第五章_三帖皂甙类制剂的分析

四、
皂苷类的定量分析
测定——比色法、薄
水饱和正丁醇萃取或大孔树脂吸附 洗脱 测定-常用重量法、比色法 苷元 层色谱法、高效液相色谱法
皂苷元测定：总皂苷酸解
总皂苷测定：醇提
单体皂苷测定：薄层色谱法、高效液相色谱法
但在中药制剂中如无特殊原因，应尽量避免将药品 水解后测定水解产物，因为如此测定已不能客观反 应药品自身的质量，更无法进行稳定性考察
皂苷的分类 按苷元分为两大类： 甾体皂苷：―― 27个Ｃ组成的甾体衍生物。 三萜皂苷：―― 30个C组成的三萜衍生物，大 多数三萜化合物均可看作有6个异戊二烯单位 连接而成。游离的三萜类化合物通常多不溶于 水，与糖结合后成苷，则可溶于水，振摇后可 生成胶体溶液，并有持久性似肥皂溶液的泡沫。
（2）*三萜皂苷（酸性皂苷）
C6H6-EtOAC(1:1),
CHCl3-EtOAC(1:1),
CHCl3-
EtOEt(1:1), C6H6-EtOH(17:3)。
常用的显色剂
①25％磷钼酸乙醇液：喷后140℃,△5～10min,皂苷元紫蓝色。 5 ％磷钼酸乙醇液：喷后105℃,△5～10min，皂苷元紫蓝色 ②、三氯化锑的浓盐酸或氯仿液: 喷后90℃,△10min，各皂苷元 呈不同颜色。 ③、硫酸-甲醇液(1:1): 喷后△，显红褐、紫、黄或黑色。 与加热温度有关。缺点是腐蚀性强,其他物质也显色。 ④、氯磺酸-乙酸(1:２)溶液: 喷后130℃,△５min，各皂苷元呈 不同颜色。如天蓝、粉红等,且在紫外光下也呈不同萤光，较灵 敏（可检出１０－１～１０－３ug）,可用于鉴别和定量。 ⑤、碘蒸汽:灵敏度约为１～２ug，优点碘易挥发，显色后挥去碘， 斑点可作定量分析。常用于确定斑点的位置。缺点专属性不强.。
试剂：20％五氯化锑氯仿溶液
样品氯仿液＋五氯化锑氯仿液—→氯仿液
呈紫蓝色。
用于化学及色谱鉴别的显色剂
光谱特征
黄芪甲苷
光谱特征
甘草酸/甘草皂苷/甘草甜素
远志皂苷
三、皂苷类的定性鉴别：
皂苷类的定性鉴别较常用的有

泡沫反应鉴别


化学显色反应鉴别
中药材成分鉴别
薄层色谱鉴别：中药制剂鉴别应用准确率较高
比如用大孔树脂分离银杏黄酮
S-8极性： 吸附量 126.7mg/g AD-8弱极性： 吸附量102.8mg/g H-107非极性： 吸附量 47.7mg/g 银杏黄酮具有多酚结构和糖苷链，具有一定吸附和亲水性， 有利于弱极性和极性大孔树脂吸附
大孔树脂规格的选择：
2.被吸附物质分子的大小和树脂孔径的关系。大孔树脂的吸附 量大小受树脂极性和骨架结构影响外，还受到树脂空间结构的 影响。树脂吸附过程中，树脂内部孔径是被吸附物质扩散的路 径，在比表面积一定的情况下，适当增加树脂孔径，亦会增大 被吸附物质的扩散速度，有利于达到吸附和解析平衡
五环三萜皂苷 β-香树脂醇型（齐墩果烷型） α-香树脂醇型（熊果烷型）
羽扇豆醇型 四环三萜皂苷 达马烷型 羊毛脂甾烷型 其他分类 单皂苷：中性皂苷、酯皂苷、酸性 皂苷 双皂苷
含三帖类成分的常用中药
人参
西洋参
三七 黄芪
柴胡
甘草 桔梗 远志 酸枣仁
21
22 20 17 23
阳性对照：可用被检测的皂苷类成分对照品或对照药材。 薄层板：常用硅胶或氧化铝 展开剂：其配比可根据需要加以调整。
薄层色谱鉴别
皂苷：
极性较大，一般用分配层析效果好
展开剂极性要较大---亲水性强
适合的展开剂： CHCl3-CH3OH-H2O(10℃以下放置， 13:7:2下层), 水饱和C4H9OH，
化学性质
金属盐类的反应：
皂苷水溶液与铅盐、钡盐、铜盐等产生沉淀 酸性皂苷：与硫酸铵、硫酸铝或其他中性盐类生产沉淀 中性皂苷：与碱式醋酸铅或氢氧化钡等碱性盐类产生沉淀 可进行含皂苷类成分制剂的提取和粗分离
化学性质
显色反应：无水条件下
（１）醋酐－浓硫酸反应：Liebermann-Burchard反应 试剂：醋酐－浓硫酸（20：1） 样品＋醋酐1ml—→沿壁加入浓硫酸（20ml)—→ 两液层中间出现色环。 甾体皂苷：色环为蓝色或蓝绿色。阳性。 三萜皂苷：色环为红、粉红或紫色。阳性。 主要用于化学鉴别
总皂苷测定
重量法：根据皂苷类成分的溶解性进行提取、分
一般指供试品连续 两次干燥或炽灼后 的重量差异在 0.3mg以下的重 量
离及纯化后得到总皂苷，恒重、称量，并计算样
品中总皂苷含量。 一般少用，主要用于含皂苷的原料药质量控制。 如甘草浸膏中甘草酸含量测定
比色法
总皂苷测定
比色法：利用皂苷能与某些试剂反应后产生颜色，然后
泡沫反应鉴别：
中药粉末１g＋水10ml—△→滤液→强烈振摇 —→泡沫15min以上不退 阳性。 滤液 ＋0.1mol/L HCl 5ml—→强烈振摇—→…… ＋0.1mol/L NaOH 5ml－→强烈振摇—→… 若两管泡沫高度相同，则含三萜皂苷； 若碱管较酸管泡沫高数倍，则含甾体皂苷。
（当中药制剂中皂苷含量较高时，可参考此法鉴别。 但需注意排除干扰、空白对照。）
稀酸或酶水解后产生糖和非糖两部分的化 合物。一般为活性成分，如强心苷、皂苷等。 无色、无臭晶体。溶于水、乙醇，难溶于 亲脂性有机溶剂；苷元则相反。
R2O HO
人参皂苷
R1O O R3
皂苷 概述
*定义：皂苷大多数是指螺甾烷及其生源相似的甾族
组成
化合物的低聚糖苷或三萜类化合物的低聚糖 苷。 具有发泡、溶血等特性。 皂苷元：甾体皂苷元（27个C，合成激素的原料） 三萜皂苷元（30个C，生理活性成分） 糖：多分子糖或糖醛酸
内稳定,25～200ug符合比尔定律.
③浓硫酸－醋酐、硫酸－醋酐－冰醋酸、硫酸－冰醋酸试剂： 主用于检测甾体皂苷。如：人参总皂苷,60℃、25min, 520nm测定. 甘草次酸在529nm测定.
④芳香醛-硫酸或芳香醛-高氯酸 主用干检测三萜皂苷，甾体
皂苷也可用。需注意控制反应条件. ⑤其他试剂：如亚甲蓝与甘草酸结合物，640nm比色。 2,6-二丁基对甲酚与甘草酸呈色,575nm比色。
常用的显色剂
10％硫酸乙醇溶液：最常用的显色剂
配制方法：取10ml硫酸,用乙醇稀释至100ml
特点：与加热温度有关；腐蚀性强；其他成分 也可显色
薄层色谱
1. 薄层板的制备：吸附剂的选择 2. 供试液制备（掌握）:溶解性/对照物溶液的制备 3. 展开剂的选择 ：与被测物结构的极性大小、溶 解度以及吸附剂的活度密切相关 4. 点样 5. 展开 6. 晾干、显色 7. 斑点的检视、薄层鉴别的判断、或定量 8. 薄层板的记录
二、
性状
物理性质
多数为无色或乳白色无定形粉末，少数为晶体； 多数有苦、辛辣味，对粘膜有刺激性； 有吸湿性。
*溶解性 (掌握）
皂苷元：不溶于水，而溶于石油醚、C6H6 、 Et2O、CHCl3；酸性皂苷元可溶于碱水 皂苷:易溶于水，热甲醇、乙醇。
在含水丁醇/戊醇中溶解度较大。
不溶于Et2O、CHCl3等。
皂苷元的提取
中药
甲醇冷浸
一般步骤
酸水解-有机溶剂提取法
甲醇液
回收甲醇
浸膏
加酸,加热,过滤
水解液
有机溶剂提取
有机溶剂提取液
回收溶剂
甾体皂甙元
物理性质
*发泡性
皂苷能降低水溶液的表面张力，振摇后产生持久性泡沫。 *
1g中药粉末 2支试管
10ml水,煮沸10min,过滤 振摇
滤液
持久性泡沫
0.1M HCl 5ml, 3d中药水提液, 振摇1min 0.1M NaOH 5ml, 3d中药水提液, 振摇1min
复方丹参片中三七皂苷的含量测定—— 大孔树脂分离－比色法
复方丹参片05版药典：HPLC法测定丹参酮IIA，丹
参酚酸B
大孔树脂：
大孔树脂规格的选择：
1.大孔树脂性质与吸附物质的性质遵循相似性相吸的原则。 极性较大的化合物一般适合在中等极性以上性质的大孔树脂 上分离，极性小的化合物适合在非极性的大孔树脂上分离。
第三节
三帖皂苷类成分分析
本节要求
1.了解皂苷的理化性质 2.熟悉含皂苷类制剂供试液的提取纯化制备方法 3.掌握含皂苷类制剂的定量测定原理和方法
4.掌握含皂苷类制剂的定性鉴别的原理和方法
内容
一、概述 二、结构特征及理化性质
三、皂苷类成分的定性鉴别
四、皂苷类成分的定量分析 五、应用实例
苷类（glycosides）
皂苷类化合物的溶解性一般规律
溶解性 化合物类型 极性溶剂 水 皂苷元 － 甲醇/乙醇 ＋ 中等极性溶剂 正丁醇 丙酮/乙醚 — ± 低极性溶剂 氯仿等 ＋
皂苷
＋
＋
＋
—
－
含有皂苷类成分的中药制剂在进行成分分析时， 供试液制备常依据其溶解性特点选择提取溶剂及方法
供试液制备常用方法及溶剂选择（掌握）
类型 常用溶剂 方法 备注 固体制剂 皂 苷 水、 稀甲 （乙） 醇、 回流提取法 甲（乙）醇、乙酸 乙酯、正丁醇等 皂 苷 元 乙醚、 氯仿等亲脂 性有机溶剂 超声提取法 温浸法 ①先提取总皂苷， 总皂苷加 酸水解， 亲脂性有机溶剂萃 取②样品先行水解， 再用亲 脂性有机溶剂提取 液体制剂 可用水饱 和正丁醇 萃取 酒剂、 酊剂等含醇制剂需除 去大部分醇后再用有机溶 剂萃取 若皂苷元对酸不稳定， 需注 意
单糖链皂苷较显著；酸性皂苷中等；中性三萜皂苷最弱。
皂苷消化道不吸收，口服无毒，胆甾醇能解皂毒。
物理ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ质
熔点
皂苷无明显熔点(dec.)； 苷元熔点随羟基数目增加而升高(单-OH<208℃, 三-OH>240℃)； 甾体皂苷鉴定时不能单靠熔点（混熔点不降）。
旋光度
甾体皂苷及苷元均为左旋，且与双键有关。 未饱和的苷元或乙酰化物均较相应的饱和物为负（左旋）。
化学显色反应鉴别：
例 复方丹参片处方：丹参浸膏、三七、冰片。 其中三七皂苷的鉴别可用显色法 样品５片＋水洗涤去糖衣—→研细＋无水乙醇 10ml—→振荡提取→滤过→滤液５ml蒸干＋五氯 化锑氯仿 饱和液—→显紫蓝色 注：此类显色反应在中药制剂分析中，因组分多， 干扰大，应用较少。
薄层色谱鉴别
因皂苷类成分大多无明显的紫外吸收，故经薄 层分后，用适当的显色剂显色，是皂苷各组分定性鉴 别最常用的方法。
化学性质
（2）三氯醋酸反应：Rosen-Heimer反应
试剂：25％三氯醋酸氯仿溶液 样品液＋滤纸上—→滴三氯醋酸试剂—△—→观察 △→60℃观察斑点：→红色…→紫色斑点 甾体皂苷阳性 △→100℃观察斑点：→红色…→紫色斑点 三萜皂苷阳性
用于化学及色谱鉴别的显色剂
化学性质
（３）五氯化锑反应：Kahlenberg反应
CHCl3-CH3OH(7:3),C4H9OH-EtOAC-H2O(4:1:5), EtOAC-吡啶-H2O(3:1:3), CHCl3-C2H5OH(7:3)等。
薄层色谱鉴别
皂苷元：
极性较小，亲脂性强，吸附、分配薄层均可。
用硅胶为吸附剂，则要求展开剂的亲脂性强。
适合于皂苷元常用展开剂有：环已烷-EtOAC(1:1),
甾体皂甙: 碱液管的泡沫比酸液管持久时间长几倍 三萜皂甙: 两管形成泡沫持久相同
物理性质
*溶血性
皂苷有使红细胞破裂的作用，用溶血指数表示。
溶血指数：对同一动物来源的红细胞稀悬浮液， 在同一条件下造成完全溶血的最低浓度。
如薯蓣皂苷1:400000（毒性大）
溶血作用与分子结构的关系： 皂苷元决定有无溶血作用；糖决定溶血作用的强弱。
24 25 26
H H
19 18 9 10 4 8 30 13 14
HO HO H
27
H
H
28 29
5
HO HO 达马烷 20(S)原人参三醇
三萜类化合物是中药中一类主要有效成分，具有多方面的生 理活性。如人参皂苷可促进RNA蛋白质的生物合成调节机 体代谢，增强免疫功能；柴胡皂苷有抑制中枢神经系统和 明显的抗炎症作用，并能减低血浆中胆固醇和甘油三酯的 水平；七叶皂苷有明显的抗渗出、抗炎、抗瘀血的作用； 甘草皂苷有促进肾上腺皮质激素样作用，并能防治肝硬化、 抗动脉粥样硬化、抗溃疡等作用；还有一些苷皂类化合物 有抗肿瘤活性。
于可见光区进行比色测定。 显色后能在紫外光区产生吸收，用UV测定 专属性差，但反应灵敏、方法简便、易行 常用的显色试剂
测定总皂苷、总皂苷元的含量时，可用单体皂苷或皂苷
元作对照
常用的皂苷显色剂
①浓硫酸
②高氯酸
测定甾体皂苷的通用试剂。
甾体皂苷常显黄色(80～90℃反应30～60min）。 测定具△5的苷元,因△5不饱和结构与高氯酸在室 温下即可生成黄色。如：薯蓣皂苷元，10’、410nm、30’