组织线粒体蛋白-胞浆蛋白提取方法
线粒体的分离
线粒体的分离
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实验三线粒体的分离、超活染色与观察 一、实验目的 1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。 2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 3、学习细胞器的超活染色技术。 二、实验原理 利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 三、实验材料与方法 1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。 2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。 四、实验方法 （一）大鼠肝线粒体的分离 1、制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组
膜蛋白提取
1分离组织膜蛋白的方法： 1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。 2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。 3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。 4、收集所得上清液即为膜组份。 Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 2 取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。样品蛋白含量测定采用酚试剂法。 3 我们实验室提取膜蛋白的方法如下： 1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。3．按 2.5毫升（T75）/每瓶或5毫升（T175/ 每瓶加入冰冷的匀浆液（HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM）于离心管中，将溶液和沉淀转移到匀浆器中，匀浆。 4．将匀浆液转入离心管中，加入适量的Tris –HCl (50mM, PH7.4) 4oC, 18000rpm (40000g) 10分钟。在沉淀中加入同前量的匀浆液，再匀浆，匀浆后加入适量的tris-HCl buffer. 4度18000rpm(40000g)离心，共离心三次。 5．在最后一次离心得到沉淀中按250微升每瓶（T75）或500微升每瓶（T175）加入tris-HCl buffer，匀浆，取50微升匀浆液测量蛋白浓度。 6．按实验要求，将匀浆分装于1毫升的Eppendoff 管中，其于-80oC 冰箱中待用。 主要基于膜蛋白分子量较大，在40000g时易沉降来分离。 做膜蛋白的免疫荧光，可以用荧光抗体染色，然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察，具体的protocol可以找到，就不多说了。需要注意的是，要弄清楚你所使用的一抗结合部位是在膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域，如果是胞外，可以直接染色；如果在胞内，则需要用无水甲醇在-20度处理10min，使细胞膜通透，然后再用抗体孵育，这样抗体才能进入细胞内与蛋白结合。
实验四 线粒体的分离与观察
实验八线粒体的分离与观察 实验目的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I．鸡肝线粒体的分离 实验用品 一、材料 鸡肝脏 二、试剂 1. 生理盐水 2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：
蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白 : 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。 蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面： 一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等； 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。 制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态
组织蛋白提取
1. 提取蛋白裂解液配方： 25 mM HEPEs PH:7.4 5 mM EDTA 5 mM EGTA 50 mM NaCl 1 mM Na3VO3(矾酸钠) 1 mM sodium phosphophate 0.05% SDS 0.05% sodium deoxycholate (脱氧胆酸盐) 1% Triton-X 100 5 mM NaF 0.1% 2-mercaptoethanol 1 mM PMSF (1ul 100mmol/L+纯水99ul) 1uM Microcysin-LR 40ug/ml pepstatin A 40ug/ml aprotinin 40ug/ml leupeptin 2..组织蛋白提取及定量： 称量组织重量置小烧杯 用PBS清洗1-2次 加入组织裂解液【悬浮buffer储存液500ml+苯甲基磺酰氟（PMSF，有毒物）30+leapeptin （蛋白抑制酶）0.5ul于EP管混合，倒入盛组织的烧杯】 置冰上5min 用眼科剪剪碎 倒入5ml匀浆器（反复抽吸匀浆组织） 倒入或吸入EP管 离心（4°C 1000g 10min）取上清 用于蛋白定量或储存于-80°C 蛋白定量 取5ul蛋白样本+15ul去离子水（DW）+200ulBCA（A:B为50:1即196:4），分别混合样本与DW和BCA的A液与B液置于干净的96孔板上37°C，30min
酶联免疫测OD值（570nm，ELX-800型酶标仪） 由OD值计算蛋白浓度（用excel表或用下列公式计算） （OD值×987.7108－198.342）×103ng/ul；OD=样本OD值－空白对照OD值）
核与线粒体分离提取方案
线虫细胞核和线粒体提取 N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。初步计划收集10个皿线虫。 1.细胞核分离 细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。 方法如下： 1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合 2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。吸出PBS。 3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。 4.以10000rpm短暂离心5-10秒。 5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中 6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次 7.用棉布过滤匀浆 8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。丢弃上清液。用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。4℃ 600g 离心10分钟。丢弃上清液。 10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。 11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。 12.翻转管子去除蔗糖。从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。 核在这个阶段保留其膜。要卸下膜，请执行步骤13。 13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。在4℃下以600g离心10分钟。重复该过程。最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。 14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。 分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。 2.线粒体提取 查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下： 1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。 2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。 3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。 4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。 5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。 6.小心地清除上清液 7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。细胞使用钝头针头和注射器进行破
组织线粒体分离试剂盒
组织线粒体分离试剂盒 简介： 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 组织线粒体分离试剂盒(Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离动物组织中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。该试剂盒可用于从动物软组织(如脑、肝脏)和硬组织(心肌、骨骼肌)中提取线粒体，对于采用该试剂盒提取硬组织线粒体效果不佳者，建议采用Leagene 硬组织线粒体分离试剂盒。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 低温离心机、匀浆器 2、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：取新鲜组织(不宜采用冻存的组织)，迅速称重，用预冷的PBS 清洗1次，冰上剪成3mm 2大小的组织碎片。 2、匀浆裂解：加入Mitochondria Lysis buffer(如需获得细胞浆蛋白，应提前加入PMSF ，至PMSF 浓度为1×)，置于冰浴上Dounce 匀浆器中，匀浆10～20次。 不同组织或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 3、离心以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。注：如需获得纯度更高的线粒体，可 编号 名称 CS0010 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(C): Protein Stock buffer (5×) 10ml RT 试剂(D): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份
植物组织蛋白提取方法
植物蛋白质提取方法总汇 一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法 氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm 以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
三、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量） 倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量） 振荡，置室温20min 离心： 7500g，5 min，4度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次 沉淀中加入100％乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。 四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根 1、200毫克样品置于冰上磨碎 2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清 3、重复离心5min
线粒体的提取与纯化
mt DNA的分离及纯化 按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。 1.2 1000 g?min-1离心15min；取上清液；15000 g?min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L?g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 μg?m L-1，30℃下作用30min。 1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。15000g?min-1离心20min。沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。 1.4 按0.5 m L?g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。 1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。 1.6 15000g?min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl， 0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。 1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50μg?m L-1，37℃保温1h。4℃保存待用。
蛋白质提取方法
蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，
线粒体蛋白质组学的研究进展(一)
线粒体蛋白质组学的研究进展(一) 【摘要】线粒体是真核细胞重要的细胞器，随着蛋白质组技术的发展和完善，一些新方法也被应用于线粒体蛋白质的研究，线粒体蛋白质组研究虽然已取得了一些成果，但线粒体蛋白质组数据库中的数据仍较匮乏，并且还有一些问题亟待解决和改善。 【关键词】线粒体；蛋白质组学 人类体细胞中除了红细胞，其他所有细胞均含有线粒体。线粒体是真核细胞重要的细胞器，它不仅是机体的能量代谢中心，而且还参与多种重要的细胞病理过程。线粒体拥有自己的DNA（mtDNA），可以进行转录、翻译蛋白质合成。线粒体含有500～2000种蛋白质，约占整个细胞蛋白质种类的5%~10%。线粒体的蛋白质参与机体许多生理、病理过程，如参与电子传递和ATP合成、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等过程。线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病相关，如退行性疾病、心脏病、衰老和癌症。运用蛋白质组研究技术，从整体上研究这些蛋白质在生理及病理状态下的变化趋势及相互关系，可以为线粒体作用机制的探索提供新的有力的支持。 1线粒体的超微结构和功能 线粒体是机体细胞中重要的亚细胞器，它具有独特的超微结构和多种重要的生物学功能。线粒体由两层膜包被，外膜平滑，内膜向内折叠形成嵴，两层膜之间有腔，线粒体中央是基质。基质内含有与三羧酸循环所需的全部酶类，内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，有细胞“动力工厂”之称。线粒体合成的ATP供给几乎所有的细胞生理过程：从骨骼肌和心肌的收缩，到细胞膜跨膜离子梯度的维持、甚至激素和神经递质的分泌等。另外，线粒体有自身的DNA和遗传体系，但线粒体基因组的基因数量有限，因此，线粒体只是一种半自主性的细胞器。线粒体的主要化学成分是蛋白质和脂类，其中蛋白质占线粒体干重的65%~70%，脂类占25%~30%。在肝细胞线粒体中外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区，各蛋白质的含量依次为：基质67%，内膜21%，外膜8%，膜间隙4%。内膜含有三类功能性蛋白：（1）呼吸链中进行氧化反应的酶。（2）ATP合成酶复合物。（3）一些特殊的运输蛋白，调节基质中代谢物的输出和输入。细胞线粒体的功能，不仅限于生物学功能。它们在氨基酸和血脂新陈代谢、血红素和铁硫群生物合成、细胞信号与细胞凋亡发挥关键作用。 2线粒体蛋白质组学概述 2.1蛋白质组学的概念蛋白质组学（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。 2.2蛋白质组学的研究内容蛋白质组学的研究内容主要有两个方面：即结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析、种类分析及数量确定。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能及蛋白质间的相互作用。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为多种疾病机制的阐明及攻克，提供理论根据和解决途径。 2.3线粒体蛋白质组的分析对蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中与基因组学相对应的主要内容。目前线粒体蛋白质组的分析工作主要有:（1）通过双向电泳等技术得到正常生理条件下的蛋白质的图谱，建立相应的数据库。（2）比较病理组织细胞蛋白质组发生的变化，如蛋白质表达量的变化,翻译后修饰的类型和程度,或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上定位的改变等。 2.4线粒体蛋白质组研究技术线粒体蛋白质组研究常用的技术有：（1）用于蛋白质相互作用
组织线粒体提取
从动物组织中粗提线粒体 一、实验目的： 从动物组织中分离线粒体，以便线粒体功能分析实验。 二、实验准备 Lysis buffer、匀浆器、离心管、解剖器具 三、实验步骤： 1．实验前一天小鼠禁食过夜。线粒体提取前所有溶液要冰上预冷。 2．解剖小鼠（~30g），快速取出肝脏，去除胆囊，放入50ml预冷的IBc烧杯中； 3．预冷的IBc洗去多余的血液。洗4-5次至IBc澄清。 4．冰上将肝脏剪碎 5．倒掉清洗的IBc，加入新的5mlIBc，将上清转移至玻璃匀浆器 6．以1,600 rpm冰上匀浆3-4次，组织与缓冲液比例1：5-1：10间 7．匀浆液转移至50ml离心管，600g，离心10min 4 ℃ 8．小心将上清转移至新的离心管600g，离心10min 4 ℃ 9．小心将上清转移至新的离心管7000g，离心10min 4 ℃ 10．倒掉上清，加入5ml预冷的IBc，洗一次，不要用枪头重悬 11．7000g，离心10min 4 ℃ 12．去除上清，重悬底部的含有线粒体的颗粒。用玻璃棒搅松底部的沉淀，不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬。用1ml移液管重悬避免出现气泡。 13．转移至14ml离心管，置于冰上。线粒体在1-3小时内用于实验，得到比较好的活性。 14．Bradford法测定线粒体浓度。 四、试剂配方 Buffer for cell and mouse liver mitochondria isolation (IBc)：100 ml 10 ml 0.1M Tris–MOPS 1 ml 0.1M EGTA/Tris 20 ml 1M sucrose 100 ml ddH2O，pH 7.4 储液： 1 M sucrose： 342.3 g sucrose 1L ddH2O Mix, 20 ml分装-20 C保存. 0.1MTris/MOPS： 12.1 g Tris； 500ml ddH2O，MOPS 调pH 7.4，ddH2O 体积至1L保存于4 C. 0.1 M EGTA/Tris： 38.1 g EGTA； 500 ml ddH2O，Tris调pH 7.4 总体积至1L ，保存于4 C. 五、注意事项 1. 开始前将离心管预冷5min，所有步骤包括匀浆在4度冰上进行，降低磷脂酶和蛋白酶活性； 2．最后重悬时，用玻璃棒搅松底部的沉淀。不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬，线
提取蛋白的常规方法
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
细胞线粒体分离试剂盒
细胞线粒体分离试剂盒 简介： 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 细胞线粒体分离试剂盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离培养细胞中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。本试剂盒提供台盼蓝染色液和PMSF ，可以分别判断线粒体质量和提取细胞浆蛋白。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 胰蛋白酶 2、 低温离心机、匀浆器 3、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：用预冷的PBS 清洗细胞，离心，其上清。 2、裂解：沉淀用预冷的Mitochondria Lysis buffer 重悬细胞，冰浴放置，可用相差显微镜检测膨胀的程度。 3、匀浆：把细胞悬液转移至Dounce 匀浆器中，匀浆。不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 编号 名称 CS0201 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Trypan Blue Stain 10ml 4℃ 避光 试剂(C): Wash buffer 100ml -20℃ 试剂(D): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(E): Protein Stock buffer(5×) 20ml RT 试剂(F): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份
蛋白提取方法
?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品
线粒体提取
线粒体提取 缓冲液A（100 mM Tricine-KOH (pH 7.4), 300 mM sucrose, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM potassium-EDTA, 0.1% BSA, 5 mM DTT and protease inhibitors: 1 mM PMSF, 10 g/ml pepstatin A）。 缓冲液B（pH 7.4, 无DTT ，余下同分离缓冲液A）。 1、将拟南芥叶片10g,置于研钵中，剪碎。 2、加25ml分离缓冲液A，冰上充分研磨。 3、匀浆液经4层纱布过滤。滤液取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（1）。 4、于2,600g 离心15 min（Beckman J2-HS），弃沉淀。上清取20ul用于细胞色素c活性 测定，记为（2）。 5、上清液进一步在12,000g 离心15 min，此时得到线粒体粗提样。 6、弃上清，将沉淀轻柔地悬浮于2 ml分离缓冲液B中。从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（3）。 7、铺制蔗糖密度梯度于38ml超离管中，介质由上到下依次包括6 ml / 0.6 M sucrose, 6 ml / 0.9 M sucrose, 8 ml/ 1.2 M sucrose, 8 ml /1.45 M sucrose 和8 ml/ 1.8 M sucrose。介质均用缓冲液B配制。 8、然后将2 ml悬浮液铺于蔗糖密度梯度介质上。 9、然后以24000rpm离心90 min（SW28 Beckman rotor）。 10、超离结束后，收集1.45M/1.2M层组分于50ml离心管中，缓冲液B稀释5倍。 11、12000g离心15min，沉淀即为纯化的线粒体。 13、将沉淀重悬于500ul缓冲液B中，从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（4）。 14、纯化的线粒体液氮速冻，存于-80℃。
蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如