牛副流感病毒3型(PIV-3)说明书
牛副流感病毒3型（PIV-3）酶联免疫分析（ELISA）
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定牛血清，细胞上清及相关液体样本中副流感病毒3型（PIV-3）含量。实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛副流感病毒3型（PIV-3）水平。用纯化的牛副流感病毒3型（PIV-3）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入副流感病毒3型（PIV-3），再与HRP标记的PIV-3抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的副流感病毒3型（PIV-3）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛副流感病毒3型（PIV-3）浓度。试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份
封板膜2片（48）2片（96）
密封袋1个1个
酶标包被板1×481×962-8℃保存
标准品：72ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存
标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存
酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存
样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100µl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50µl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100µl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50µl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50µl弃掉，再各取50µl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50µl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50µl，混匀后从第七、第八孔中分别取50µl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50µl，混匀后从第九第十孔中各取50µl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50µl，浓度分别为48ng/L，32ng/L，16ng/L，8ng/L，4ng/L）。2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品10µl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物请避光保存。7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9．本试剂不同批号组分不得混用。10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）
试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。2.批内与批见应分别小于9%和11%
检测范围：2ng/L-65ng/L
保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。2．有效期：6个月BovinePIV-3
FORRESEARCHUSEONLY
DrugNames
GenericName：BovinePIV-3ELISAKit.
Purpose
ThiskitallowsforthedeterminationofPIV-3concentrationsinBovine
serum,cellculturesupernatantandotherbiologicalfluids.
Principleoftheassay
ThekitassayBovinePIV-3levelinthesample，usePurifiedBovinePIV-3
antibodytocoatmicrotiterplatewells,makesolid-phaseantibody,thenadd
PIV-3towells,CombinedPIV-3antibodywhichWithHRPlabeled,become
antibody-antigen-enzyme-antibodycomplex,afterwashingCompletely,Add
TMBsubstratesolution,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRP
enzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacid
solutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyata
wavelengthof450nm.TheconcentrationofPIV-3inthesamplesisthen
determinedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothestandardcurve.MaterialsprovidedwiththekitMaterialsprovidedwiththekit48determinations96determinationsStorageUsermanual11Closureplatemembrane22
Sealedbags11Microelisastripplate112-8℃Standard：72ng/L0.5ml×1bottle0.5ml×1bottle2-8℃Standarddiluent1.5ml×1bottle1.5ml×1bottle2-8℃HRP-Conjugatereagent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃
Samplediluent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃ChromogenSolutionA3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃
ChromogenSolutionB3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃
StopSolution3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃
washsolution（20ml×20fold）×1bottle（20ml×30fold）×1bottle2-8℃
Specimenrequirements
1.serum-coagulationatroomtemperature10-20mins，centrifugation20-min
atthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitation
appeared,Centrifugalagain.
2.plasma-usesuitedEDTA,citrateorheparinizedplasmaasan
anticoagulant,mix10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof
2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,
Centrifugalagain.
3.Urine-collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof
2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,
Centrifugalagain.TheOperationofHydrothoraxandcerebrospinalfluid
Referencetoit.
4.cellculturesupernatant-detectsecretorycomponents,collectsuea
牛副流感病毒3型3种基因型多重RT-PCR检测方法的建立
牛副流感病毒3型3种基因型多重RT-PCR检测方法的建立
杨帆;石顺利;徐娜;雷宇;常塔娜;李平安;关平原
【摘 要】为建立检测牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type
3,BPIV3)3种基因型的多重RT-PCR方法,根据GenBank上发表的BPIV3 3种基因型病毒株的HN基因序列设计特异性引物,优化反应体系建立多重RT-PCR方法.结果显示,方法可同时扩增出BPIV3 A型150 bp、B型253 bp和C型342 bp的特异性片段,与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、牛支原体、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀性巴氏杆菌A型和B型均无交叉反应,A、B、C基因型BPIV3最低阳性质粒检测量分别为0.89×10 4、0.92×10 4和1.53×10 4拷贝/μL.本试验建立的多重RT-PCR检测方法操作方便、特异性强,应用于临床样本的检测,可快速检测BPIV3 3种基因型.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2018(045)001
【总页数】7页(P32-38)
【关键词】牛副流感病毒3型(BPIV3);基因型;多重RT-PCR;检测
【作 者】杨帆;石顺利;徐娜;雷宇;常塔娜;李平安;关平原
【作者单位】内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古自治区通辽市家畜繁育指导站,通辽市028000;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018
北方三省(区)牛副流感病毒3型的血清学调查
北方三省（区）牛副流感病毒３型的血清学调查
霍志云 。，童钦 ，胡嘉欣 ，王 炜 。 （１．华威特（北京）生物科技有限公司，北京１０００８５；２．中国农业科学院特产研究所，吉林长春１３０１２２）
摘 要：为了解我国北方三省（区）牛副流感病毒３型（ＢＰＩＶ３）的感染状况，从内蒙古、吉林、山西３个省
采集牛血清样品４８２份。采用病毒中和试验方法进行ＢＰＩＶ３抗体检测。结果显示，４８２份血清中ＢＰＩＶ３阳 性共４３９份，阳性率为９１．Ｏ８ 。吉林、内蒙、山西３省区中血清ＢＰＩＶ３阳性率分别９７．３５％、８４．３１％、 ９５．１５％。研究表明，中国北方三省（区）牛群中普遍存在ＢＰＩＶ３的感染。
关键词：牛副流感病毒３型；血清学；病毒中和试验
中图分类号：￥８５２．６５９．５；￥８５８．２３ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００７—５０３８（２０１２）０９—０１２４—０３
牛副流感病毒３型（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ
ｔｙｐｅ ３，ＢＰＩＶ３）属于单分子负链ＲＮＡ病毒目
（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｌｅｓ）副黏病毒科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ） 副黏病毒亚科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）呼吸道病毒属 （Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）的成员 ］，又称为运输热病毒，是引
起牛羊呼吸系统疾病的病毒之一ｌ２］。牛副流感病毒
在世界各国普遍存在，呈现不同的流行程度，人及其
他动物体内均发现ＢＰＩＶ３的抗体。检测方法主要
有病毒中和试验、酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光 及血凝抑制试验等，其中病毒中和试验是经典的鉴
定ＢＰＩＶ３的血清学检测方法，该方法敏感性强、特 异性高，具有很高的应用价值，许多新建立的方法必
需以该方法作为标准进行比较。鉴于３型牛副流感
给肉牛和奶牛产业造成的巨大经济损失，因此对该 病应引起足够重视。本试验采用病毒中和试验方法
对中国北方部分地区牛场的血清样品进行ＢＰＩＶ３ 的血清学调查，以掌握牛群中的ＢＰＩＶ３的分布情
牛副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测方法的建立
牛副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测方法的建立
李丽阳;李艳婷;余丽芸;侯喜林
【期刊名称】《中国预防兽医学报》
【年(卷),期】2016(038)002
【摘 要】为建立牛副流感病毒3型(BPIV3)双抗体夹心ELISA (DAS-ELISA)检测方法,本研究采用纯化的病毒分别免疫小鼠与家兔,制备鼠抗BPW3单克隆抗体(MAb)与兔抗BPIV3多克隆抗体(PAb).以纯化的兔抗BPIV3 PAb作为包被抗体,鼠抗BPW3 MAb作为检测抗体,采用棋盘滴定法确定DAS-ELISA的最适工作条件.结果显示,纯化的兔抗BPIV3 PAb与鼠抗BPIV3 MAb的效价分别为1:25 600和1:12
800,均可与BPIV3病毒蛋白特异性结合.建立的DAS-ELISA方法捕获抗体最佳包被浓度为10 μg/mL,37℃孵育1h;检测抗体最佳工作浓度为2.5 μg/mL,37℃孵育1h;TMB室温显色30 min.判定的临界值为0.451.本研究建立的DAS-ELISA方法与牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒均无交叉反应,特异性较强.检测下限为1@TCID50.批间和批内变异系数均小于10％,具有良好的重复性.利用该方法和RT-PCR对75份牛鼻拭子临床样品进行检测,两者符合率为94.6％.本研究建立的检测BPIV3的DAS-ELISA方法适用于兽医基层临床样品的大规模检测.
【总页数】5页(P132-136)
【作 者】李丽阳;李艳婷;余丽芸;侯喜林
【作者单位】黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学生命学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学生命学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.65
牛副流感3型病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛支原体多重PCR检测方法的建立
牛副流感3型病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛支原体多重PCR检测方法的建立
杨帆;徐娜;雷宇;郝瑞峰;李平安;关平原
【期刊名称】《中国预防兽医学报》
【年(卷),期】2018(40)5
【摘 要】To establish a detection method for simultaneously detecting
bovine parainfluenza virus 3 (BPIV3),infectious bovine rhinotracheitis virus
(IBRV),bovine viral diarrhea virus (BVDV) and Mycoplasma boris,the
multiplex PCR (mPCR) assay was developed with a set of specific primers
designed based on HN,gC,5'UTR,oppD/F genes of BPIV3,IBRV,BVDV and
M.bovis,respectively.Meanwhile,the primers ratio and annealing
temperature were optimized.The detection results showed that the mPCR
was able to simultaneously amplify the specific fragments of 510bp for
BPIV3,308bp for IBRV,215bp for BVDV and 78bp for M.bovis,which had no
any amplification for BRSV,PPRV,B.melitensis,B.abortus,bovine P.multocida
serotype A and bovine P.multocida serotype B.The detection sensitivity of
牛副流感病毒3型RT—PCR检测方法的建立
中圈珥才・２０１１・２２・科技 ・ １ ・
牛副流感病毒３型ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建立
刘晓乐Ｌｚ，张敏敏 ，陈颖钰，，胡长敏 ，陈焕春１＇２，郭爱珍ｌ。
（１．华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉４３００７０；２．华中农业大学动物医学院，武汉４３００７０；
３．华中农业大学动物科技学院，武汉４３００７０）
中图分类号：￥８５２．６５ ３文献标识码：Ａ文章编号：１００４—４２６４（２０１１）２２—０００１—０４
摘要：参照ＧｅｎＢａｎｋ中公布的牛副流感病毒３型（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ３，ＢＰＩＶ一３）全基因序列，针对
ＢＰＩＶ一３特异性ＮＰ蛋白保守基因设计一对引物，建立了ＢＰＩＶ一３的ＲＴ—ＰＣＲ诊断方法。其最佳扩增退火温度
为５８．１℃，引物浓度为１．０１ｘｍｏｌ／Ｌ。采用该方法扩增ＢＰＩＶ一３参考病毒，能扩增出４２５ｂｐ预期大小的特异性片
段，而扩增牛病毒性腹泻／黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、猪瘟病毒以及牛支原体、大肠
埃希氏菌、牛巴氏杆菌和沙门氏菌等常见病毒和细菌均呈阴性结果。对参考病毒进行梯度稀释检测，结果证
明该法检测ＢＰＩＶ一３的灵敏度可达１０，３ＴＣＩＤ５０／０．１ｍＬ
关键词：ＰＣＲ；检测方法；牛副流感病毒３型
牛副流感由牛副流感病毒３型（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎ．
ｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ３，ＢＰＩＶ一３）感染引起，可分为犊牛型和
成牛型。犊牛型又称犊牛地方性肺炎，是侵袭２周
至数月龄犊牛的一种接触性传染病，以发热、呼吸
困难，流浆液性、黏液性或脓性鼻漏和咳嗽为特征。
因该病多发生于运输后的牛，故该病毒又称运输热
病毒［１］。牛副流感病毒３型属于副黏病毒科副黏病 毒属成员，为单链负股有囊膜的ＲＮＡ病毒。
自从１９５９年Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ等在美国的牛体中分离
到ＢＰＩＶ一３以来，法国、前苏联、日本、丹麦、加拿大、
澳大利亚、巴拿马和意大利等国也相继分离出该病
副流感病毒
副流感病毒
副流感病毒是一种常见的易被忽略的呼吸道感染病原体，主要引起婴幼儿、儿童及免疫抑制人群严重的呼吸道感染。
在成人患者中，副流感病毒感染也可以导致一系列呼吸道疾病，包括上呼吸道感染、慢性疾病的急性加重、肺炎等，临床表现多样，病原学表现与其他常见呼吸道感染表现相似。此外，缺乏血清学的保护，也促使了副流感病毒的反复感染。
副流感病毒的生物学特性
副流感病毒（PIV）是一类具有多形性、有包膜的单股负链 RNA
病毒，属副黏病毒，分为 4 种亚型，PIV-1 和 PIV-3 属于呼吸道病毒属，而 PIV-2 和 PIV-4 属于腮腺炎病毒属。病毒直径 125-250 nm，包膜由脂质和糖蛋白组成。糖蛋白有两种：一种为血球凝集素 - 神经氨酶蛋白（NH），具有红细胞凝集活性和神经氨酶活性；另一种为融合蛋白（F 蛋白），具有促进细胞融合的作用和溶血特性。
发病机制
PIV 所致疾病的发病机制是由病毒复制和宿主免疫应答所介导。高水平的病毒复制可能会引起呼吸道上皮细胞的改变，在 PIV
感染患者中发现了呼吸道上皮细胞周转和黏液细胞增生与粘液分泌增加有关。像其他呼吸道病毒感染一样，宿主免疫反应——天然免疫、抗体反应、T 细胞反应也与其有关。
PIV 最初感染鼻腔假层状粘液气道上皮，而后通过口咽，进入气道。疾病的严重程度也与 PIV 的感染部位有关，轻度感染一般局限于上呼吸道，严重感染 PIV 一般入侵下呼吸道，导致较为强烈的免疫应答。而病毒血症仅仅在免疫功能不全患者中发生。
流行病学
随着时间的推移，四种亚型的发生率都有所不同，但三项回顾性研究都表明 PIV-3 感染是临床最易导致感染的亚型。四种亚型表现出明显的季节性，PIV-1 感染两年一次流行，奇数年的 9-12 月显著增加；而 PIV-3 的爆发出现在每年的 4-6 月。当 PIV-1 未流行的年份，PIV-3 表现活跃，除了春季流行外，在 10-12 月也有发生；与 PIV-3 相似的是，PIV-2 每年发生，但规模较小；PIV-4 较少被分离和检测，故很难得出流行病学数据。
牛副流感病毒3型NP基因原核表达及纯化
动物医学进展。２０１４，３５（２）：２０—２８ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
牛副流感病毒３型ＮＰ基因原核表达及纯化
曹 丽 ，高维凡 ，温永俊 （１．沈阳农业大学，辽宁沈阳１１０１６１；２．中国农业科学院特产研究所，吉林长春１３０１２２）
摘要：旨在对牛副流感病毒３型（ＢＰＩＶ３）ＮＰ基因进行分段克隆及原核表达，获得纯化蛋白。根据
ＧｅｎＢａｎｋ中公布的牛副流感病毒３型ＮＰ蛋白基因序列（ＪＱｏ６３ｏ６４）设计合成２对特异性引物，采用反转录一 聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）的方法，以牛胚肾细胞（ＭＤＢＫ）培养的ＢＰＩＶ３ ＮＭ０９株病毒液提取的ＲＮＡ为模
板，扩增获得２段ＮＰ基因序列（ＮＰ１、ＮＰ２），将２个片段克隆到ＰＧＥＸ一６Ｐ一１表达载体，构建具ＧＳＴ标签的 重组质粒ＰＧＥＸ—ＮＰ１、ＰＧＥＸ—ＮＰ２，将２种阳性重组质粒分别转化至大肠埃希菌ＢＬ２１（ＤＥ３），优化诱导表达
条件进行可溶性分析，并用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ进行鉴定，同时利用亲和层析法将重组蛋白纯化。
最终获得大小分别为４２．３ ｋｕ、３８．５ ｋｕ的重组蛋白，其中ＰＧＥＸ—ＮＰ１为包涵体表达，ＰＧＥＸ—ＮＰ２为可溶性 和包涵体２种表达形式，因ＰＧＥＸ—ＮＰ２蛋白疏水性强、等电点较高，其蛋白大小比理论值偏大；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
结果显示２种重组蛋白都具有良好的反应原性。 关键词：牛副流感病毒３型；ＮＰ基因；原核表达；蛋白纯化
中图分类号：￥８５２．６５９．５；Ｑ７８６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１４）０２—００２０—０９
牛副流感病毒３型（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ
３，ＢＰＩＶ３）是牛呼吸系统综合征最重要的呼吸道病
毒之一，也是引起犊牛肺炎的主要病原之一，同时是
一类重要的人兽共患病病原。自然感染ＢＰＩＶ３的
牛从无症状的感染到严重的呼吸道疾病，临床症状
牛副流感病毒 3 型检测技术规范
1
牛副流感病毒3型检测技术规范
1 范围
本文件规定了牛副流感3型的临床诊断、病原分离鉴定、RT-PCR、ELISA等诊断技术要求。 本文件适用于奶牛饲养场（户）、肉牛饲养场（户）和动物疫病检疫、诊疗单位对牛副流感病毒3型的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
牛副流感病毒3型 bovine parainfluenza virus type 3, BPIV3
属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒（见附录A中图A.1）。
4 临床诊断
流行病学
牛副流感一年四季均可发生，以秋冬、初春季多见。各种年龄牛均可感染。病牛和带毒牛是本病主要传染源，可经接触、呼吸道和子宫内感染，多与其它疾病混合感染。
临床症状
感染牛主要临床表现为高热（体温≥41 ℃）、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液、咳嗽、喘等呼吸道症状。病理剖解可见支气管肺炎，支气管黏膜肿胀、出血，管腔中有纤维素块，局部肺组织见灰色或红色肝样实变等。
5 实验室诊断
病毒分离
2
牛肾细胞系（MDBK细胞系）、棉签、马血清（HBS）、DMEM培养基、青霉素、链霉素、细胞培养板。
5.1.2 5.1.1试剂耗材
仪器
电子天平、研磨仪、台式冷冻离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、冰箱。
5.1.3 病料采集
5.1.3.1 鼻拭子
用无菌棉签刮取鼻道分泌物，然后放入3 mL～5 mL含1000 IU/mL青霉素和1000 μg/mL链霉素的DMEM培养基的冻存管中，编号，记录，于2 ℃～8 ℃条件下保存并尽快送往实验室。
牛副流感病毒3型NP单抗的制备及初步应用
牛副流感病毒3型NP单抗的制备及初步应用
吕闯;朱远茂;董秀梅;蔡红;于作;高欲燃;薛飞
【摘 要】To prepare monoclonal antibody (Mab) against nucleocapsid
protein (NP) of bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3), BALB/c mice
were immunized with purified recombinant NP (Rnp) expressed by E. Coli
and a hybridoma secreting Mab was screened from fusing the SP2/0 cells
with the spleen cells of the immunized BALB/c mice by indirect ELISA
coated with BPIV3. The titers of Mab in ascites were 2 x 106 and 1.28 x 105
as detected by Rnp and BPIV3 coated ELISA, respectively. The Mab was
specifically reacted with BPIV3 identified by indirect ELISA, western blot,
immunofluroescence assay. The specific tests indicated the Mab had no
reaction with infectious bovine rhinotracheitis virus and bovine viral
diarrhea virus. The BPIV3 was detected in experimentally infected animals
牛副流感病毒3型的分离鉴定及感染牛抗体消长规律的研究
２０１１，２７（１） 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ２３
文章编号：１００２—２６９４（２Ｏ１１）０１—００２３—０６
牛副流感病毒３型的分离鉴定
及感染牛抗体消长规律的研究
周玉龙 ，吴海涛 ，任亚超。，耿 静 ，王 密 ，谢金鑫 ，朴范泽
摘 要：目的 针对黑龙江省近几年夏季奶牛经常发生以高热、气喘和流涎等症状为主的疾病，给畜牧业造成严重经济 损失，本文旨在研究其病原因素及感染牛中和抗体的变化趋势。方法 本研究采集爆发高热病的牛群中患病牛乳汁和鼻液 进行病毒分离，经ＣＰＥ和扫描电镜观察、理化特性试验、血凝试验、病毒中和试验以及ＲＴ～ＰＣＲ方法鉴定分离的病毒，最后应 用病毒中和试验跟踪监测５头典型发病牛中和抗体１３个月。结果 从病料中分离到一种ＲＮＡ病毒，能够产生典型的细胞 融合样ＣＰＥ，有囊膜和栅栏样纤突，但是没有血凝性，能够与参考毒株牛副流感病毒３型抗血清发生病毒中和反应，ＨＮ基因 的序列分析发现与牛副流感病毒３型ＨＮ基因同源性最高达９９．６％。发病牛中和抗体跟踪监测结果显示康复期抗体效价是 急性期的４倍以上，同时可见感染牛的中和抗体效价在６—８个月内能够维持在１：２ ～１：２ ，然后开始下降，最后维持在１ ：２。～ｌ：２。之间。结论 综上所述确定分离毒株是牛副流感病毒３型，进一步证实该病毒是引起本牛群高热病的病因之一， 而且感染后中和抗体效价至少在６个月以内能够维持在较高的水平。 关键词：牛副流感病毒３型；分离鉴定；中和抗体 中图分类号：Ｑ９３文献标识码：Ａ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ０ｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３
ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｃｌｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｄａｉｒｙ ｃａｔｔｌｅ
ＺＨＯＵ Ｙｕ—ｌｏｎｇ，ＷＵ Ｈａｉ—ｔａｏ，ＲＥＮ Ｙａ—ｃｈａｏ，ＧＥＮＧ ｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｍｉ，ＸＩＥ Ｊｉｎ—ｘｉｎ，ＰＩＡＯ Ｆａｎ—ｚｅ