钟翻转1 次。
4.用移液器取0.1 毫升的转化菌液直接涂布含50μg/ml Amp、40ml X-gal储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上，共涂布三个培养皿。
5.用移液器取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液0.1毫升直接涂布于含50μg/mlAmp、40m l X-gal 储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上，作为受体菌对照。
6.将第14、15 步涂布培养皿先放室温15 分钟左右，使涂布上的菌液枯燥不会流动。
然后倒置放于恒温箱中37℃培养过夜。
7.第二天取出培养皿，观察对照平皿和转化平皿菌落情况。
对照平皿因受体菌对Amp 敏感，故不能在含Amp的培养基上生长。
转化平皿是否有兰色和白色菌落生成？如果长出兰色菌落，说明自连的载体pUC18质粒已转入受体菌，但目的基因没有接入载体。
如果长出白色菌落，说明目的基因已接入载体，重组质粒的转化子因此丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal 和ITPG 存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落。
五、结果和讨论比拟对照平皿和转化平皿，讨论转化成败原因.。