麦氏比浊法确定细菌浓度的原理和操作步骤
麦氏比浊法确定细菌浓度的原理和操作步骤
以麦氏比浊法确定细菌浓度的原理和操作步骤为标题
一、原理
麦氏比浊法是一种常用的确定细菌浓度的方法，其原理是利用细菌悬浮液对光的散射作用，通过测量光的透射度来确定细菌的浓度。细菌悬浮液越浓，对光的散射就越强，透射度就越低。
二、操作步骤
1. 准备工作
a. 准备所需材料：细菌悬浮液、比色皿、比色计、移液器、离心机等。
b. 将比色皿用去离子水清洗干净，确保无杂质。
c. 打开比色计，进行预热，使其达到工作温度。
2. 准备细菌悬浮液
a. 选择需要测定浓度的细菌液体培养物。
b. 用移液器取适量的细菌液体培养物，加入一定量的去离子水，制备一系列不同浓度的细菌悬浮液。
c. 将细菌悬浮液进行均匀摇匀，确保细菌分布均匀。
3. 开始测定
a. 将比色皿放入比色计中，调整为透射模式。
b. 在比色皿中加入一定量的去离子水作为空白对照组。
c. 将细菌悬浮液加入另一个比色皿中，确保液面平整，避免气泡产生。
d. 将比色皿放入比色计，调整为透射模式，记录下透射度数值。
e. 重复上述步骤，分别测定不同浓度的细菌悬浮液的透射度。
4. 统计数据
a. 将测得的透射度数值记录下来，建立细菌浓度与透射度之间的对应关系。
b. 绘制透射度-浓度曲线图，根据图像确定未知浓度细菌悬浮液的浓度。
5. 计算浓度
a. 根据绘制的透射度-浓度曲线图，找到未知浓度细菌悬浮液对应的透射度数值。
b. 根据透射度和对应关系，计算出未知浓度细菌悬浮液的浓度。
6. 结果分析
a. 根据计算结果，得到未知浓度细菌悬浮液的浓度。
b. 将测定结果与实际浓度进行比较，评估测定的准确性和可靠性。
总结：
通过麦氏比浊法可以快速、简便地测定细菌悬浮液的浓度。其原理是利用细菌悬浮液对光的散射作用，通过测量光的透射度来确定细
菌的浓度。操作步骤包括准备工作、准备细菌悬浮液、开始测定、统计数据、计算浓度和结果分析。通过该方法可以得到准确的细菌浓度，为后续的实验和研究提供可靠的数据支持。
抑菌试验
抑菌试验：用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。通过抑菌实验,可以测定一个药物的最低抑菌浓度,用以评价该药物的抑菌性能,这是抗菌药物的最基本的 药效学数据。主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。 1.常量肉汤稀释法 抗菌药物贮存液制备 1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如 1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg 抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。 药敏试验用抗菌药物浓度范围 1.1. 2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 培养基 1.1.3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH 肉汤。 接种物的制备 1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 注：在临床微生物学检验中，麦氏比浊法常用于细菌鉴定、药敏实验前配置菌液时大致判断菌液浓度的一种方法，通常认为，如将配菌液浓度配成0.5麦氏比浊管时，
麦氏比浊法确定细菌浓度的原理和操作步骤
麦氏比浊法确定细菌浓度的原理和操作步骤 以麦氏比浊法确定细菌浓度的原理和操作步骤为标题 一、原理 麦氏比浊法是一种常用的确定细菌浓度的方法，其原理是利用细菌悬浮液对光的散射作用，通过测量光的透射度来确定细菌的浓度。细菌悬浮液越浓，对光的散射就越强，透射度就越低。 二、操作步骤 1. 准备工作 a. 准备所需材料：细菌悬浮液、比色皿、比色计、移液器、离心机等。 b. 将比色皿用去离子水清洗干净，确保无杂质。 c. 打开比色计，进行预热，使其达到工作温度。 2. 准备细菌悬浮液 a. 选择需要测定浓度的细菌液体培养物。 b. 用移液器取适量的细菌液体培养物，加入一定量的去离子水，制备一系列不同浓度的细菌悬浮液。 c. 将细菌悬浮液进行均匀摇匀，确保细菌分布均匀。 3. 开始测定 a. 将比色皿放入比色计中，调整为透射模式。 b. 在比色皿中加入一定量的去离子水作为空白对照组。
c. 将细菌悬浮液加入另一个比色皿中，确保液面平整，避免气泡产生。 d. 将比色皿放入比色计，调整为透射模式，记录下透射度数值。 e. 重复上述步骤，分别测定不同浓度的细菌悬浮液的透射度。 4. 统计数据 a. 将测得的透射度数值记录下来，建立细菌浓度与透射度之间的对应关系。 b. 绘制透射度-浓度曲线图，根据图像确定未知浓度细菌悬浮液的浓度。 5. 计算浓度 a. 根据绘制的透射度-浓度曲线图，找到未知浓度细菌悬浮液对应的透射度数值。 b. 根据透射度和对应关系，计算出未知浓度细菌悬浮液的浓度。 6. 结果分析 a. 根据计算结果，得到未知浓度细菌悬浮液的浓度。 b. 将测定结果与实际浓度进行比较，评估测定的准确性和可靠性。 总结： 通过麦氏比浊法可以快速、简便地测定细菌悬浮液的浓度。其原理是利用细菌悬浮液对光的散射作用，通过测量光的透射度来确定细
细菌分离鉴定
细菌分离鉴定 第一篇：细菌分离鉴定 细菌分离鉴定 目的要求： 熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法，细菌分离鉴定。 实验内容： 一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的分离与鉴定 (一)标本采集 1.脓拭子：用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许，置入无菌空试管内，送检。 2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用无菌棉签挑取脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。 3.咽拭子：嘱病人把口张大，用压舌板压住舌根，用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物，置入无菌空试管内，送检。 4.血标本：疑为败血症患者，在严格无菌操作下，静脉采血，床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内，立即摇匀后送培养。 5.脑脊液：对疑似流脑患者，作腰椎穿刺取脑脊液，立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。 6.尿道、阴-道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时导尿管应进入尿道1cm～2cm，如为刚排尿，应等待1h左右;女性则可以从宫颈口取分泌物，当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转取出，取材应立即送检，不可放置冰箱。 (二)分离鉴定程序 待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。常见的致病性球菌检查程序如下。 直接涂片、革兰染色、镜检(形态、排列、染色性) 脓、痰、咽拭子 分泌物、脑脊液观察菌落性状、溶血性、色素
血琼脂平板→ 涂片、染色、镜检 ↑ 挑取可疑菌落生化反应 血液、穿刺液→肉汤培养基纯分离致病性测定 ↓ 药敏试验 如培养液混浊时可涂片、染色、镜检 (三)常见临床标本的检查方法 1．脓拭子 在脓汁中除了球菌外，也有杆菌存在，例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等，革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等，此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。 材料 (1)标本：脓拭子 (2)培养基：血琼脂平板 (3)兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片 方法脓汁→ 革兰染色→ 镜检 ↓ ↑ 血琼脂平板→观察菌落形态及溶血情况 ↓ 致病力试验 (1)将脓拭子作革兰染色，镜检(先作培养再涂片以免污染)，鉴定材料《细菌分离鉴定》。标本放置4℃冰箱保存，待报告发出后再丢弃。 (2)将脓汁涂布于血琼脂平板上，再以灭菌接种环作划线分离。置培养37℃培养18h～24h。 (3)经培养后据菌落特点及涂片检查结果进行初步识别，根据需要再作进一步鉴定。若菌落较大、溶血透明、产生金黄色色素、涂片为革兰阳性球菌并成堆排列时可能系葡萄球菌，应确定其为何种葡萄球菌;必要时再作血浆凝固酶试验及甘露醇发酵试验，确定其致病力。 2.咽拭子 咽喉中存在的细菌较多，可以有厌氧及需氧性链球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四联球菌、脑膜炎球菌、卡他球菌、喉杆菌、结核杆菌枯
测定细菌数量的方法
测定细菌数量的方法 1、计数器测定法： 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。 2、电子计数器计数法: 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。 3、活细胞计数法 常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。 广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。 4、比浊法 比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。 此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。 5、测定细胞重量法 此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。 此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。 6、测定细胞总氮量或总碳量 氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。 7、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU） 这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例，简单介绍其操作： （1）.取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。 （2）.在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管 （3）.于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml. 一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特
麦氏比浊管
麦氏比浊管 【产品名称】通用名：麦氏比浊管英文名：McFarland Standard 【包装规格】5支/盒 【预期用途】麦氏比浊管的一系列不同的标准，用于评价菌液的浓度。对于微生物学方法的标准化是非常必要的。菌液浊度的判定依据原始麦氏比浊管的标号 【检验原理】菌液浓度是通过与已知同一直径安瓿瓶中菌悬液浊度比较得到的。 【主要组成成分】6支直径17.5mm的麦氏标准管（0.5，1，2，3，4，5）标准成分：BaSO4 BaSO4 0.5号标准管 2.40 10-5 mol/l 3号标准管 1.44 10-4mol/l 1号标准管 4.80 10-5 mol/l 4号标准管 1.92 10-4mol/l 2号标准管 9.60 10-5 mol/l 5号标准管 2.40 10-4mol/l 【储存条件及有效期】 ●安瓿瓶必须于2-30℃避光保存，有效期为6个月 ●不要打开麦氏标准安瓿：标准悬液实在原始、密封的安瓿内使用 【检验方法】 ●取出选择的比浊管 ●用同一直径安瓿内制备菌悬液，混匀。 ●充分混匀标准比浊管。 ●立即在黑背景下比较出2个比浊管的浊度。 ●如果必要，调整菌液浊度，混匀标准比浊管后重新比浊。 【检验结果的解释】等效 标准比浊管细菌浓度（1）×106/ml 650nm 理论光密度（2） 0.5 150 0.125 1 300 0.25 2 600 0.50 3 900 0.75 4 1200 1.00 5 1500 1.25
1.细菌浓度取决于微生物大小。效量代表细菌的平均有效值。 对于大分子量的酵母菌，细菌的数量大约除以30。 2.比浊管数值相当于菌液的光密度。因为细菌大小和颗粒的不同，光的衍射不同，因此BaSO4没有同样的光密度。 【检验方法的局限性】不要用这些安瓿瓶管检测DENSIMAT 【注意事项】 ●仅用于体外诊断 ●仅用于专业人员 ●使用前，检查安瓿是否完整
微生物学实验
细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。 本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。 一显微镜直接计数法 （一）目的要求 1．明确血细胞计数板计数的原理。 2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 （二）基本原理 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。 用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图l5-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(图15—2)；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。 图15—1 血细胞计数板构造（一）图15—2 血细胞计数板构造（二） A. 正面图； B.纵切面图；放大后的方格网，中间大方格为计数室 1.血细胞计数板； 2. 盖玻片； 3.计数室 计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。 设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则 1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个） 同理，如果是16个中方格的计数板， 1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A·B（个） （三）器材 1．菌种酿酒酵母 2．仪器或其他用具血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。 （四）操作步骤 l．菌悬液制备 以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。
几种MIC的测定方法
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）的方法 1浊度法 1.1常量肉汤稀释法（试管） 1.1.1.抗菌药物贮存液制备 将抗菌肽稀释到无菌水中，制成1024μg/ml的原液，（也可以用0.22um滤膜进行过滤，但要去掉前面5 ml的过滤抗菌肽溶液）。抗菌药物贮存液浓度按照不同梯度稀释。 1.1. 2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.1.3. 培养基推荐使用LB肉汤培养基，pH7.0~7.4。指示菌为大肠杆菌或沙门氏菌。1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的LB肉汤中，35℃孵育2-6 h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或LB肉汤培养基校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，推荐直接取培养18~24 h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用LB肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6ml LB肉汤外，其余每管加入LB肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1024μg/ml）0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。（注：在稀释的过程中，每次吸取1ml到下一管中后，要换掉枪头，后面的方法相同） 1.1.6.孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置37℃摇床培养16~20h。 1.1.7.结果判断与解释在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC 值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。或者用分光光度计测定OD600，与未接菌的比对，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。 1.2.微量肉汤稀释法（酶标板） 1.2.1.抗菌药物和培养基制备同常量肉汤稀释法。 1.2.2.MIC板制备无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，药物浓度分别为1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/ml。第12孔不加药作为生长对照，如果当时不使用，则冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。 1.2.3.接种物制备将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经LB肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加90μl，密封后置37℃摇床孵育16~20h判断结果。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、 0.125μg/ml。 1.2.4.结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC（用酶标仪测得OD600）。当阳性对照孔（即不含抗菌肽）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)方法
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）方法 1.1.常量肉汤稀释法 1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为18 2.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.1.3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM 肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。 1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白
（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH 肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml）0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。 1.1.6.孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。 1.1.7.结果判断与解释在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养
MIC的测定(微量二倍稀释法)
微量肉汤稀释法测MIC 一、试验原理目的 细菌在96孔板MH培养基中生长，过段时间由于量大会产生白色沉淀,很容易区别有无菌落生长，将抑菌剂依次对倍稀释，加入菌悬液培养一段时间后，无沉淀的最后一个空即为MIC浓度。本试验微量样品即可测出最小抑菌浓度，且96孔板占地少，一板可做96个试验梯度，适用于大批量的检测试验，节约时间. 二、试验器材、化学试剂及菌种 96孔板、试管、5uL-50uL 微量移液器、100uL—1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。 菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌 三、试验准备 1、培养基的配置 MH培养基42g，蒸馏水1000ml.灭菌后待用，若一次用不完可放入4℃冰箱中放置。使用前拿出放置室温即可. 2、工器具的灭菌 将配置好的MH培养基、PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、离心管放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min.试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。96孔板在超洁净工作台上紫外杀菌30min以上. 2、抑菌剂的配置 抗菌药物的溶解与稀释，一般情况下，水溶性抗菌药物采用灭菌蒸馏水溶解,而对于不溶或者难溶于水的抗菌药物要根据其特性,采用甲醇，缓冲液,NaOH溶液，DMSO溶液等,尽量将抗菌药物溶解后用蒸馏水或者缓冲液稀释后,作为抗菌药原液。 3.、菌悬液的配置 从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中,再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀
菌液浓度测定方法
菌液浓度测定实验 原理：一定浓度的细菌悬浮液有一定的稍光度, 浓度与消光度呈正比, 且在一定的范围内呈良好的线性关系。以分光光度计为检测工具, 测定未知浓度菌悬液的消光度值,由事先作用的标准直线, 即可求出该菌悬液的浓度。 实验内容 1、材料与方法 1.1 菌种 大肠杆菌 1.2 制备标准菌的悬浮液 培养基的组成： 牛肉膏0.3g 蛋白胨1g 氯化钠0.5g 琼脂2g 蒸馏水100mL pH 7.0～7.2 灭菌121℃，22min 1.3 仪器设备 722型可见分光光度计、万分之一电子分析天平、801型离心沉淀机 1.4 最大吸收峰值的确定 取10ml菌液调节PH=5，抑制菌体的继续生长，利用分光光度计在500～700（nm）波长范围扫描，选出最大吸收峰。作出所测波长与吸光度的关系曲线。选出最大吸收波长。
大肠杆菌代谢过程的u—pH关系图 2、标准曲线的绘制 2.1 重量法测菌浓 将一离心管置于干燥烘箱中烘干至恒重，自然冷却后用分析天平称其质量m 1 。准确称其10ml菌液，调节PH=3，放入离心机中进行离心分离（3500rmp、10min），倾去上清液，将菌体放进干燥箱 中烘干至恒重，自然冷却后取出称重m 2 ，利用差量法求得菌液中菌 体的真实浓度。(m 1- m 2 = m) 2.2 测定系列标样的吸光度 取与重量法同一菌液，配制2、5、10、20、50倍的系列标样，以1cm比色皿比浊，波长600nm，以蒸馏水为参比，分别测定其吸光度A。记录实验数据： 表1 菌液浓度与吸光度的关系 稀释倍数菌液浓度/g/L 菌液的吸光度 1 2 5 10 20 50
麦氏比浊仪提高细菌悬液计数准确性研究
麦氏比浊仪提高细菌悬液计数准确性研究 摘要：目的：为了解决灵敏度实验、促生长实验、无菌检查、培养基适用性检 查及控制菌检查等实验过程中利用肉眼观察加入的菌液浓度所造成的误差。方法：采用麦氏比浊法和平板计数的方法进行菌液浓度的比对。结果：将菌悬液的麦氏 浊度控制在0.17~0.34McF时，能够通过菌液稀释，控制菌液浓度在100cfu/ml左右。结论：该法使得在洁净区实验中能够简单快捷的判断细菌菌液浓度。 关键词：麦氏比浊法；细菌；菌悬液浓度 Study on Improving the Accuracy of Bacterial Suspension Counting by McFarland’s Turbidimeter WU Min, MO Jingyan, SONG Renjie Quality Inspection, Jiangsu Zilong Pharmaceutical Co., Ltd of Yangtze River Pharmaceutical Group, Changzhou, 213000 ABSTRACT Objective: To resolve the deviation caused by visual inspection of the bacterial suspension concentration in the process of sensitivity test, growth promotion test, aseptic test, suitability test of culture medium and bacteria control test. Methods: The bacterial suspension concentration was c ompared by means of McFarland’s turbidimetry and plate counting. Results：When the turbidity of microbial suspension is controlled at 0.17-0.34McF, the concentration of microbial suspension can be controlled at about 100cfu/ml by diluting the microbial suspension. Conclusion: This method makes it easy and fast to judge the concentration of bacterial suspension in the experiment of cleaning area. KEY WORDS McFarland’s turbidimetry; bacterial; bacterial suspension concentration 在2015年版《中国药典》中“1100生物检查法”中的灵敏度实验、促生长实验、 无菌检查、培养基适用性检查及控制菌检查等均有“加菌量不大于100cfu/ml”的要求。经调查行业了解，在实验过程中实验人员仅凭实验经验确定菌液稀释级别， 不能很好的掌控加菌量，为使得实验人员在实验过程中对菌液浓度有个初步定量，故做此研究。 微生物生长中细胞数量的测定主要有直接计数法（测定时需用细菌计数器或血球 计数板，本法仅适于单细胞的微生物类群）、比浊法、稀释平板计数法、液体稀 释培养计数法、浓缩法[1]。 麦氏比浊法（McFarland）是一种简单而经典的细菌浓度计算方法，其核心原理是细菌溶于水中会造成与浓度相关的混浊度。麦氏比浊仪以McF（McFarland）麦氏浊度为单位，采用麦氏比浊法，测量微生物悬浮液中微生物菌体的光密度，并定 量表征微生物菌体含量，直接显示麦氏单位浊度值，根据国际通用麦氏单位浊度 值与细菌数的关系换算出细菌浓度[2]。 据文献报道，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌悬液的麦氏浊度与 其吸光度存在良好的相关性；菌液吸光度与菌液浓度也存在良好的线性关系，利 用这两个相关性，可以得到不同菌液浓度下的麦氏浊度值，也可以推测出具有不 同麦氏浊度的菌液的菌液浓度[3]。 1材料 1.1仪器 1384-A2型生物安全柜（Thermo Scientific）；LRH-150型生化培养箱（上海索谱仪器有限公司）；XG1.G型脉动真空灭菌柜（山东新华医疗器械股份有限公司）；
抗菌药物最小抑菌浓度的测定
抗菌药物最小抑菌浓度的测定 一、概念：最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）：在特定环 境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用 于定量测定体外抗菌活性。 二、实验目的：通过采用常量稀释法, 检测几种抗菌药物对----菌株的最小抑菌浓度( MIC) , 对临床诊断用药有指导作用。 三、仪器和试剂： MH液体培养基分光光度计 MH琼脂蒸馏水 0.1mol磷酸缓冲液（PH6.0）无菌生理盐水无菌滤膜0.22 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 四、检验方法：液体稀释法、琼脂稀释法、E试验（E test）液体稀释法操作步骤： 抗菌药物原液配置无菌试管 0.5麦氏标准比浊管微量加样器吸头接种环无菌平 板无菌针筒抗菌药物 MH液体试管中抗菌药物梯度稀释待测菌和质控标准菌观察结果 1..抗菌药物原液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。 溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。 所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为 1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析 天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀 释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表1。配制好的抗菌药物贮存液应贮 存于-20℃环境，并注意抗菌药物的保存期限。 表1 稀释法中常用的抗菌药物容积稀释法 药物浓度取药液量加稀释剂量药物稀释浓琼脂或肉汤中最后含药浓度（ug/ml）（ml）（ml）度（ug/ml）（ug/ml）药物：琼脂（或肉汤）=1：9 5120 1 0 5120 512 5120 1 1 2560 256 5120 1 3 1280 128 1280 1 1 640 64 1280 1 3 320 32 1280 1 7 160 16 160 1 1 80 8 160 1 3 40 4 160 1 7 20 2 20 1 1 10 1 20 1 3 5 0.5 20 1 7 2.5 0.25 2.5 1 1 1.25 0.125 2.5 1 3 0.6 0.06 2.5 1 7 0.3 0.03
抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)的测定
抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）的测定 实验目的：通过采用常量稀释法, 检测几种抗菌药物对A8、A9、D5菌株的最小抑菌浓度( MIC) , 对临床诊断用药有指导作用。 【试剂与器材】 1.试剂 ⑴主要仪器设备： 三角烧瓶、高压灭菌器、内径90mm平皿、试管、0.5麦氏标准比浊管、天平、接种环、吸头、微量加样器、胶布、分光光度计、酒精灯等。 ⑵试验药品： 培养基基础粉（酸水解酪蛋白/酸水解酪素、牛肉浸膏粉、淀粉、琼脂）、纯水（蒸馏水）、电炉、牛皮纸、线、抗菌药物、无菌生理盐水、蒸馏水、pH6.0 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液。 ⑶试验菌株： A8、A9、D5菌株、标准株大肠杆菌。 在肉汤或琼脂中将抗菌药物进行一系列（对倍）稀释后定量接种待检菌，35℃孵育一定时间后，观察抑制待检菌肉眼可见生长的最低药物浓度，即为该药物对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）。 【试验方法】 肉汤稀释法试管稀释法（常量稀释法） 【原理】 用MH肉汤将抗菌药物作不同浓度的稀释，再接种待检菌，定量测定抗菌药物抑制或杀灭待检菌的最低抑菌浓度（MIC）。 【操作步骤】 ①抗菌药物原液制备：配制抗菌药物原液的溶剂和稀释剂大多采用蒸馏水、pH6.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液等。抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。 公式为：质量（mg）=溶剂（ml）x浓度（μg/mg）/分析效能（μg/ mg） 表1 稀释法中常用的抗菌药物容积稀释法
②药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 表2常用药敏纸片 试验方法： 1.用记号笔在培养基上标记待检菌名。 2.在已分纯的待检菌培养基上取4个～5个菌落，接种在4ml～5ml水解酪蛋白（MH）肉汤中，置35℃培养4h～6h，链球菌、嗜血杆菌等需用加血的肉汤增菌并孵育过夜。增菌后的菌液用3ml～5ml无菌生理盐水或肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准。 做常规药敏试验也可采用直接菌悬液法。即直接取过夜培养的待检菌菌落数个，置于生理盐水或肉汤中制备接种菌液，校正浓度至0.5麦氏比浊标准。
纸片法抗菌药物敏感实验操作标准
纸片法抗菌药物敏感实验操作标准 4.3 标准比浊管 用硫酸钡比浊管（0.5麦氏比浊标准），标定接种菌液浓度。比浊管制备方法如下：（1）0.048mol/L BaCl2，（1.175% w/v BaCl2·2H2O）0.5ml，加到99.5ml的0.18 mol/L（0.36N）H2SO4（1％v/v）溶液中，制成比浊管；（2）用光径为1cm的分光光度计测定光吸收来标定比浊管。 0.5麦氏标准比浊管在625nm波长的吸收光度应为0.08-0.1；（3）选管径与制备菌液试管相同的螺口试管，每管分装4－6ml；（4）将试管帽拧紧，放室温暗处保存；（5）用前，将比浊管在旋转振荡器上混匀。如出现大颗粒，应更换；（6）每个月更换比浊管或复检比浊管的浊度。 5 操作步骤 5.1 制备接种菌液 5.1.1 增菌法步骤如下：（1）选琼脂平板上形态相同的菌落至少4－5个，用接种环挑其顶部，移至4－5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中；（2）置35℃培养至菌液浓度达到或超过比浊管浓度（一般需2－6小时），浓度约1－2×108CFU/ml；（3）用生理盐水或肉汤校正菌液浓度，与比浊管相同。可用光电比浊。目测比浊须在适当光照下以黑色线条为反衬。 5.1.2 直接菌悬液法步骤如下：（1）做常规药敏试验，可直接用过夜培养的菌落（必须用无选择性培养基平板，如普通琼脂培养基）在盐水或肉汤中制备接种菌液。菌液浓度调至0.5麦氏管；(2)此法适用于在肉汤培养基中生长不好的细菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和链球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐药试验；（3）当用此法做复方磺胺药的试验时，从平板上直接挑菌落时会携带相当量的拮抗剂，造成敏感菌株的抑菌环内出现轻微的生长菌膜。 5.2 接种平板步骤如下：（1）校正的菌液须在15分钟内使用。用一无菌棉试子蘸取菌液并在上端管壁旋转挤压几次，去掉过多的菌液；（2）用试子涂布整个琼脂平板表面，反复涂布几次，每次将平皿旋转60度，保证涂布均匀。（3）将平皿盖打开3－5分钟，使培养基表面的水份吸收掉。然后贴药敏纸片；（4）注意：避免用过浓的菌液，禁用未经稀释菌或其他不标准菌液接种平板。 5.3 贴纸片（1）接种平板后，贴上药敏纸片。用镊子或针尖压一下纸片使其与培养基表面贴牢。纸片要贴得均匀，纸片与纸片中心距离不得小于24mm。原则上，直径150mm得平板贴12张纸片，直径100mm平板贴5张纸片。纸片贴后不应再移动，因为有些药物会立即扩散；（2）贴上纸片15分钟内，须把平板倒放在35℃恒温箱中。因为抑菌环解释标准是在普通环境中标定的，所以除嗜血杆菌和淋病奈瑟氏菌外，平板不可放在高CO2的环境中。CO2与某些因素作用可使抑菌环增大。 5.4 读取结果（1）经16－18小时培养后，观察结果。菌液浓度适合且涂得好，抑菌环规则，细菌呈融合生长。如果出现单个菌落，说明接种量小，需重做试验，测量抑菌环直径须包含纸片直径：手持平皿从背面目测检查每块平板，借反射光（黑色无放光背景），用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌环直径，单位为毫米。培养基中如果加了血液，须打开平皿盖，借反射光，从正面量抑菌环。如果是葡萄球菌或肠球菌，须培养24小时后，经投射光检查苯唑青霉素和万古霉素的抑菌环内有无耐药菌株的生长。抑菌环内有任何生长的表现都表明是耐药菌株。（2）肉眼见不到细菌明显生长的区域为抑菌环边缘，有很难辨认的细小菌落不算。如抑菌环内有大量细菌生长，须再移植出来，重新鉴定，重新做药敏试验。变形菌在某些抗菌药物纸片周围可弥漫生长到抑菌的区域内，当抑菌环边缘清楚，弥漫生长不算。甲氧苄氨嘧啶和磺胺药的拮抗剂会支持细菌生长，因而测这类药时可忽略轻微生长（80％以
实验七++细菌的药敏试验与耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测 【目的和要求】 1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。 2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。 3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。 【试剂与器材】 1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。 2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。 3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。 4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下： 0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml 0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml 将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。 5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。 【实验容】 一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验 1．原理 将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。 K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。 2．方法 （1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。 （2）试验菌液准备：将待测细菌接种于普通琼脂平板，35℃培养16~18h，然后从平板上挑取数个菌落，于2~3ml无菌生理盐水中混匀后与0.5麦氏比浊管比浊，调整浊度与标准比浊管相同，其细菌浓度相当于108 CFU/ml。 （3）细菌接种：用无菌棉拭蘸取已调试的菌液，在管壁上稍加挤压之后，手持棉拭于M-H琼脂表面均匀划线接种，共划3次，每次将平板旋转60°角，最后沿平板缘涂抹一周，盖上平板，室温下置3~5min待琼脂表面的水分稍干。